Selectieve Tracing van auditieve vezels in de Avian Embryonale evenwichtszenuw Nerve

Michelle R. Allen-Sharpley; Michelle Tjia; Karina S. Cramer

doi:10.3791/50305

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Selectieve Tracing van auditieve vezels in de Avian Embryonale evenwichtszenuw Nerve

8.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50305

⸱

18 maart 2013

Michelle R. Allen-Sharpley¹ , Michelle Tjia¹ , Karina S. Cramer¹

¹Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een methode, gevolgd door microdissectie fluorescerende kleurstof injectie in de akoestische ganglion vroege kippenembryo's voor selectieve tracering van auditieve axon vezels in de zenuw en achterhersenen.

Samenvatting

De embryonale kuiken is een veel gebruikt model voor de studie van perifere en centrale ganglion cel projecties. In het auditieve systeem, zou selectieve kenmerken van auditieve axonen in het VIIIe hersenzenuw verbeteren van de studie van de centrale auditieve circuit ontwikkeling. Deze aanpak is een uitdaging omdat meerdere zintuigen van het binnenoor bij te dragen tot de VIIIe zenuw ^1. Bovendien markers die betrouwbaar auditieve onderscheiden ten opzichte van vestibulaire groepen van axonen binnen het aviaire VIIIe zenuw moeten nog worden geïdentificeerd. Auditieve en vestibulaire paden kan niet functioneel worden onderscheiden in het begin van embryo's, als zintuiglijke-reacties van de consument zijn niet aanwezig voor het schakelingen worden gevormd. Centraal projecteren VIIIe zenuw axonen zijn getraceerd in sommige studies, maar auditief axon labeling werd gevoegd waarin de door de andere VIIIe zenuw componenten ^2,3. We beschrijven een werkwijze voor anterograde tracing van de akoestische ganglion selectief label auditieve axonen in het ontwikkelen van VIIIe zenuw. Ten eerste, na gedeeltelijke ontleding van het voorste Cephalic gebied van een 8-daagse kippenembryo ondergedompeld in zuurstofrijk kunstmatige cerebrospinale vloeistof, wordt het cochleaire kanaal geïdentificeerd door anatomische oriëntatiepunten. Vervolgens wordt een boete getrokken glazen micropipet gepositioneerd om een kleine hoeveelheid rhodamine dextran amine injecteren in het kanaal en diep aangrenzende gebied waar de akoestische ganglion cellen zich bevinden. Binnen dertig minuten na de injectie, zijn auditieve axonen centraal getraceerd in de achterhersenen en kunnen later worden gevisualiseerd na histologische voorbereiding. Deze methode biedt een handig hulpmiddel voor ontwikkelingsstudies van perifeer naar centrale auditieve circuit formatie.

Protocol

1. Bereid de volgende Dissectiemateriaal en reagentia

Kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF, 130 mM NaCl, 3 mM KCl, 1,2 mM KH _{2PO 4,} 20 mM NaHCO _{3, 3} mM HEPES, 10 mM Glucose, ₂ mM CaCl2, 1,3 mM _MgSO4) continu toegediend met 95% O _2/5% CO ₂ bij kamertemperatuur. Voor infusie vullen tot 2/3 van 500 ml met wijde hals Nalgene pot met een gat in het deksel. Tank wordt bevestigd door een glazen buis stam bubbler, die de aCSF dringt door het gat in de pot deksel. Bandenspanning een constante stroom van belletjes die reiken ongeveer 1/3 van de vloeistof maar niet krachtig genoeg om spatten over de rand te verkrijgen. Submerge 5 ml glazen flacons (tot 6) in de Nalgene pot om individuele monsters scheiden van elkaar en van de gasstroom turbulentie. ACSF worden zuurstof ten minste 20 min voorafgaand aan de incubatie weefsel.
Kleine siliconen dissectie schotel (35 mm x 10mm Petri gecoat met behulp van Sylgard elastomeren Kit) met twee dissectie pinnen geplaatst in kleine zeshoekige polystyreen (47 mm onder) wegen boot.
Twee fijne tip forceps, een gebogen tip forceps, een 50 ml beker en een houder voor weefsel afval.
Getrokken glazen micropipet (1,2 OD / 0,9 ID) gebroken ongeveer 20-50 urn opening aan het uiteinde en gevuld met rhodamine dextran amine (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) in een 6,25% oplossing met 0,4% Triton X-100 in PBS . Bevestig door fijne slang aan picospritzer en te stabiliseren tot micromanipulator.

2. Microdissectie basilaire papilla te onthullen op E8 ^4,5

Met gebogen pincet, snijd E8 embryo net onder de hersenstam, het plaatsen van het hoofd direct op silicone-coated dissectie gerecht binnen wegen boot.
Met behulp van dissectie pinnen, het hoofd te positioneren met een ventrale uitzicht, dus het oor aan de kant van belang is licht zichtbaar, het hoofd iets schuin dorsaal en wijst 10 tot 30 graden van center (Figuur 2A). Onmiddellijk zet de kop met spelden. Als de bilaterale tracering is gewenst, in het midden van de kop op 0 graden, of een volledige ventrale uitzicht, dus beide kanten kunnen worden benaderd. Ook voor een linkszijdige injectie, zet de kop bij -10 tot -30 graden van het centrum, zodat de linkerkant toegankelijk is.
Met behulp van de 50 ml bekerglas, breng 30 ml van zuurstofrijk aCSF in de schaal, volledig onder te dompelen het weefsel.
Voorzichtig te grijpen en schil langs de onderkaak met behulp van fine-tip tang, dan het onderste ooglid te verwijderen aan de zijkant van belang.
Verwijder de bovenliggende vaatweefsel, met inbegrip van alle resterende gehemelte en slokdarm. Deze zachte weefsels moeten afpellen onthullen het gladde oppervlak van de ontwikkeling van chondrocranium met de kenmerkende vertebrale slagaders aan het oppervlak. Door dit punt, moet de karakteristieke witte otoconial massa zichtbaar zijn.
Voorzichtig ontleden de huid rond de externe gehoorgang, kraakbeen van het kaakgewricht en het middenoor, terwijl de inner oor intact. Gebruik de tang om voorzichtig weggesneden deze kraakbeenachtige structuren.
Verwijder vertebrale slagaders en bundeling bloed met behulp van een zachte zwaaiende beweging met de fijne tang tips. Bloed kan belemmeren uitzicht en coagulatie kan de injectie pipet opening sluit.
De cochleaire buis met aangrenzende sensorische epitheel (basilaire papilla) en akoestische ganglion ligt direct onder de chondrocranium ⁶ en kan worden gevisualiseerd als een langwerpige vingervormige uitsteeksel zich vanaf het binnenoor ventraal, de meest distale punt (apex) bij de voorste middellijn ^5. Er een kleine pooling van bloed (rood) vanaf de dissectie en / of otolithic verkalkingen (wit) aan de top van de cochleaire kanaal (Figuur 2B) dat kan helpen bij visualisatie. Bij de top is de lagenar macula, een zintuiglijke patch waarschijnlijk van vestibulaire functie ^7,8.

3. Selectieve Labeling van de GN-VIII Auditieve Vezels

Plaats de injectie pipet in de buurt van de embryo oppervlak op het cochleaire kanaal en basilaire papilla regio.
Langzaam zakken de micropipet om eerst doorboren de schedel. Deze schedel is dunner dan de omliggende gebieden en vereist minder kracht te dringen. De micropipet moet nu in de cochleaire kanaal. Optioneel: een kleine injectie van de tracering kleurstof kan hier gemaakt worden om te helpen bij het visualiseren van de basilaire papilla.
Zonder het herpositioneren van de micropipet, verder te verlagen tot het net strijd is met de diepe rand van het cochleaire kanaal (figuur 1). Hier voert een injectie en herhaal in meerdere gebieden langs de lengte van de basilaire papilla (Figuren 2C, 2D), exclusief de meest proximale uiteinde waar de vestibulaire lagena bevindt. Met de picospritzer ingesteld tussen 10-30 psi, zijn meerdere injecties gemaakt. De hoeveelheid ingespoten kleurstof vloeistof varieert en is afhankelijk van de mate van gewenste etikettering. Iedere injectie moet resulteren in een fluorescente kleurstof-labeled spot van circa 200 - 400 urn diameter (figuur 2D).
Nadat de injectie is voltooid, een tang om het monster boven de hersenstam doorsnijden en een transferpipet gebruiken om de caudale gedeelte plaatsen in een potje in de houder van aCSF voortdurend perfusie met _95% O2 / 5% CO _2.
Voor elk embryo, laat 20-30 min voor kleurstofoverdracht, afhankelijk van de afstand van de centrale tracing gewenst.
Verwijder weefsel en voor te bereiden op histologische coupes. In het voorbeeld wordt weefsel ondergedompeld in 4% paraformaldehyde (in 1X PBS) gedurende de nacht, 30% sucrose (in 1X PBS) gedurende een nacht.

4. Tegenkleuring en Analyse

Tegenkleuring is nuttig om te helpen oriënteren de waarnemer anatomische locatie, alsmede de bijzondere regio's van belang vast te stellen. Een effectieve tegenkleuring in dit preparaat neurofilament immunokleuring (figuren 1, 3B, 3E), die sterk lAbels axonen en maakt afbakening van axonale stukken in het CZS.
Analyse worden uitgevoerd binnen de label regio en de uitsteeksels kunnen honderden microns of meer zich langs de as rostrocaudal. Enkele voorbeelden van eenvoudige analyses zijn: targeting foutenpercentages, timing en / of veranderingen in de divergentie van projectie patronen. RDA-gelabelde axons gevisualiseerd in het perifere en centrale zenuwstelsel met hoge resolutie (Figuren 3A, 3D).