Methodenartikel

Lichte voorkeur Assay om Aangeboren en Circadiaanse Gereglementeerde Photobehavior studeren in

12.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50237

⸱

20 april 2013

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Institute of Cell and Developmental Biology, University of Fribourg

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een licht-donker voorkeur test voor Drosophila larven. Deze test geeft informatie over aangeboren en circadiane regulatie van licht sensing en verwerken photobehavior.

Samenvatting

Licht fungeert als milieu-signaal naar het gedrag van dieren op verschillende niveaus te controleren. De Drosophila larvale zenuwstelsel wordt gebruikt als een uniek model om fundamentele vragen over hoe licht informatie wordt verwerkt en gedeeld tussen snelle en circadiane gedrag te beantwoorden. Drosophila larven weer een stereotype vermijdingsgedrag bij blootstelling aan licht. Aan het licht afhankelijke gedrag vergelijkbaar eenvoudige licht-donker voorkeur tests kunnen worden toegepast onderzoeken. In gewervelde dieren en geleedpotigen de zenuwbanen betrokken bij het voelen en verwerken van visuele input gedeeltelijk overlappen met die verwerking fotische circadiane informatie. De interessante vraag hoe het lichtgevoelige systeem en circadiane systeem communiceren gedrag outputs gecoördineerd blijven grotendeels onontdekt. ​​Drosophila is een botsend biologisch model om deze problemen te benaderen, door een klein aantal neuronen in de hersenen en de beschikbaarheid van genetische hulpmiddelen voor neuronale MANIPULatie. De gepresenteerde licht-donker voorkeur test laat het onderzoek van een reeks visuele gedragingen waaronder circadiane controle phototaxis.

Inleiding

Hier beschrijven we een gedrags test op basis van de larvale voorkeur voor donker (of licht). Larven reageren met een sterke en stereotiep photonegative respons tijdens foerageren fasen (L1 tot begin L3) 1. De test is bedoeld om de photophobic gedrag van de larve beoordelen en vergelijkt de lichte of donkere voorkeur een groep larven vrij bewegen in een petrischaal bedekt met agar. Dit gedrag assay geeft niet alleen informatie over de gevoeligheid, integratie en temporele plasticiteit van het visuele systeem, verschaft verder aanwijzingen hoe lichtgevoeligheid en wordt gecontroleerd door het circadiane systeem.

De Drosophila larvale oog (ook wel Bowlig Organ; BO), is het belangrijkste orgaan voor lichte waarneming. Elk oog is samengesteld uit 12 fotoreceptoren (PR), acht PR drukken de groengevoelige rhodopsin6 (rh6) en vier PR drukken de blauwgevoelige rhodopsin5 (RH5) 2,3. Naast PR, also klasse IV multidendritic neuronen, die het larvale lichaam muur bedekken, zijn geïdentificeerd om te reageren op schadelijke lichtintensiteiten 4,5. Het is ook bekend dat de pacemaker neuronen gelegen in de centrale larvale hersenen uiten het lichtgevoelige eiwit Cryptochrome (Cry) dat fungeert als klok intrinsieke blauw licht sensor in de hersenen 6,7. Intrigerend photophobicity van wild type dieren toont een circadiane component op verschillende tijdstippen in de loop van de dag en nacht bij het testen met deze test. Reacties op licht van foeragerende L3 larve bleek sterker photophobicity bij zonsopgang en lagere photophobicity in de schemering tijdens tests voor licht-donker voorkeur 7. Interessant alleen Rh5-PR's zijn nodig voor licht vermijden, terwijl Th6-PR's zijn overbodig. Beide, Rh5-PR's en Th6-PR's zijn betrokken bij het ​​resetten van de moleculaire klok door licht 8. De Cry traject moet worden gecoördineerd met de andere licht-sensing paden naar een passende gedrags-output in de orkestrerenloop van de dag. Acetylcholine in PR speelt een essentiële rol in het licht vermijdingsgedrag alsmede meevoeren van de moleculaire klok. Het blokkeren van acetylcholine neurotransmissie van PR tot circadiane pacemaker neuronen reduceert de photophobic reactie in het licht-donker voorkeur test 8. Gebruikmakend van dezelfde test, hebben twee symmetrische paren van neuronen is onlangs geïdentificeerd aan het licht voorkeur van het derde larvale instar van Drosophila 9 schakelen. Deze twee paren van neuronen kunnen functioneren tijdens de late larvale stadia, wanneer dieren het voedsel om vermoedelijk te vinden een geschikte verpopping plaats. Echter, de vraag hoe de visuele pathways interactie en controle larvale visuele gedrag op een circadiane manier blijft grotendeels onbeantwoord. De lichte voorkeur assay maakt vergelijkingen tussen circadiane tijdstippen, vliegen lijnen en circadiane staat onder verschillende licht kwaliteiten. De test is eenvoudig voorbereid en goedkoop en is nuttig geweest eerder in verschillende labs te beschrijven en te bestuderen licht afgeleid gedrag in de larve.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Larvale Opfok

  1. Houd vliegen stammen of genetische kruisen in de massacultuur bij 25 ° C op maïsmeel medium onder een 12-uur licht-12-uur donker cyclus in een vlieg incubator uitgerust met licht en timer.
  2. Verdun Backer gist in water om een vloeibare pasta (10 g gist Backer verdund met 3-4 ml gedestilleerd H2 O) vormen. Voeg een kleine druppel op de maïsmeel voedsel en dekking van de flesjes. Laten drogen gedurende ten minste een uur om volwassen vliegen voorkomen vasthouden aan de gistpasta. Om een ​​kleine druppel gist verdund in water op het oppervlak van het voedsel kan ovipositie verbeteren. Alternatief bakkersgist pasta, 20% azijnzuur (AcOH) (Sigma Aldrich, Zwitserland A6283-100ML) worden gebruikt. Hiervoor dip de punt van een Q-tip aan de oplossing en verspreiding op het maïsmeel voedseloppervlak.
  3. Zet volwassen vliegen (minstens vier dagen oud, maar niet ouder dan tien dagen) in maïsmeel voedsel flacons. Doe voldoende volwassenen in elk flesje om voldoende larven te verkrijgen om de voorkeur te herhalentesten een paar keer en laat statistische vergelijking. Voor genetische kruisingen, we gebruiken meestal minimaal 20 vrouwen en 5-10 mannen per flesje, maar sommige lijnen vereisen meer vrouwen voldoende larvale nakomelingen te verkrijgen.
  4. Bieden volwassenen om eieren te leggen voor 12 uur en overzetten naar nieuwe flesjes. Volwassenen kunnen in de ochtend en de avond worden overgedragen. Wij volwassenen dragen meestal zeven tot tien dagen en indien nodig neemt nieuwe volwassenen.
  5. Houd het ei verzameling taken elke 12 uur in de incubator en laat groeien de larven bij 25 ° C, 12 uur licht-12-uur donker cyclus en 60% vochtigheid. Om te testen op circadiane onderdelen van het visuele gedrag verhuizing larven tot constante duisternis (DD) 48 uur na het verzamelen van de eieren (overeenkomend met twee-licht-donker cycli). Gebruik hiervoor een aparte incubator zonder licht, maar blijven alle andere omstandigheden, zoals temperatuur en vochtigheid identiek. Zorg ervoor dat de flesjes over te dragen aan de DD incubator net voor de overgang naar de donkere fase. Voordat we de flesjes nog met een andereER incubator gezet flacons in een kartonnen doos of wikkel de flesjes met aluminiumfolie om blootstelling aan licht tijdens de overdracht (verpakken in kartonnen doos of verpakking moet worden gedaan tijdens de 'lights-on fase "voorafgaand aan de verschuiving tussen incubators) te voorkomen. Voorkomen dat de dieren uit elke blootstelling aan het licht na dit tijdstip tot experimenten starten.
  6. Na 4 dagen (84-108 uur vanaf de eileg) verzamelen vroege L3 (voeden larven) op de tijdstippen worden getest (zie 4. Lichte voorkeur test, punt. 4.4.).

2. Test Setup

  1. Uitvoeren van experimenten in een donkere ruimte met een constante temperatuur en vochtigheidsgraad.
  2. Om twee kwadranten van de petrischaal in de duisternis te houden, hebben betrekking op de deksel met zwarte tape en aluminiumfolie. Om dit te doen, markeer het midden van het deksel omtrek. Ook markeren vier punten op de grens van het deksel met 90 ° van de scheiding tussen hen. Om het makkelijker te maken, trek je een 20 cm vierkant verdeeld in vier kwadranten van 10 cm lengte op eenvel papier of met behulp van een computer. Knip 10 cm vierkantjes van aluminiumfolie en zwarte tape (Figuur 1A). Hebben betrekking op twee tegenovergestelde kwadranten door lijmen een vierkant van aluminiumfolie, als eerste laag en zwarte tape op het, wees voorzichtig te breiden tot de grens van het deksel.
    In het verleden werden twee enigszins verschillende vormen van deze assays gebruikt. We gebruiken hier de 'kwart-plate "-test, waarbij de petrischaal is verdeeld in vier gelijke kwartalen 10. In de alternatieve "half-plate" test de petrischaal is verdeeld helft (halve blootgesteld aan licht, half in het donker) 1,7,8. Tot op heden geen significante verschillen tussen de twee assays is gepubliceerd.
  3. Lijm een ​​kwadrant vel zoals degene die gebruikt wordt voor het markeren van de deksels recht onder de lichtbron op tafel. Markeer de omtrek van een petrischaal gecentreerd op de kwadranten kruispunt. Gebruik de markeringen als referentie om de test plaat altijd plaats op dezelfde positie onder de lichtbron.
  4. Installeer eenlamp, hetzij een eenvoudige witte gloeilamp (Phillips, Softtone 5W) of een LED-lamp (LED-lamp, 80012 Wit, Osram) boven de petrischaal met behulp van een ijzeren statief (Fisher Scientific, S47808). De hoogte zodanig dat de gehele testplaat homogeen wordt verlicht. We raden het gebruik van LED-lampen, omdat ze meer specifieke golflengten uitzenden dan conventionele gloeilampen. Bovendien LED's stoten minder warmte.
  5. Pas lichtintensiteit met behulp van een fotometer (Milieu Meter PCE EM882). Om de gewenste lichtintensiteit van 350-760 lux te bereiken, beweegt de lamp omhoog of omlaag als nodig. Het aansluiten van de lamp op een regelbare voeding geeft meer flexibiliteit om intensiteiten veranderen zonder het verplaatsen van de lamp (Figuur 1B).

3. Platen Voorbereiding

  1. Maak 200 ml van 2,5% agar (Sigma-Aldrich, Zwitserland A5093-500G) met dubbel gedestilleerd water (Millipore).
  2. Plaats petrischalen op een tafel (diameter van 90 mm;Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Oostenrijk) in rijen te laten gieten hete agarose.
  3. Kook de agarose in een magnetron totdat de oplossing volledig transparant en vloeistof. Zorg ervoor dat vloeibare oplossing niet bubbels bevatten. LET OP: Transport zorgvuldig aan de tafel sinds de oplossing kan erg heet zijn!
  4. Giet hete agarose in de petrischalen totdat het hele oppervlak homogeen bedekt is met een dunne laag van de oplossing, ongeveer twee tot drie millimeter voldoende. Wees er snel bij om agarose stollen voordat coating alle platen te voorkomen. Laat de platen afkoelen. WINKEL platen bij kamertemperatuur en gebruik ze alleen op dezelfde dag van bereiding.

4. Lichte voorkeur Test

  1. Werken onder rood licht in het experiment ruimte aan het licht invloed te voorkomen voordat de test aangezien Drosophila is niet in staat om rode golflengten van het licht waarnemen. Gebruik een rood lampje (Phillips, PFE712E * 8) gemonteerd in een lamp te verlichten tHij plaatst om te werken.
  2. Handhaaf de temperatuur in alle experimenten bij 25 ° C. Controle kamertemperatuur met behulp van een verwarmer of koelinrichting indien nodig.
  3. Neem wat eten van de flacons opgefokt voor twee-daagse cycli onder constante duisternis (vanaf hoofdstuk 1). Aangezien larven graven op het oppervlak van het voedsel, neemt de bovenste laag (ongeveer 5 mm diep) met een spatel (Fisher Scientific, 14-373-25A). Verdeel de levensmiddelen aan de buitenzijde van een petrischaal deksel, voeg wat water toe en meng voorzichtig met de spatel.
  4. Verzamel voeden L3 larven uit het voedsel. Zo licht de voorkeur zal worden getest, het kiezen alleen vroeg / voeden L3 larven is cruciaal omdat de negatieve phototaxis is verzekerd. Late / zwervende L3 larven of grote larve kruipen op het voedsel vermoedelijk al hun photobehavior ingeschakeld. Feeding L3 larven (negatieve phototactic) kan worden herkend omdat hun voorste spiracles zijn open en staken naar buiten in een vinger-achtige vorm. De achterste spiracles hebben drie openingen elk, en vier groepen van grote vertakte haartjes. De speekselklieren te breiden tot de tweede abdominale segment 11. Staging larve onder een microscoop is handig terwijl er geen wit licht worden gebruikt. Een rood licht, lamp is nodig om de larven te verlichten als enscenering onder stereoscopische microscoop voordat experimenten nodig.
  5. Kort wassen larven in leidingwater en het verzamelen van vroeg-voederen derde instar larven (nog steeds in rood licht). Voor de overdracht van de larven naar de testplaat, neem de larven met een natte penseel en overtollig water zorgvuldig te absorberen met een papieren handdoek of een papieren filter. Niet droog larven te overdreven, omdat het de dieren zou kunnen schaden en beïnvloeden het gedrag.
  6. Met behulp van de natte kwast voorzichtig overdracht van de larven te platen. Plaats een groep van ongeveer 30 larven in het midden van de plaat. Bedek de plaat met het deksel al voorbereid met de kwadranten en zet de plaat onder de lichtbron klaar voor experiment (zie sectie 2).
  7. Schakel het witte licht lamp en start de timer. Laat de larve vrij bewegen op de plaat gedurende 5 minuten, dan is snel te verwijderen van de deksel en tel het aantal larven in het donker en in het licht kwadranten. Markeren van de positie van elke larve met een marker kan het tellen te vergemakkelijken. Als alternatief een foto van het bord nemen en tel a posteriori. Larven met een onduidelijke lichte voorkeur, zoals larven kruipen op de muren of gravende in agar moet worden beschouwd als neutraal voorkeur en gewoon worden opgenomen in het totale aantal larven wanneer het licht preferentie index wordt berekend.
  8. Na het tellen, gooi de plaat met larven en vervangen door een nieuwe test bord voor het volgende experiment. Verzamel gebruikte platen in een autoclaaf plastic zak voor latere verwerking en verwijdering.
  9. Zodra u een voldoende aantal experimenten een nieuwe genotype kan worden getest hebben uitgevoerd. 10-15 trials per genotype zijn voldoende voor de analyse.

5. Gegevens Analysis

  1. Voor het gemak van de overdracht van gegevens naar een datasheet als Excel (Microsoft) of Origin (Oorsprong Lab) op een computer voor verdere statistische analyse. Regelen in een kolom het aantal dieren in het donker, in een tweede kolom het aantal dieren in het licht kwadranten in het derde het totaal van dieren in de plaat (met inbegrip van "neutraal" larven).
  2. Bereken de voorkeur index (PREF) voor de duisternis voor elk experiment met behulp van de volgende formule:
    PREF (duisternis) = (aantal larven in het donker - aantal larven in het licht) / totaal aantal larven
  3. Vergelijk statistisch gezien een reeks gegevens met een passende analyse voor groepen. Hier gebruiken we een Wilcoxon test om statistisch twee groepen te vergelijken. Een ANOVA-test met multiple-vergelijking een Tukey post hoc test kan worden gedaan, indien de normale verdeling aanname wordt vervuld in een spruitstuk groep vergelijking.
  4. Maak grafieken die duidelijk laten vergelijkingen tussen lijnen en tijdstippen langs de dagcyclus. We gebruik Origin Software (Origin Lab) om statistische significantie te testen en het genereren van geschikte grafieken, maar een andere statistische software kan nuttig zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Volgens het protocol dat hierboven beschreven, testten we licht-donker voorkeur in het vroege derde larvale stadium van wild type Canton-S vliegt op twee verschillende circadiane keer CT0 en CT12. Volwassenen zijn gefokt 12-uur licht-12-uur donker en verlaten om eieren te leggen voor 12 uur. Larven groeien de eerste twee dagen onder dezelfde licht-donker regime. Omdat we wilden circadiaanse modulatie onder constante omstandigheden (vrij lopen van de circadiane klok) te testen, werden larven vervolgens overgebracht naar ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De lichte voorkeur beschreven test maakt gebruik van de larvale aangeboren photobehavior. De test is eenvoudig vast te stellen, kunnen veel herhalingen tegen lage kosten en levert waardevolle informatie over licht sensing en verwerking. De experimentele paradigma maakt relatief snelle kwantificering van hoeveel mensen de voorkeur licht of donker. Een dergelijke voorkeur kan worden weergegeven als ruwe percentages of als alternatief als Preference Index (PREF). De PREF wordt uitgedrukt als het verschil van dieren die de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken onze collega's van het Departement Biologie, Universiteit van Fribourg voor vruchtbare discussies. Wij danken de Bloomington Stock Centrum voor het verstrekken vlieg voorraden. Dit werk werd financieel ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (PP00P3_123339) en de Velux Stichting SGS

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AgarSigma-AldrichA5093-500G2,5%; Sigma-Aldrich, 9471 Buchs, Zwitserland
PetrischalenGreiner Bio-One GmbH63318090-mm diameter; Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Oostenrijk
LED-lampOSARAM80012 WhiteLED-lamp, 80012 White
OmgevingsmeterPCEPCE EM882Lux, Temp, RH%
ThermostaatkastAqua Lytic (Liebherr)ET636-6
LichttimerTimer T6185.104230V/50HZ (bekijk specificaties voor jouw land)
Universele thermostaatConradUT200
BevochtigerBoneco
Zwarte tapeTesa5 cm
LijmUhu
IncubatorlampPhillipsSofttone5W
TimerklokZilissZiliss, Zwitserland
Excel SoftwareMicrosoftExcel
Origin Software 8.5OriginLab
BakgistMigros Switzerland
IJzeren steunstaaf 17X28CMFisher ScientificS47808
AzijnzuurSigma AldrichA6283-100ML20% azijnzuur verdund in H2O
Rode lichtlampPhillipsPFE712E*8C
SpatelFisher Scientific14-373-25A
VoedingEAEA PS 2042-06BOptioneel
AluminiumfoliePrix Coop
VerwarmingGOONNSB200C
MicrogolfovenIntertronic
Standaard vliegenvoer van maïsmeel
Gedestilleerde water

Referenties

  1. Sawin-McCormack, E. P., Sokolowski, M. B., Campos, A. R. Characterization and genetic analysis of Drosophila melanogaster photobehavior during larval development. J. Neurogenet. 10, 119-135 (1995).
  2. Sprecher, S. G., Pichaud, F., Desplan, C. Adult and larval photoreceptors use different mechanisms to specify the same Rhodopsin fates. Genes Dev. 21, 2182-2195 (2007).
  3. Sprecher, S. G., Desplan, C. Switch of rhodopsin expression in terminally differentiated Drosophila sensory neurons. Nature. 454, 533-537 (2008).
  4. Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468, 921-926 (2010).
  5. Diaz, N. N., Sprecher, S. G. Photoreceptors: unconventional ways of seeing. Curr. Biol. 21, R25-R27 (2011).
  6. Emery, P., et al. Drosophila CRY is a deep brain circadian photoreceptor. Neuron. 26, 493-504 (2000).
  7. Mazzoni, E. O., Desplan, C., Blau, J. Circadian pacemaker neurons transmit and modulate visual information to control a rapid behavioral response. Neuron. 45, 293-300 (2005).
  8. Keene, A. C., et al. Distinct visual pathways mediate Drosophila larval light avoidance and circadian clock entrainment. J. Neurosci. 31, 6527-6534 (2011).
  9. Gong, Z. F., et al. Two Pairs of Neurons in the Central Brain Control Drosophila Innate Light Preference. Science. 330, 499-502 (2010).
  10. Lilly, M., Carlson, J. smellblind: a gene required for Drosophila olfaction. Genetics. 124, 293-302 (1990).
  11. Bodenstein, D. The postembryonic development of Drosophila. Biology of Drosophila. Demerec, M. , John Wiley & Sons. 275-367 (1950).
  12. Pittendrigh, C. S. Circadian systems: Entrainment. Biological Rhythms. 4 Handbook of Behavioral Neurobiology, Plenum. 95-124 (1981).
  13. Collins, B., Kane, E. A., Reeves, D. C., Akabas, M. H., Blau, J. Balance of Activity between LN(v)s and Glutamatergic Dorsal Clock Neurons Promotes Robust Circadian Rhythms in Drosophila. Neuron. 74, 706-718 (2012).
  14. Keene, A. C., Sprecher, S. G. Seeing the light: photobehavior in fruit fly larvae. Trends Neurosci. 35, 104-110 (2012).
  15. von Essen, A. M., Pauls, D., Thum, A. S., Sprecher, S. G. Capacity of visual classical conditioning in Drosophila larvae. Behav. Neurosci. 125, 921-929 (2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Circadiaan fotogedraglicht donker voorkeurstestfototaxisanalyseberekening van de voorkeursindexincubatie in constante duisternisLED lampverlichtinglarvale stadiebepalingfotofobisch gedrag

Gerelateerde artikelen