Meten Ruimtelijk-en Directionally-variërend lichtverstrooiing van biologisch materiaal

Samenvatting

We presenteren een niet-destructieve methode voor het bemonsteren van ruimtelijke variatie in de richting van het licht verstrooid over structureel complexe materialen. Door het houden van het materiaal intact, we bewaren bruto-schaal verstrooiing gedrag, terwijl tegelijkertijd het vastleggen van gedetailleerde directionele bijdragen met een hoge resolutie imaging. Resultaten worden gevisualiseerd in de software op biologisch-relevante posities en schalen.

Samenvatting

Licht reageert met omhulling van een organisme op verschillende schaalniveaus. Bijvoorbeeld in een iriserende vogel: nano-schaal structuren te produceren kleur, de milli-schaal structuur van de baarden en baardjes bepaalt grotendeels de directionele patroon van gereflecteerd licht, en door de macro-schaal ruimtelijke structuur van overlappende, gebogen veren, deze directionele effecten te creëren de visuele textuur. Milli-schaal en de macro-schaaleffecten bepalen waar op het lichaam van het organisme, en van wat standpunten en onder welke belichting, zijn de iriserende kleuren gezien. Zo is het sterk gerichte flits van prachtige kleuren van de iriserende keel van een kolibrie onvoldoende verklaard door de nano-schaal structuur alleen en vragen blijven. Vanuit een bepaalde waarneming punt, dat milli-schaal elementen van de veren zijn gericht op een duidelijke afspiegeling? Sommige soorten produceren bredere "windows" voor de observatie van kleurenspel dan anderen? Deze en soortgelijke vragen may worden gevraagd over alle organismen die een bepaald uiterlijk van het oppervlak voor het signaleren, camouflage, of andere redenen zijn geëvolueerd.

Om de directionele patronen van licht verstrooiing bestuderen van veren, en hun relatie met milli-schaal morfologie van de vogel, hebben we een protocol voor het meten van licht dat uit biologisch materiaal met behulp van een groot aantal high-resolution foto's genomen met wisselende verlichting en kijkrichtingen ontwikkeld. Aangezien wij verstrooide licht te meten als functie van de richting, kunnen we de karakteristieke kenmerken van de directionele spreiding van het licht verstrooid uit die veren te observeren, en omdat de weerhaken en baardjes zijn opgelost in onze beelden, kunnen we duidelijk toeschrijven de directionele mogelijkheden om deze verschillende milli-schaal structuren. Het houden van het monster intact blijft de bruto-omvang verstrooiing gedrag gezien in de natuur. De hier beschreven methode presenteert een generiek protocol voor het analyseren van ruimtelijk-en directioneel-varying lichtverstrooiing van complexe biologische materialen op meerdere structurele schalen.

Inleiding

De kleur en het patroon van het omhulsel van een organisme spelen ecologisch en sociaal kritische functies in de meeste dierlijke taxa. Deze fenotypische eigenschappen worden bepaald door de interactie van licht met de structuur van het integument op optische verstrooiing dat zowel ruimtelijk (over het oppervlak van de omhulling) en directioneel (met verandering van verlichting en kijkrichting) varieert kan vertonen. In complexe biologische materialen, zoals veren, wordt de richting waarin het licht beïnvloed door de oriëntatie van herhalende milli-schaal geometrie. Deze milli-schaal structuren zelf kan worden ingebed met nano-schaal structuren, zoals melanine arrays, die vaak erven de milli-schaal oriëntatie. Van nano-tot macroschaal is de structuur van het integument functioneel uitgegroeid tot het signaleren vermogen van het organisme verhogen. Om de invloed van de morfologie van verschillende schalen nagegaan na het totaalbeeld, tools waarmeemeten en analyseren van de kleur van biologische structuren moeten flexibiliteit om gericht licht verstrooiing isoleren op verschillende schalen van vergroting.

We ontwikkelden image-based meetinstrumenten te onderzoeken hoe de prestaties van complexe en gevarieerde milli-schaal morfologie een veertje's (weerhaak rami, distale baardjes, en proximale baardjes) breidt het bereik van meningsuiting mogelijk vanaf nano-schaal structuren alleen. In een beeld opgenomen door de camera waargenomen dat licht dat anders naar verschillende locaties op het oppervlak van de veer, dat wil zeggen lichtreflectie werd ruimtelijk variërende. Toen we verhuisden het licht en de camera richting ten opzichte van de veer, zagen we de reflectie veranderd, dat is, lichtreflectie werd directioneel-variërende ^1. Naar aanleiding van deze opmerkingen, een protocol ontworpen we methodisch het licht en de camera rond het onderwerp te verplaatsen met behulp van een sferische gantry ^2,3, waarmee we gevangen 2 dimensies van surface positie (X en Y), 2 dimensies van licht richting (lengte-en breedtegraad), en 2 afmetingen van de camera richting (lengte-en breedtegraad) (Figuur 2). In software die we visueel onderzocht de 6 dimensies van het verstrooide licht als functie van de positie, verlichting richting en kijkrichting.

Eerder onderzoek naar de reflectie van integumenten heeft te vaak verdisconteerd de bijdrage van gerichtheid - bijvoorbeeld diffuus versus spiegelende of isotrope vs anisotrope reflectie - op kleur expressie. De meeste kleur metingen hebben het invallende licht, voorwerp, en het bekijken geometrie vast om zorgvuldig te voorkomen directionele effecten. Bijvoorbeeld, om spiegelende reflectie van kleurmetingen elimineren, is het gebruikelijk om het licht loodrecht op het oppervlak plaatst en registreert de reflectie bij 45 ° van de normaal. Studies die wel verwijzen morfologie aan directioneel-wisselende reflectie meestal richten op de nano-schaalen de iriserende consequenties ^4-8. Weinig rekening houden met de bijdrage van micro-, milli-, en macro-schaal geometrieën naar het verre-veld optische handtekening ^8-11. Het is dan ook gebruikelijk om een lichte detector gebruiken om geaggregeerde reflectie over een gebied van belang dat meerdere milli-en / of macro-schaal componenten, zoals weerhaak rami, baardjes, en zelfs hele veren ^6,8,11-17 kunnen onder . Wanneer de regio van belang is of kleiner is dan de limiet resolutie van de detector of niet voldoen aan de vorm van het gezichtsveld van de detector, de gemeenschappelijke protocol bevat specimen dissectie om de lichtverstrooiing te isoleren van de specifieke milli-schaal element ^{8,10 , 13,15.}

We hebben een meer omvattende protocol voor het meten acquisitie en visualisatie die verkenning van de vele variabelen vaak genegeerd in andere, meer gerichte studies aanmoedigt ontwikkeld. We meten lichtverstrooiing over een sfeer van aanwijzingen en Acrossa gebied in de ruimte met behulp van een enorme reeks van high-dynamisch bereik, hoge-resolutie foto's genomen uit een systematische set van licht en kijkrichtingen. We maken gebruik van een hoge resolutie beeldsensor met zijn 2D-serie van fijn-schaal pixel detectoren. Aggregatie in hardware vindt plaats op de pixel-niveau, op een schaal kleiner dan de milli-schaal elementen we meten. Een tweede fase aggregaten individuele pixels in software als de gebruiker selecteert de vorm en grootte van de regio van belang. Dienovereenkomstig, kan een enkele meting set herhaaldelijk worden geanalyseerd in de software om de verschillende aspecten van licht interactie onderzoeken met materiaal op meerdere biologisch relevante posities en schalen. Door het elimineren van dissectie en het meten van de gehele veer, ons protocol heeft het voordeel van het verlaten van de morfologie van de veer vaan intact, met behoud van de natuurlijke context en de functie die is, interacties licht, tussen samenstellende milli-schaal elementen.

Lichtverstrooiing van organismaal structuur is multidimensionaal en moeilijk te kwantificeren. Gemeten 6D lichtverstrooiing kan nog niet worden toegeschreven aan de specifieke morfologie binnen een hiërarchie van de schaal met een enkelvoud instrument. Maar we hebben een belangrijke stap in dit streven gemaakt. Bemonstering reflectie via het portaal, het verkennen van grote hoeveelheden gegevens in de software, en visualiseren van data subsets grafisch - - We hebben een tool omvat drie complementaire methodes ontwikkeld om ons vermogen om 6D lichtverstrooiing te meten op elk punt op een materiaal te verlengen, tot aan de milli-schaal. Als protocollen zoals de onze in dienst zijn, voorspellen we biologen zullen een groot aantal gerichte-en ruimtelijk variërende eigenschappen en bijbehorende structurele aanpassingen op meerdere schalen van ontwikkeling te identificeren. Met onze gereedschappen zijn we bezig met het karakteriseren van de signalering potentieel van de richtingstoetsen en de ruimtelijke expressie van milli-schaal structuren, en hopen om licht te werpen op hun adaptieve gevolgen. We pakken een aantal vragen, zoals: van eeny gegeven observatiepunt, die fijnschalige elementen of grove schaal gebieden van de veer weerspiegelen sterk? Hoe werkt de oriëntatie van de gedetailleerde elementen invloed op de richting van het verstrooide licht? Welke morfologische omstandigheden produceren een satijnachtige glans versus een lovertjes schittering van de iriserende ornament? Sommige soorten produceren bredere "windows" voor de observatie van kleurenspel dan anderen? Deze vragen kunnen worden gesteld over vogels en hun veren, maar ook over alle andere organismen die een bepaald uiterlijk van het oppervlak voor het signaleren, camouflage, of andere redenen zijn geëvolueerd.

Protocol

Bij het gebruik van onze methodes om een ​​monster te meten, moet de onderzoeker beslissen over een reeks van camera en licht richtingen, en voor elke combinatie van camera en licht richtingen, de camera maakt meerdere opnamen met verschillende sluitertijden. Het bewegen van de camera vereist extra verwerking, omdat het verandert het uitzicht van het monster zoals te zien in de afbeelding, zodat we normaal gebruiken een klein aantal camera-richtingen en een groter aantal lichtbron richtingen.

In de gedetailleerde protocollen hieronder, beschrijven we eerst hoe je een meting met vele lichtbron richtingen en een camera richting, en hoe de verkregen gegevens (protocol nr. 1) te verwerken en te visualiseren voeren. In het eerste protocol, dat gebruikt kan worden door zelf wanneer een weergave is voldoende om de onderzochte verschijnselen observeren we altijd de camera oog loodrecht op het monster (Basis Routine in figuur 1). Wanneer meerdere camera aanwijzingen nodig zijn, deresulterend schuine uitzicht van het monster kan vervormd worden om de effecten van het bewegen van de camera ongedaan te maken en daardoor de beelden af ​​te stemmen exact overeen met de canonieke loodrechte uitzicht. Om deze vislijnen berekenen, voeren we extra calibratie stappen die observaties van targets geplaatst rond het monster om de beweging van de camera ten opzichte van het monster nauwkeurig te bepalen gebruiken. Protocol nr. 2 detail deze kalibratie procedure en legt uit hoe u de parameters te selecteren en uit te voeren Protocol 1 meerdere keren om gegevens uit meerdere weergaven (Secundair Routines in figuur 1) te verzamelen. Tot slot Protocol nr. 3 bepaalt de extra stappen die moeten worden ingevoegd in Protocol nr. 1 bij de schuine uitzichten tijdens gegevensverwerking corrigeren.

1. Meten Verspreid Licht in de richting van de Surface Normal over de bol van Incident Routebeschrijving (Primary Routine in figuur 1)

1. Bereiden en Monteer de meetobject
   1. Bereid een dunne ferro metalen montageplaatmet een ½ inch opening omgeven door een ring van targets (zoals gezien in figuur 2).
   2. Bereid de te meten materiaal. Als het meten van een veer, bruidegom de weerhaken om te corrigeren voor eventuele uitgepakte of uitgelijnd secties van de pennaceous vaan.
   3. Leg het oppervlak van het object (voorzijde gezicht van de veer) tegen de achterzijde (tegenover de doelring) van de plaat.
   4. Centrum van de regio van belang over de ½-inch opening in de plaat.
   5. Leg een vel magnetische film met een 5/8-inch opening tegen de achterzijde van het object (achterste vlak van de veer), waardoor het object plat drukken tegen de plaat.
   6. De opening van de film aan de opening van de plaat af te stemmen zonder scheren de oppervlakte. De afgeplatte oppervlak, vastgemaakt rond de omtrek van de cirkelvormige opening, levert een vlak macro-oppervlak ongeveer samenvalt met het oppervlak van de plaat.
2. Configureert de Gantry
   1. Zoek demidden van de cirkelvormige opening aan de oorsprong van het coördinatensysteem gantry.
   2. Plaats een lichtbron op het portaal buitenste arm. Richten en te eng richten het licht aan het object, zodat de opening gelijkmatig wordt verlicht voor alle lichtbron hoeken.
   3. Plaats een camera op het portaal binnenste arm. Pas de camera-afstand en de brandpuntsafstand van de macrolens totdat de ring van doelstellingen vult de breedte van de sensor.
   4. Kalibreer de roterende bewegingen (θ, φ) van de camera en lamp armen. Kalibreer de helling (θ) met betrekking tot het oppervlaktewater normale van het object, zodat de camera en de lamp zijn afgestemd op het oppervlak normaal bij θ = 0. Kalibreer de azimuth (φ) van de camera om de azimuth van de lamp. De absolute azimutale oriëntatie is niet kritisch omdat de vastgelegde beelden gedraaid later in het protocol kan zijn.
3. De camera scherpstelling en belichting te configureren
   1. Rotate van de camera tot het object wordt bekeken op een grazende hoek. Verlaag de f-nummer om de scherptediepte (DOF) te minimaliseren, stel vervolgens de focus vliegtuig in het midden van de opening. Verhoging van de f-nummer aan de DOF toenemen totdat de ring van doelen rond de opening in focus is. Een compromis tussen diffractie DOF veroorzaakte onscherpte nodig zijn.
   2. Clip een kleur standaard plat tegen de montageplaat. Voor RGB-afbeeldingen maken gebruik van een Macbeth Color Checker. Voor UV-zichtbaar-NIR metingen gebruiken Spectralon.
   3. Fotografeer de kleur standaard in RAW-formaat. Bereken het kleurkanaal multipliers om de witbalans van de afbeelding.
   4. Zoek de blootstelling beugel die het dynamische bereik van de scène overspant onder de meest extreme bekijken en verlichting richtingen.
   5. Voor elke keer dat de blootstelling in de beugel, verwerven afbeelding een donkere ruis door het blootstellen van de sensor met de lensdop op.
4. Verwerven Metingen van een onregelmatig bemonsterde Sphere of Incident Routebeschrijving
   1. Plaats de camera-as loodrecht op het oppervlak vliegtuig {θ, φ} = {0,0}.
   2. Stap het licht door een reeks gelijkmatig verdeelde posities op de bol, met een grove sampling (bijv. minder dan 500 punten).
   3. Voor elk invallend licht richting in de steekproef:
   4. Het veroveren van een beeld voor elke belichtingstijd rauw in de blootstelling beugel.
   5. Het veroveren van een enkel beeld verlicht door de camera flitser gesynchroniseerd met een relatief korte belichtingstijd om de gantry lamplichttechnologie onderdrukken.
   6. Naar het volgende invallende licht richting en herhaal.
5. Proces Metingen van Dun Sampled Sphere
   1. Met behulp van de debug (document) modus van dcraw ^een om zijn demosaicing functie uit te schakelen, converteren van RAW-formaat naar grijswaarden, 16-bit, lineair, PGM formaat:
      1. Elke donkere blootstelling aan lawaai.
      2. Elke blootstelling van het object bij iedere invallende licht richting.
      3. Integreer alle lage dynamisch bereik (LDR) greyscale vorderingen in gantry lamplichttechnologie in een hoog dynamische kleur voor elke invallende licht richting range (HDR).
         1. Trek de afbeelding van het corresponderende donkere geluid van elke LDR blootstelling.
         2. Demosaic elke LDR blootstelling aan een beeld een kwart schaal opleveren.
         3. Witbalans elk LDR belichting met behulp van de kleur kanaal multipliers berekend in stap 1.C.3.
         4. Samenvoegen donker-noise-afgetrokken LDR belichtingen een HDR enkel door het optellen van de waarden die op elke pixel positie en te delen door de som van de belichtingstijden, weglaten overbelichte pixels van beide bedragen in.
         5. Winkelbeeld HDR in EXR-formaat gecodeerd in halve float precisie en lossless wavelet (PIZ) compressie.
      4. Als de camera richting niet de canonieke richting of de meting run maakt deel uit van een meervoudige camerarichtsteun set (Secondary routines in figuur 1and Protocol 2):
         1. Zetten de enkele LDR grijstinten blootstelling van de flash-verlichte bijhouden doelstellingen voor elk invallend licht richting een zonder mozaïek, een kwart schaal, LDR kleurenbeeld in EXR-formaat.
         2. Volg Protocol nr. 3 bij de flash-verlichte afbeelding gebruiken om projectieve transformatie elk beeld HDR-lamp verlicht in de canonieke uitzicht.
      5. Draai het HDR-afbeeldingen in de gewenste oriëntatie - bijvoorbeeld in ons geval een 90 ° rotatie oriënteert de spil verticaal en de veer punt naar boven.
      6. Gewas de HDR-afbeeldingen strak om de cirkelvormige diafragma. Maskeren van de doelstellingen en de metalen plaat buiten de opening verkleint de bestandsgrootte met maximaal 25%.
      7. Permuteren van de data in het geheel van HDR beelden naar een verzameling bestanden, een voor elk van de verschillende blokken in het beeld, dat alle richtingen reflectiewaarden georganiseerd pixel bevatten. Deze directionele reflectie cache-bestanden worden georganiseerd om snelle toegang mogelijk tot eenll de directionele kleur metingen op een enkele pixel positie van de 2D-projectie van het 3D-object.
   2. Visualiseer Ruimtelijk-wisselende licht verstrooiing over een hiërarchie van Scale
      1. Om de metingen te bladeren, gebruikt u de aangepaste SimpleBrowser toepassing tot de in stap 1.E. gegevens te interpreteren SimpleBrowser opent een venster met het beeld van de veer verlicht door de eerste incident verlichting richting.
      2. Op de afbeelding van de veer vaan, kunnen individuele pixels of groepen van pixels in lineaire of rechthoekige regelingen worden geselecteerd (Figuur 3). Ga verder door het selecteren van een rechthoekig gebied van de veer vaan voor analyse. Vervolgens plot van de gemiddelde directionele lichtverstrooiing van de geselecteerde regio. Een perceel venster met reflectie als functie van richtingscosinussen opent naast het afbeeldingsvenster (R1 in figuur 4).
      3. Standaard is de richting van de maximale luminantie (een transmissie richting in een tyPical veer meting) wordt een belichting van 1 toegewezen. Verhogen of verlagen van de blootstelling in een halve stop (√ 2 x) stappen naar de blootstelling van de reflectie kleur kaart aan te passen.
      4. Schakel de reflectie kleurenkaart tussen luminantie, RGB en kleurkwaliteit (zie R1, R2 en R3 in figuur 4). Voor de volgende stappen gebruiken RGB.
      5. Om de bol te draaien, klik erop om de trackball-interface mogelijk. Sleep de interface om de rotatie veroorzaken. Om de reflectie halfrond bekijken, terug de bol naar de standaardpositie (zie R2 in figuur 4). Roteer de bol 180 ° van de standaardpositie op de doorlaatbaarheid halfrond te bekijken (zie T2 in figuur 4).
      6. Voor een andere weergave van de gegevens, selecteert u de polaire plot modus om de stralen van elke richting te schalen op de bol eenheid door hun respectievelijke luminantiewaarden. Verander de kleur kaart van de luminantie geschaalde sfeer van RGB naar kleurkwaliteit (zie P3, F3, S3, A3 in figuur 4 ).
      7. De verlichting richting van de weergegeven afbeelding wordt rood omcirkeld in de directionele verstrooiing perceel (figuur 4). Klik op een ander voorval verlichting richting aan het beeld van de veer verlicht van die richting te tonen.
      8. Verlagen of de belichting van het beeld naar boven te onthullen en onderbelichte gebieden te verhogen.
      9. Om reflectie te onderzoeken over een hiërarchie van schalen, het herstel van de plot modus om de sfeer eenheid en de kleur kaart naar RGB. In recensie, dit plot geeft de gemiddelde directionele reflectie van de geselecteerde rechthoekig gebied op de afbeelding.
      10. Verander de selectie soort van vierkant naar lineair (figuur 3). Dit zal onderzoek van de directionele reflectie van individuele fine-schaal structuren in het rechthoekige gebied.
      11. Plot de reflectie van de lineaire gemiddelde in een nieuw venster met behoud van de rechthoekige gemiddelde voor referentie. Belichting en set kleur kaart om RGB te passen.
      12. In de lineaire gemiddelde plot, de distale baardjes overspannen door de lineaire gebied worden gezien aan het licht in richtingen horizontaal (figuur 8) weerspiegelen. Selecteer een van de verlichting richtingen in de lineaire plot om de sterk reflecterende distale baardjes in het beeld weer te geven op de linkerkant.
      13. Stap de lijn naar de punt van de veer totdat het gebied van de veer wanneer de proximale barbules aftakking van de aangrenzende Rami bereikt. In de lineaire gemiddelde plot de proximale baardjes worden gezien om het licht in richtingen loodrecht (figuur 8) weerspiegelen. Selecteer een van de routebeschrijving naar het sterk reflecterende proximale baardjes in het beeld weer te geven op de linkerkant.
      14. In de lineaire plot, acht de gedetailleerde structuren die licht in richtingen horizontaal en verticaal te combineren om de verre-veld signaal gezien in het rechthoekige perceel produceren weerspiegelen.

   2. Meten Verspreid Licht in meerdere Camera Routebeschrijving (Secundair Routines in figuur 1)

   Meerdere camera standpunten en niet-uniforme directionele bemonstering ons toelaten om specifieke kenmerken van de directionele reflectie bestuderen. Met de toevoeging van calibratie stappen 2.Een en 2.B, is Protocol 1 is uitgebreid met meerdere camera standpunten te behandelen. Twee specifieke voorbeelden grafisch weergegeven als secundaire Routines II A en II B in figuur 1 zijn vooruit gezet in de stappen 2.C en 2.D hieronder. In dergelijke gevallen wordt de camera richting gewijzigd zijn door canonieke richting (loodrecht op het oppervlak), hetgeen betekent dat het object wordt gefotografeerd van een hellende richting van het oppervlak normaal. Aangezien beelden moeten in kaart worden gebracht in hetzelfde assenstelsel, wij corrigeren en vervormen elke foto om de canonieke oriëntatie overeenkomen door te verwijzen naar het flash-gefotografeerde doelstellingen rond het monster (Figuur 9).

   1. Kalibreren Camera Projectie en Positie:
      Het doel van deze stappen zijn om de camera proj berekeneneel en positie gebruikt in beeldtransformatie.
      1. Clip een checker-patroon kalibratierichtwaarde plat tegen de montageplaat.
      2. Vang een beeld bij de canonieke camera view (dwz {θ, φ} = {0,0}) en meerdere beelden met verschillende andere camera standpunten verspreid over een 120 ° conus gecentreerd op de canonieke weergave.
      3. Laad de beelden in de Bouguet Toolbox ^b, een MATLAB camerakalibratie toolkit. Extraheer de hoeken net in de afbeeldingen van de camera matrices reconstrueren. Exporteer de intrinsieke camera projectiematrix (P) en de extrinsieke camerapositie matrix (M). De intrinsieke camera projectie is samengesteld uit de brandpuntsafstand en het voornaamste. De extrinsieke camerapositie is voornamelijk samengesteld uit een vertaling, het vertaalt de oorsprong van de wereld om de camerapositie.
      4. Lossen voor de matrix die kalibratie-target coördinaten transformeert naar gantry draaitafel coördinaten (X), dwz Bouguet ruimte om gantry ruimte.
      5. Maak de checker patroon van de metalen plaat.
   2. Kalibreren Target posities en Projectie offsets:
      Het doel van deze stappen is om de verschuivingen tussen de kalibratie vlak, het trefvlak, en het monster te berekenen, en de doelposities lokaliseren.
      1. Draai de camera in gantry coördineert zodat de optische as loodrecht op het oppervlak vlak, namelijk de canonieke frame.
      2. Vang een beeld van de ring van de doelstellingen rond de opening met flitslicht. Dit is het beeld canonieke voor het uitlijnen.
      3. Verwerk de ruwe camera-uitgang (protocol beschreven in stappen 1.E.3.a. en 1.E.4.).
      4. Maskeren de regio binnen en buiten de ring doelzone, waardoor verdwaalde spiegelende hoogtepunten die doelherkenning kan verwarren, dan vinden de doelen in de afbeelding.
      5. Draai de camera om een ​​grazende hoek en vastleggen van een afbeelding.
      6. Bereken de canonieke camera pose (Mc = M * Rc) en de grazende hoek camera poseren (Mg = M * RG) op basis van de extrinsieke camera matrix M in stap 2.A.3. waarin een vertaling basis van de positie van de Bouguet ruitjespatroon omvat.
      7. Herdefiniëren M door zijn vertaling te compenseren door de dikte van het papier doel-ring. Itereren proefondervindelijk (herberekenen M een andere offset voor de kalibratie vlak) tot de offset gantry ruimte tussen het vlak van de Bouguet dambord en het vlak van de ring van de doelen, namelijk de dikte van het papier target-ring, is opgelost. Controleer de offset in elke iteratie door opnieuw projecteert de doelen in het imago van de begrazing hoek op de doelstellingen van de canonieke afbeelding.
      8. Herdefiniëren M volgens de procedure van de vorige stap om Reproject de openingen object in beeld het grazen hoek op de openingen object in de canonieke afbeelding met vallen en opstaan ​​tot de offset in gantry ruimte tussen het vlak van de ring van de doelstellingen en het vliegtuig of de van openingen object, namelijk de dikte van de metaalplaat, is opgelost.
   3. Meet Zeven Non-uniform steekproef Reflectance Hemispheres (Secundair Routine II A in figuur 1)
      1. Onderzoekt de directionele verdeling van het gereflecteerde licht gemeten vanaf de camera view normaal op het oppervlak, dwz {θ, φ} = {0,0}, zoals beschreven in Protocol nr. 1. Resamplen de reflectie halfrond naar camera straling opnemen van niet-spiegelende richtingen dunner en spiegelende richtingen dichter.
      2. Gelden dezelfde criteria om de reflectie te proeven in 6 andere camera richtingen gelijkmatig verdeeld over een halve hemisfeer, dwz {θ, φ} = {30,0}, {30,90}, {60,0}, {60,45} , {60,90}, {60.135}. Voorspel de spiegelende regio's van de 6 extra punten uit de kijkrichting van elk gekoppeld aan de reflectie hoek van de eerste run.
      3. Voor elk van de 7 niet-uniformely bemonsterd hemisferen, het verwerven en verwerken van metingen volgens de instructies in stappen 1.D. en 1.E. hierboven.
      4. Visueel bladeren door de directionele reflectie uit dezelfde regio van de veren in elk van de 7 niet-uniform bemonsterde hemisferen, volgens de instructies in stap 1.F. hierboven. Rangschik de directionele reflectie percelen voor elk van de 7 camera aanwijzingen op een polair coördinatenstelsel, waarbij de plaatsing van elk perceel is gebaseerd op de camera draaien (zie de visuele resultaten van Routine II A in figuur 1, ook figuur 5).
   4. Meten fijn bemonsterd halfronde paden naar gedetailleerde informatie over kleurverandering verwerven met hoek (Secundair Routine II B in figuur 1)
      1. Start de SimpleBrowser toepassing en inbreng van de verwerkte metingen van de niet-uniform bemonsterde reflectie halfrond met camera richting {θ, φ} = {0,0}, zoals beschreven in stap 2.C.1. Selecteer ope pixel in het beeld, dan past een vliegtuig naar het 90e percentiel van de luminantie van de hemisferische reflectie bij de geselecteerde pixelpositie.
      2. De bouw van een 1D overname run die fijn monsters spiegelreflectie in het spiegelende vlak. Genereer portaalarm hoeken in ½ ° half-hoek stappen in het vlak bepaald in de vorige stap. Begin met de halve-hoek gelijk is aan 0 ° en verhoging van de half-hoek tot 90 °. Voor elke meting in de verwerving run, houden helft-vector constant en gelijk aan de oppervlakte normale zodat elke camera richting ligt in de spiegelende richting.
      3. Verwerven en verwerken van metingen volgens de instructies in stappen 1.D. en 1.E. hierboven.
      4. Visueel bladeren door de 1D directionele reflectie volgens de instructies in stap 1.F., terwijl de bemonstering een zeer klein gebied (bv. 3x3 pixels) gecentreerd op dezelfde pixel gebruikt om het spiegelende vlak in stap 2.D.1 passen. Zoek de richting van de piek reflectie, dwzshading normaal. Construct 3 bijkomende verwerving loopt op dezelfde manier als stap 2.D.2., Maar stel de half-vector om de arcering normale plaats van de oppervlakte normaal. Voor de 3 extra punten te genereren portaalarm hoeken die in vlakken die de schaduw liggen normaal maar die geroteerd 45 °, 90 ° en 135 ° ten opzichte van het spiegelende vlak gedefinieerd in stap 2.D.1.
      5. Verwerven en verwerken van metingen volgens de instructies in stappen 1.D. en 1.E. hierboven.
      6. Visueel bladeren door de 1D directionele reflectie volgens de instructies in stap 1.F., terwijl de bemonstering een zeer klein gebied (bv. 3x3 pixels) gecentreerd op de pixel wordt gebruikt om de spiegelende vliegtuig in stap 2.D.1 passen. Export uit SimpleBrowser de gemiddelde weerspiegelt uitstraling van deze zeer kleine regio.
      7. In MATLAB, plotten haar kleurkwaliteit als functie van de half-hoek op een kleursoort diagram (Figuur 6). Plotten zijn tint, chroma en luminantie als functie van de halve hoek ( Figuur 7).
      8. Construeer vier meer 1D overname loopt in dezelfde vier vliegtuigen als hierboven, maar deze keer configureert het licht en de camera routebeschrijving naar de breedte en het verval van de spiegelende reflectie te meten. Stel de halve hoek tussen het licht en de camera op een constante 10 °. Genereer portaalarm hoeken in 1 ° half-vector stappen om de as loodrecht op het vlak. Begin met een half-vector gelijk aan -80 ° en verhoging helft-vector tot +80 °, waarbij 0 ° gelijk is aan de normale shading. Merk op dat niet alle camera richtingen bevinden zich in de spiegelende richting.
      9. Verwerven, verwerken en exporteren metingen volgens de instructies in stappen 1.D. en 1.E. en 2.D.6. respectievelijk.
      10. In MATLAB, plotten haar kleurkwaliteit op een chromaticiteitsdiagram als functie van de hoek tussen de half-vector en de schaduw normaal. Plotten zijn tint, chroma en luminantie als functie van de hoek tussen de half-vector en de schaduw normaal.

   3. Projectieve Transformatie

   Projectieve elk beeld HDR zetten in de canonieke weergave of de kijkrichting loodrecht op het oppervlak vlak. Dit protocol is toegankelijk stap 1.E.3.b wanneer een meetrit onderdeel van een meervoudige camerarichtsteun set, zoals beschreven in protocol 2 en grafisch geïllustreerd als secundaire routines in figuur 1 voorbeelden.

   1. Lees een canonieke beeld verlicht van een niet-spiegelende richting. (Bij begrazing spiegelende richtingen het verminderde contrast tussen de witte oppervlak van het papier en de zwarte inkt kan leiden tot detectie falen richten. Vergelijk de helderheid van het beeld A en B in figuur 9.)
   2. Zoek de coördinaten van het midden van elk doel in de canonieke afbeelding.
   3. Laad doelstelling beeld verlicht door flash-camera gemonteerd voor een gegeven lamp-camera directionele pair (B in figuur 9).
   4. Ruwweg transform afbeelding van de doelgroep in de canonieke camera frame met behulp van de gantry camera matrix M berekend in stap 2.B.7.
   5. Zoek de coördinaten van het midden van elk doel in het getransformeerde beeld doelwit (C in figuur 9).
   6. Match elk doel in het beeld omgezet doel om zijn referentie-doelstelling in het canonieke beeld door het vinden van de minimale afstand tussen beeld en referentie-targets.
   7. Gooi alle vage doelen veroorzaakt door DOF bij beweiding hoeken (D in figuur 9).
   8. Los de 2D projectieve transformatie die image maps richt in de canonieke kader van canonieke-afbeelding doelen in hetzelfde frame.
   9. Untransform de verwrongen-to-fit doelstellingen van de canonieke beeldframe terug naar de oorspronkelijke beeldframe door het vlak van de openingen object (M in stap 2.B.8.) In plaats van het vlak van de doelstellingen (M in stap 2. B.7.).
   10. Sla de doelgroep coördinatenparen dat de openingen object in beeld de doelgroep in kaart om de openingen object in het beeld canonieke doel.
   11. Laad de HDR-afbeelding wordt verlicht door de lamp (A in figuur 9).
   12. Afleiden van een ruimtelijke projectieve transformatie van opgeslagen doelgroep coördineren paren om de HDR-afbeelding omzetten in de canonieke frame (E in figuur 9).
   13. Terug naar het hoofd protocol.

   ^een dcraw is een open-source computerprogramma ontwikkeld door David Coffin. Het zet eigen RAW-indeling afbeelding van een camera (en dus onbewerkte CCD data) naar een standaard beeldformaat. Zie http://www.cybercom.net/ ~ dcoffin / dcraw / .

   ^b Bouguet Toolbox is een camera calibratie toolbox voor MATLAB ontwikkeld door Jean-Yves Bouguet. Zie http://www.vision.caltech.edu/bouguetj/calib_doc .

Resultaten

De primaire meting van ons protocol (Routine I in figuur 1), is de camera richting loodrecht op het oppervlak en slechts verplaatst het licht. Sinds lichtverstrooiing hecht aan het beginsel van wederkerigheid, het resultaat is hetzelfde, of we houden de camera constant tijdens het verplaatsen van het licht over het halfrond of omgekeerd. Toen we fix ofwel de camera of het licht, wordt de volledige 4-dimensionaal set onderbemonsterd. Een volledig beeld van de verstrooiing gedrag wordt waargenomen wanneer, in tegenstelling tot de primaire meting, zowel licht en camera worden bewogen vanaf de oppervlakte normaal en in een veelheid van richtingen. Idealiter zouden we lichtverstrooiing meten van vele camera richtingen, zelfs zo veel als het aantal invallende licht richtingen, een symmetrische dataset opleveren. In de praktijk zou dit veel te veel risico's vereisen. In onze ervaring, kunnen wij voldoende informatie over de verschillende standen bekijken, verkrijgen door de camera een paar keer Assu bewegenming 180 ° rotatiesymmetrie over de oppervlaktenormaal. Tijdens de secundaire meetfase, metingen verkregen we bij 7 kijkrichtingen verdeeld over de halve bol binnen 60 ° van het zenit ^18,19 (Routine II A in figuur 1).

In de cijfers van dit document, tonen we representatieve gegevens gemeten van een veer van Lamprotornis purpureus (Purple Glossy Starling), de reflectie van die iriserend, glanzend, en anisotrope (figuur 5). In elk van de 7 kijkrichtingen, wordt gereflecteerd licht verzameld van honderden incidenten verlichting aanwijzingen op het halfrond. De aanwijzingen vormen een smalle band orthogonaal georiënteerd op de centrale as van de veer (zie afbeelding veer in figuur 4). De iriserende kleurverschuiving is subtiel (blauwgroen bij normale inval en groen-blauw bij scherende inval) wanneer de veer loodrecht op het oppervlak wordt gezien zoals in de {0 °, 0 en deg;} RGB plot van figuur 5. Aangezien de kijkhoek benaderingen grazen, wordt de hoek tussen de kijkrichting en de grazende incident richtingen gemaximaliseerd, waardoor een meer opvallende kleurverschuiving (blauwgroene bij 0 ° en magenta op 240 ° tussen invallende en kijkrichtingen) zoals in de {60 °, 0 °} RGB plot in figuur 5.

We kunnen veroorloven te stappen het licht en de camera op een veel fijnere hoekresolutie toen we beperken de bewegingen op 1 dimensie. Figuur 6 toont de kleurkwaliteit van de reflectie van L. purpureus veren als een functie van de hoek tussen de invallende en kijkrichtingen, waarbij het ​​incident en kijkrichtingen in het vlak waarin de spiegelende band, loodrecht op de langsas van de distale barbule. Zoals de iriserende kleur bogen door kleursoort diagram, de tint verschuift van blauw-groen tot paars.

Ruimtelijke vari atie in de directionele reflectie zichtbaar wanneer verschillende (X, Y) coördinaten van het integument overeen met verschillende milli-schaal structuren. In het geval van L. purpureus slechts een structuur - de distale barbule - is zichtbaar over het grootste deel van het gebied. Daarentegen in C. cupreus drie milli-schaal structuren - de rami, barbules distale en proximale barbules - duidelijk onderscheiden in de gegevens kunnen wij reflectie waarnemen van de veer is georiënteerd ten opzichte van de langsas van elke structuur (figuur 8) .

Figuur 1. Deze schematische weergave toont twee methoden voor de montage, de sferische gantry coördinatensysteem soorten verwerving bemonstering en hun resultaten. / Ftp_upload/50254/50254fig1large.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 2. De afgeplatte veer is zichtbaar door een opening in een metalen plaat, omgeven door een ring van doelen. Een sferische portaal kan worden gesteld aan lichtverstrooiing te meten van een veer op meerdere incidenten verlichting en kijkrichtingen. L = Light arm (breedtegraad). C = Camera arm (breedtegraad). B = Camera Base (lengtegraad). T = Draaitafel (lengtegraad). F = Feather.

Figuur 3. Gemiddelde directionele verstrooiing kan worden berekend op basis van een punt, lijn of rechthoekig gebied van veren vaan.

p_upload/50254/50254fig4highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50254/50254fig4.jpg "/>
Figuur 4. Voorbeeld van directionele verstrooiing plotten functies (R * = reflectie, T * = Transmittance, P * = Top, F * = Front, S * = Side, A * = willekeurige) en kleuren (* 1 = Luminance, * 2 = RGB , * 3 = Chromaticity). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 5. De luminantie (boven) en RGB-kleur (onderkant) van de hemisferische reflectie in de richting cosinus ruimte gezien vanaf de (elevatiehoek, azimuthoek) coördinatenparen: {0 °, 0 °}, {30 °, 0 °}, { 30 °, 90 °}, {60 °, 0 °}, {60 °, 45 °}, {60 °, 90 °} en {60 °, 135 °}. de reflectantie gemiddelde van een 25 × 25 pixel rechthoekig gebied van de laterale lamel van een TERTIAL L. purpureus (Purple Glossy Starling) veren. De rode pijlen geven de camera richtingen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 6. Kleurkwaliteit van de reflectie als functie van de halve hoek tussen de invallende verlichting en kijkrichtingen:. CIE 1976 Uniform Chromaticity Scales (USC) met vergrote regio Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

/ 50254/50254fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50254/50254fig7.jpg "/>
Figuur 7. Reflectie als functie van de hoek tussen het invallende licht en kijkrichtingen, in het vlak met (rood) en loodrecht op (gearceerd) de lengteas van het distale barbule: (A) Dominante golflengte, (B) Procent chroma (C ) Procent luminantie. De kleurschakering in perceel A is de RGB-kleur van de reflectie. Waarden negatief golflengte vertegenwoordigen kleuren in de niet-spectrale paarse driehoek. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 8. Gemiddelde directionele reflectie van distale baardjes en proximale baardjes tussen twee aangrenzende rami van de C. cupreus (AfRicaanse Emerald Cuckoo).

Figuur 9. (A) niet-gerectificeerde afbeelding verlicht door gantry lamp, (B) niet-gerectificeerde afbeelding verlicht door flits op de camera, (C) Gefilterd doelgroep kandidaten op affine-getransformeerde, flash-verlichte afbeelding, (D) Acceptabel scherpe doelen binnen de diepte van veld, (E) image Rectified lamp-verlicht, (F) gedraaid veer tip up, bebouwd en gemaskeerd. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussie

Hoewel de prestaties en de functie van vele pigmentair en structurele verkleuringen worden goed herkend, de morfologie van vele integumenten is zo complex dat hun structurele detail en functie slecht begrepen ^20. Integumenten hebben specialisaties die ruimtelijk variëren over het oppervlak van het organisme te verschillend reflecteren licht directioneel naar de kijker ontwikkeld. Directionaliteit heeft aandacht gekregen in de eerste plaats in de studie van kleurenspel vanwege de kleurverschuiving met verandering van incident-en kijkhoek, en onderzoek naar kleurenspel van biologische omhulsel heeft voornamelijk 1D oogstte en sommige 2D metingen ^8,12,17. Maar gegeneraliseerde 6D metingen geen routine zijn in de studie van integumenten ^21-23, iriserend of anderszins, en de literatuur over organismale kleur fenotypes wordt beperkt door het ontbreken van directionele kleurgegevens van het type onze werkwijze verschaft.

De veer is een bijzonder rich integumentary materiaal omvattende regelingen van milli-schaal structuur van de weerhaak: Rami, distale baardjes, en proximale baardjes. De kleine omvang van de elementen en hun complexe arrangementen maken het moeilijk om de lichtverstrooiing prestaties van de afzonderlijke elementen onderscheiden. Ons protocol met succes geïsoleerd milli-schaal structuur van de invloed van macro-schaal geometrie. Door het karakteriseren van de functionele gevolgen van de directionele expressie van milli-schaal structuren om het verre veld handtekening van de veer, we ingeschakeld onderzoek naar hun adaptieve gevolgen.

We geconfronteerd praktische afwegingen tussen spectrale, ruimtelijke en hoekige resolutie. We kozen voor een hoge ruimtelijke, middelgrote hoekige en lage spectrale voor onze studies. Andere combinaties kunnen worden gebruikt, maar sommige (bv. alle hoog) leiden tot een werkbaar lange meettijden. Aandacht moet worden besteed waarbij het belangrijk is voor de specifieke onderzochte verschijnselen. Bij het kiezen van een RGB-ca in dienstmera met een Bayer filter mozaïek, ons protocol ontworpen we aan het menselijke visuele systeem passen. De RGB-camera kan worden vervangen en ons protocol aangepast aan de relatieve kleurenstimulus van een organisme te bepalen, wordt bijvoorbeeld de gevoeligheid in het UV spectrum nodig aviaire tetra-chromatisch ^24,25 meten. Een spectrale imaging camera zou de meest algemene oplossing te bieden ^25.

We toonden ons protocol met TERTIAL vleugelveren omdat ze zijn kleurrijk en gemakkelijk plat tegen een referentie-plaat. Helaas, de opening van de metaalplaat bleek slechts een fractie van de veer oppervlak. Als we tegelijk konden meten de 3D-vorm van het veer oppervlak, terwijl het meten van de reflectie ^25, konden we mechanisch voorkomen afvlakken van de veren en in plaats daarvan meet de gehele veer in zijn natuurlijke, niet-afgevlakte staat.

Interactief, gespecialiseerde, geïntegreerde tools voor het visualiseren van data te voorzien substantial voordeel voor wetenschappers onderzoeken en interpreteren van grote hoeveelheden gegevens. Hoe groter de integratie en interactiviteit, hoe gemakkelijker verbindingen in het niet worden overschreden. In onze software, kan de gebruiker interactief plotten gemiddelde directionele verstrooiing als een functie van oppervlaktepositie (figuur 4). Verdere ontwikkeling van onze software konden integreren andere plotten functies (figuren 6, 7) om de interactieve ervaring te verlengen.