Methodenartikel

Laser Capture Microdissection van Verrijkt populaties van neuronen of Single Neuronen voor de analyse van genexpressie na traumatisch hersenletsel

DOI:

10.3791/50308

⸱

10 april 2013

 ,  , 
1Department of Anesthesiology, University of Texas Medical Branch

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven hoe laser capture microdissectie (LCM) om verrijkte populaties van hippocampale neuronen of afzonderlijke neuronen vastgezette gewonden rattenhersenen voor daaropvolgende analyse van genexpressie met kwantitatieve real time PCR en / of hele genoom microarrays verkrijgen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Lange termijn cognitieve beperkingen na een traumatisch hersenletsel wordt in verband gebracht met letsel-geïnduceerde neurodegeneratie in de hippocampus-een gebied in de mediale temporale kwab dat is van cruciaal belang voor het leren, geheugen en executieve functies. 1,2 Vandaar onze studies richten zich op de analyse van genexpressie van specifieke neuronale populaties in verschillende subgebieden van de hippocampus. De techniek van laser capture microdissectie (LCM), die in 1996 door Emmert-Buck et al.., 3 is toegestaan ​​significante vooruitgang in genexpressie analyse van enkele cellen en verrijkte populaties van cellen van heterogene weefsels zoals de hersenen van zoogdieren die bevat duizenden functionele celtypen. 4 We gebruiken LCM en gevestigde rat model van traumatisch hersenletsel (TBI) om de moleculaire mechanismen die de pathogenese van TBI grondslag liggen onderzoeken. Na vloeistof-percussie TBI, zijn hersenen verwijderd op vooraf bepaalde tijden na het letsel, direct ingevroren op droog ijs,en voorbereid voor het snijden in een cryostaat. De rat hersenen kunnen worden ingebed in OCT en doorgesneden direct of enkele maanden opgeslagen bij -80 ° C vóór het snijden voor laser capture microdissectie. Bovendien gebruiken we LCM de effecten van TBI op circadiane ritmes bestuderen. Hiervoor maken we vangen neuronen van de suprachiasmatische kernen dat de meester klok van de hersenen van zoogdieren bevatten. Hier tonen we het gebruik van LCM om enkel geïdentificeerd neuronen (gewonden en degeneratie, Fluoro-Jade-positieve of ongeschonden, Fluoro-Jade-negatief) en verrijkte populaties van hippocampale neuronen voor daaropvolgende analyse van genexpressie te verkrijgen door real time PCR en / of hele-genoom microarrays. Deze LCM-enabled studies hebben aangetoond dat de kwetsbaarheid van anatomisch verschillende gebieden van de rat hippocampus worden in de verschillende genexpressieprofielen van verschillende populaties van neuronen verkregen door LCM uit deze verschillende gebieden. De resultaten van onze single-cell studies, waarbijwe de transcriptionele profielen van aangrenzende sterven en overleven hippocampale neuronen suggereren het bestaan ​​van een celoverleving regelweerstand die celdood en overleving na TBI regelt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Genexpressie analyse van heterogene weefsels is altijd problematisch. Dit geldt met name in de hersenen van zoogdieren, die ongeveer 5.000 verschillende celtypen heeft 4 Vóór de ontwikkeling van de laser capture microdissectie (LCM) techniek, genomische studies de effecten van TBI in vivo zijn gebaseerd op analyse van de genexpressie in een gemengde populatie van hersencellen omvat niet alleen verschillende neuronale celtypen, maar ook ondersteunen gliale en immunomodulerende cellen. Het resulterende complex genexpressie die uit deze heterogene weefsels en de vaak tegenstrijdige patronen van schade geïnduceerde cellulaire signalen kan men redenen niet in studies van therapeutische strategieën effectief gebleken in preklinische studies van TBI. 5 liggen

Om een ​​duidelijk begrip van letsel-geïnduceerde genexpressie te verkrijgen in de kwetsbare populaties van neuronen van de rat heuppocampus, hebben we de techniek van LCM, eerst gemeld door Emmert-Buck et al.. 3 Vervolgens hebben we aangepast en geoptimaliseerd dit microdissectie techniek voor efficiënte vangst van verrijkte populaties van neuronen en enkele neuronen voor mRNA profiling met behulp van kwantitatieve real-time PCR en microarray analyse . Om de integriteit van mRNA in vriescoupes van hersenweefsel voor genomische analyse te behouden, hebben we aangepast bestaande protocollen voor het fixeren, kleuring en een snelle vangst van neuronen uit bevroren hersenen van de rat secties. Voor identificatie en isolatie van gewonde en stervende hippocampale neuronen maar ook geoptimaliseerd Fluoro-Jade kleuring techniek voor LCM. Fluoro-Jade maakt geen onderscheid tussen apoptotische en necrotische celdood. Zo kunnen allerlei degenererende neuronen worden gedetecteerd door deze vlek. 6,7

We beschrijven hier het protocol dat in ons laboratorium om pools van enkele sterven of overleven neuronen en stroken van verrijkt populati te verkrijgenons van verschillende neuronale celtypen (bijvoorbeeld CA1-CA3 neuronen voor genexpressieanalyse na TBI). De procedure voor fluïdum percussie hersenletsel in ons laboratorium is in detail beschreven in Shimamura et al.., 8 en is zeer vergelijkbaar met de laterale fluïdum-percussie schade protocol voor muizen gepubliceerd in Jove door Alder et al.. 9 Aangezien de LCM techniek heeft aangetoond dat weinig of geen effect hebben op de integriteit van DNA, RNA en eiwitten in weefsel, is een uitstekend hulpmiddel voor moleculaire en eiwitanalyse van gedefinieerde celtypes.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Chirurgische ingrepen en Fluid percussie TBI

  1. Alle dierproeven worden eerst goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Texas Medical Branch in Galveston, Texas en de National Institutes of Health Guide voor de zorg en het gebruik van proefdieren (8e editie, National Research Council).
  2. Ratten (volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten, 400-500 g verkregen bij leverancier Charles Rivers, Portland, Maine) zijn ondergebracht twee per kooi en voorzien van voedsel en water ad libitum in een vivarium met deze constante omstandigheden: lichtcyclus (600 uur tot 1800 hr), temperatuur (21 ° C tot 23 ° C) en vochtigheid (40% tot 50%) een week voor gebruik.
  3. Verdoof ratten met 4% isofluraan, intuberen, en mechanisch ventileren (Nemi Wetenschappelijk; New England Medical Instruments, Medway, MA) de ratten met +1.5-+2,0% isofluraan in zuurstof: lucht (70:30) en hen voor te bereiden parasagittal vloeistof-percussie schade zoals eerder beschreven 8., 10
  4. Offer ratten op het juiste tijdstip na een blessure, afhankelijk van de experimentele opzet. Snel te verwijderen hersenen, bevriezen onmiddellijk op droogijs, en bewaar bij -80 ° C in een 50 ml buis of ga onmiddellijk naar in OCT insluiten voor bevroren snijden.

2. Snijden en Kleuring van hersenen van de rat

  1. Hersenweefsel die niet onmiddellijk gebruikt kan worden bewaard bij -80 ° C gedurende een maand of op een constante temperatuur. Hersenen die bevroren bij -80 ° C, vervolgens ontdooid tot -20 ° C voor het snijden, en vervolgens opnieuw ingevroren niet opbrengstkwaliteit RNA na de tweede ontdooien. Zodra de hersenen ontdooid, gemonteerd in OCT en doorgesneden moet slides worden gekleurd binnen 24 uur en voor LCM binnen 30 minuten tot een uur kleuring. Dit zal zorgen voor een goede kwaliteit RNA. Na LCM kan gevangen cellen op LCM caps opgeslagen in lysis buffer bij -80 ° C gedurende maximaal een week, maar RNA worden geïsoleerd tijdig de hoogste kwaliteit.
  2. Voorafgaand aan het snijden van de hersenen, veeg de cryostaat met RNase-Zap en reinig de borstels met EtOH (vervang de wegwerplemmet tussen elke hersenen).
  3. Haal de hersenen in de 50 ml buis van de -80 ° C vriezer, door deze in de cryostaat bij een temperatuur van -22 ° C en ontdooien in buis gedurende ongeveer 10 minuten. Verwijder de hersenen uit de tube en plaats op het podium op gaas, ventrale zijde naar boven.
  4. Met behulp van een scheermesje, snijd de hersenen om het achterste gedeelte van de hersenen net rostraal van de kleine hersenen en het voorste gedeelte op de optisch chiasma te verwijderen. Vul een cryomold met OCT montage medium (Tissue Tek), en plaats de hersenen in de mal met de anterieure zijde naar beneden. Laat de hersenweefsel te bevriezen in het fixeermiddel totdat deze wit (ongeveer 10 min).
  5. Bevries de objectplaatje (Tissue Tek) op de hersenen met oktober Verwijder de hersenen uit de matrijs. Steek de hersenen in de objectkop en draai de schroeven vast.
  6. Plaats een Disposabaar, laag profiel mes (Fisher Scientific) in de meshouder en draai de hendel naar beneden.
  7. Beginnen snijden de hersenen op 20 urn tot de buitenste laag van oktober verwijderen. Zodra de hippocampus regio is bereikt, zet de draaiknop micron tot 10. Verzamel coronale seriële secties door het plaatsen van een glasplaatje of een plus-glasplaatje op het weefsel sectie (Fisher Scientific). Glaasjes bewaard bij -20 ° C in een RNase-vrij kleuring rack tot snijden is voltooid.
  8. Als u alle RNasen uit glaswerk waar weefselcoupes worden verwerkt, dient u alle vlekken containers en studeerde cilinders met Eliminase (Fisher Scientific) en spoel in Milli Q water. Bereid alle oplossingen met RNase-vrij water en filteren cresyl violet (Sigma-Aldrich) en Fluoro-Jade (Histo-chem) vlek met een 0,2 um filter voor gebruik.
  9. Hersencoupes ontdooien bij kamertemperatuur gedurende 30 seconden en oplossen in 75% EtOH (1 min).
  10. Voor LCM van enkelvoudige neuronen na fixatie gewonden spoelen slides in RNase-vrij water (1 min), Tegenkleuring met 1% cresyl violet (15-20 sec), spoelen met RNase-vrij water (2 x 30 sec), kleuren met Fluoro-Jade (4 min) spoelen in RNase-vrij water (3 x 1 min), dehydrateren met 95% EtOH gemaakt van RNase-vrij water (30 sec), 100% EtOH (30 sec), en xyleen (2 x 3 min).
  11. Voor LCM zwaden neuronen na fixatie, dia spoel in RNase-vrij water (1 min), vlek met 1% cresyl violet (1 min), in RNase-vrij water spoelen (3 x 1 min), gedehydreerd met 95% EtOH (2 x 30 sec), 100% EtOH (2 x 30 sec), en xyleen (2 x 3 min).
  12. Air drogen alle secties in een zuurkast gedurende 15 minuten voorafgaand aan de LCM. Dia's kunnen worden opgeslagen, sectie kanten op, in een dia doos bekleed met droogmiddel, als ze moeten worden overgedragen van kamer naar kamer. Echter worden optimale resultaten verkregen indien LCM wordt onmiddellijk na secties droog. LCM worden beperkt 30 minuten tot 1 uur. In de volgende paragraaf beschrijven we eerst hoe de voortdurende zwaden van cellen, die is ea vast te leggenSiest de knie te krijgen voor degenen die het leren van deze techniek. Dan beschrijven we hoe u precies enkele neuronen vast te leggen. In onze procedure, identificeren we sterven neuronen door hun affiniteit voor Fluor-Jade-een marker van degenererende neuronen. Fluor-Jade-negatieve cellen worden geacht te zijn overlevende neuronen.

3. Laser Capture Microdissection (LCM)

LCM van zwaden van verrijkte populaties van hippocampale neuronen

  1. LCM wordt uitgevoerd met een PixCell IIe microscoop met een infrarood diode laser (Life Technologies).
  2. De middenfrequentie joystick naar de verticale positie. Draai en vergrendel de 4X doel op zijn plaats.
  3. Plaats een dia in het midden van de microscooptafel en stel tot het gebied van de hippocampus in beeld is. Gebruik grove en fijne scherpstelling om het beeld scherp te stellen.
  4. Activeer de vacuümklem door op de vacuüm-knop op de controller. Draai en vergrendel de 10X doelstelling in plaas. Focus opnieuw met grove en fijne aanpassingen.
  5. Laad de CapSure Macro LCM caps (Life Technologies) in de CapSure cassette module en plaats een kapje op de lastlijn positie. Draai de Cap Plaatsing arm en positie rond de dop. Til de Cap Plaatsing arm naar de CapSure dop te verwijderen uit de cassette module.
  6. Draai de Cap Plaatsing arm over de glijbaan en laat de arm naar beneden over de glijbaan, dit zal de dop plaatsen op de dia. Stel het scherpstellen en beweeg de joystick om te controleren of cellen zijn binnen de zwarte cirkel op de dop. Alle cel vangt moet binnen deze cirkel.
  7. Stel de laser parameters. Druk eerst op de laser in te schakelen knop op de controller. De laser doelgroep plek zichtbaar zal zijn als een roze stip op het gebied van visie op de computer monitor.
  8. Stel de laserspot naar klein (7,5 micrometer) om de laser richten en de kracht en de duur tot 65 aan te passen - 75 mW, voor 1,0-2,0 msec als nodig is voor een optimale cel vast te leggen.
  9. Om test van de laser, gebruikt u de joystick om de laserspot verplaatsen naar een gebied waar er geen cellen op te halen. Vuur de laser met de duim-schakelaar. Gebruik de joystick om de laserspot te verplaatsen uit de buurt van het gesmolten polymeer plek en controleer om te zien of een zichtbare donkere ring rond een duidelijk gebied waar de laser werd afgevuurd.
  10. Als u cellen wilt vastleggen, gebruikt u de joystick om de laserspot bewegen over het gebied van de cellen vast te leggen. Vuur de laser met de duim-schakelaar. Beweeg de joystick tijdens het afvuren van de laser om een ​​groot gebied van de cellen vast te leggen. Wanneer de laser wordt afgevuurd smelt het thermoplastische polymeer film op de dop op het oppervlak van de doelcellen. Het polymeer absorbeert de laserstraling, dus zonder aan de RNA, DNA of eiwit de integriteit van het monster voor toekomstige moleculaire toepassingen.
  11. Na het bakken alle cellen van belang zijn, til de Cap Plaatsing arm. De gevangen cellen zal scheiden van de weefselsectie en zich aan de CapSure cap. Dit restmateriaal en ontbrekende cellen zullen visbaar in het gezichtsveld. De cellen op de dop kan ook worden bekeken door het plaatsen van de kap op een leeg gedeelte van de dia.
  12. Til de Cap Plaatsing arm en draai het naar Cap Unload Station. Laat de dop in het station en draait u de Cap Plaatsing arm in de vorige positie.
  13. Schuif de CapSure inbrengen gereedschap langs het perron en op de dop. Til het gereedschap van het platform. De kap blijft bevestigd. Druk licht op de dop om de CapSure schone pad schoon te maken weg ongewenste weefsel.
  14. Plaats de dop in een 0,5 ml RNase-vrije buis gevuld met 100 ul lysis buffer verkregen uit de RNAqueous Micro-Isolation Kit. Onmiddellijk de dop vortex gedurende 30 seconden om de cellen te lyseren. Incubeer de monsters bij 42 ° C gedurende 30 min en invriezen bij -80 ° C tot de RNA isolatie.

LCM van enkele FJ + neuronen in de hippocampus

  1. Om enkele cellen vast te leggen, te laden CapSure HS LCM caps in de CapSure cassette module en positiop een maximum van de belasting lijn positie. Draai de Cap Plaatsing arm en plaats het rond de dop. Til de Cap Plaatsing arm naar de CapSure dop te verwijderen uit de cassette module.
  2. Stel de laserspot naar klein (7,5 um) van de laser te richten en de laservermogen en duur tot 65 -75 mW voor 0,45 tot 0,50 msec voor optimale cel opname van afzonderlijke cellen te passen.
  3. Draai de Cap Plaatsing arm over de glijbaan en laat de arm naar beneden in de richting van de dia. Dit plaatst de dop op de dia. De Capsure HS dop oppervlak zit verhoogd van het monster tijdens LCM.
  4. Gebruik de joystick om de laser bewegen over enkele FJ + cellen. Alle cellen worden gevangen moeten binnen de kleine zwarte ring op de dop. Vuur de laser met de duim-schakelaar.
  5. Als alle cellen binnen de zwarte cirkel gebied zijn afgevuurd met de laser, til de Cap Plaatsing arm. De gevangen cellen zal scheiden van de weefselsectie en zich te houden aan de CapSure GS dop.
  6. Plaats een andere dia op de microsgaan het podium en het verzamelen van FJ + cellen tot de GS-dop vol is. Plaats de dop in een 0,5 ml RNase-vrije buis gevuld met 40-50 ul lysis buffer. Onmiddellijk de dop vortex gedurende 30 seconden om de cellen te lyseren. Incubeer de monsters bij 42 ° C gedurende 30 min en invriezen bij -80 ° C tot de RNA isolatie.

4. Total RNA Isolation Van LCM Samples (Deze sectie zal alleen worden beschreven in de videopresentatie)

  1. Totaal RNA uit cellen geïsoleerd met behulp van Micro-RNAqueous Kit (Ambion) volgens protocollen van de fabrikant. Alle reagentia en wasoplossingen worden in deze kit. Bevochtigen de micro filter patroonsamenstel door toevoeging van 30 ul lysis buffer oplossing de filter. Na 5 minuten centrifugeren van de filter gedurende 30 seconden bij 10.000 x g.
  2. Voeg 3 pl LCM additief aan het monster lysaat te pipet mengen en centrifuge.
  3. Voeg 52 ul 100% EtOH (1/2 volume) verdund lysaat, pipet te mengen en breng de lysaat aan de filterkolom.
  4. Centrifugeer de filterkolom bij 10.000 x g gedurende 1 min om het RNA aan de kolom binden. Als er meerdere caps voor een monster elk lysaat afzonderlijk draaien door dezelfde kolom.
  5. Voltooi de RNA isolatie zoals beschreven in de RNAqueous Micro kit.
  6. Voer DNase behandeling en DNase inactivering van LCM RNA monsters zoals beschreven in de kit, breng de RNA een RNase-vrij gelast en bewaard bij -80 ° C.

5. RNA Kwantificering en afgeleide toepassingen

Beoordeling van RNA kwaliteit en kwantificering wordt uitgevoerd met een Agilent Bioanalyzer met reagentia van Pico Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) volgens het protocol van de fabrikant.

  1. Totaal RNA wordt geanalyseerd op een Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). De software evalueert de concentratie en de integriteit van het RNA-monster door het toewijzen van een RNA Integrity Number (RIN) aan elk monster variërend from 1 tot 10. 1 tot 5 geeft gedegradeerde RNA en 7-10 duidt op een goede kwaliteit RNA.
  2. Niet-aangetaste intact RNA zal worden gebruikt voor real-time PCR; individuele Taqman assays of RT2 profiler arrays met behulp van SYBR-groene chemie. Het RNA kan ook gebruikt worden voor mRNA microarray analyse en microRNA microarray analyse.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In onze eerste LCM onderzoek, konden we dat functioneel verschillende subregio's (CA1 en CA3) van de hippocampus van ratten tonen hebben genexpressie profielen die hun kwetsbaarheid voor TBI. 8 Figuur 1A-1C weerspiegelen toont laser capture van de hippocampus piramidale neuronen (CA1- CA3), dentate gyrus neuronen en SCN neuronen voor, en na de LCM. Schoon vangsten van piramidale, korrel of SCN neuronen, respectievelijk zijn vermeld op de macro-caps. Figuur 2A-2B illustreert sterven, fluor-Jade positieve piramidale neuronen en overleven, fluor-Jade negatieve piramidale neuronen voor en na LCM. De schone vangst van de stervende of de overlevende neuronen wordt weergegeven door het bekijken van de gevangen cellen op het LCM caps.

Na LCM kan de totale RNA worden gebruikt voor uiteenlopende moleculaire studies met kwantitatieve real-time PCR analyse van genexpressie met behulp van TaqMan of SYBR green chemie (figuur 3A), kleine focuPCR arrays sed met SYBR green probes (Figuur 3B) of whole genome microarray studies (Figuur 3C).

figure-results-1
Figuur 1. Laser capture microdissectie van stroken van gedefinieerde celpopulaties van rattenhersenen. Frozen 10 urn coronale secties van de rattenhersenen worden vastgesteld in ethanol, gekleurd met een vlek Nissl (cresyl violet) en voorbereid voor LCM. Getoond worden foto's van de hippocampus van ratten en suprachiasmatische kern voor en na LCM en de gevangen cellen als gevisualiseerd op de macro-caps. A. piramidale neuronen van de CA1-CA3 deelgebieden van de hippocampus van ratten. B. Korrel cellen in de hippocampus dentate gyrus. C. Bilaterale suprachiasmatische kernen aan beide zijden van het derde ventrikelen boven de optische chiasma. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

figure-results-2
Figuur 2. Laser capture microdissectie van enkele neuronen van de rat hippocampus. Afgebeeld zijn A. ontaardt, fluor-Jade-positieve (gekleurde) hippocampale CA3 neuronen en B. Overleven, fluor-Jade-negatieve (ongekleurde) CA3 neuronen voor en na LCM. Gevangen cellen worden gevisualiseerd. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

figure-results-3
Figuur 3. Genexpressie analyse van totale RNA geïsoleerd uit laser gevangen neuronen. A. Kwantitatieve real time PCR data van circadiaanse klok genexpressie in SCN. B. Heatmap van genexpressie in verven en overlevende hippocampale neuronen die expressie van apoptose-gerelateerde genen met PCR gericht arrays . C. Agilent hele genoom microarray analyse van de genexpressie in hippocampale CA1-CA3 neuronen van ratten die sham schade ontvangen of TBI TBI plus een recombinant adeno-geassocieerd virus siRNA knockdown ter expressie van genen geïnduceerd door hersenletsel (neuronale stikstofoxide synthase en glutathion peroxidase-1). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze LCM techniek heeft ons in staat om aanzienlijke vooruitgang te boeken bij het ​​begrijpen van de moleculaire mechanismen van TBI. 8,10,11,12,13 Wij waren de eerste onderzoekers om deze techniek te gebruiken om aan te tonen dat verschillende subregio's van de hippocampus van ratten genexpressie profielen hebben dat correleren met hun selectieve kwetsbaarheid voor letsel. Onze studies hebben aangetoond dat we genexpressie kwantificeren door qPCR, van zo weinig als 10 laser gevangen cellen en dat we genoom microarray analyse uitvoeren van zo weinig als 600 gevangen cellen. LCM een waardevol instrument in vergelijkbare studies van andere hersengebieden waarvan bekend is dat betrokken is bij diverse neurologische en neuropsychiatrische stoornissen. Bijvoorbeeld, studies met LCM belichten in de pathogenese van de ziekte van Parkinson in dopamine neuronen van de substantia nigra, 14 en geholpen genoomwijde studies profilering van de nucleus accumbens, dat betrokken is bij beloning circuits betrokken in substance misbruik stoornissen 15.

Neuronale heterogeniteit wordt gereflecteerd onder genoomniveau 16 en kan bijdragen aan het gebrek aan succes van experimentele behandelingen voor TBI in klinische trials. Zo, ons doel is om deze techniek te gebruiken om de kritische elementen van invloed zijn neuronale overleving na een traumatisch hersenletsel te onderzoeken. Onze recente genoom profilering onderzoek sterven en aangrenzende overlevende hippocampale neuronen na TBI gesuggereerd dat een cellulaire weerstand dat de verhouding van de expressie van celoverleving weerspiegelt celdood genen lot van de cel reguleert na TBI. Deze lopende studies zullen bijdragen aan het ontwerp en de ontwikkeling van farmacotherapeutische strategieën die een positieve invloed kunnen de overleving van de cel rheostat. Verder hebben we op dit moment gebruik maken van LCM op te sporen en te monitoren van de effecten van mogelijke therapeutische behandelingen met geneesmiddelen in hippocampale neuronen na een traumatisch hersenletsel. Zo, onze studies tonen aan dat gegeven zorgvuldige RNase-vrij behandelingstechnieken en een aantalmodificaties van bestaande protocollen is het mogelijk om hoge kwaliteit RNA monsters van LCM nauwkeurige kwantitatieve analyse van genexpressie.

Maar er zijn een paar valkuilen in verband met LCM technieken. Zo kan het verzamelen van alleen neuronale cellen zonder microglia besmetting bijna onmogelijk. In de pyramidale cellaag van de hippocampus is geschat dat 95% van de cellen zijn neuronen met 90% van deze populatie te piramidecellen en 10% interneuronen, waardoor een klein percentage van gliale en andere celtypes. 8,17, 18 In onze studies hebben we gebruik Fluoro-Jade een fluorescerende kleurstof die specifiek labelt enkel gewonden neuronen in hersenweefsel. Een andere vlek die een merker voor GFAP zou moeten worden microglia vlek. Verzamelen 19 alleen Fluoro-Jade gekleurde enkele neuronale organen zorgt voor een homogene populatie van neuronen. Een ander veel voorkomend probleem is zelfs mogelijk dat het oplossen van problemen is dat een cirkel geent gedefinieerd wanneer de laser wordt afgevuurd. Als dit gebeurt, moet de laser te controleren en de kracht en de duur zo nodig aan. Ook is het belangrijk dat de dop plat op het weefsel en goed in de arm. Verwijzend naar de LCM technische handleiding of bellen technische ondersteuning soms noodzakelijk zijn. Na LCM en RNA isolatie moeten de kwaliteit van het RNA altijd worden beoordeeld met een Bioanalyzer vóór het genexpressieanalyse.

Er zijn verschillende types van laser capture instrumenten die momenteel op de markt, waaronder lasersnijden (Life Technologies, Leica Microsystems) en laser katapulten (Zeiss) instrumenten. Onze LCM systeem werkt goed voor vastleggen van kleine aantallen cellen. Andere high-throughput en geautomatiseerde systemen kunnen meer geschikt voor het verkrijgen van grotere aantallen cellen voor genomische en proteomische analyse bijzonder. Inderdaad, LCM met behulp van deze geautomatiseerde systemen heeft een groot potentieel voor de analyse van protein expressie in cellen geïdentificeerd of verrijkte populaties van cellen. 20 Bovendien kan LCM vergemakkelijken genexpressieanalyse van immunolabeled cellen, 21 waardoor we genexpressie ongeacht onderzoeken in bepaalde celtypen de complexiteit in de meest heterogene weefsels. Zo LCM is een uitstekend hulpmiddel voor cutting-edge moleculaire studies van enkele of verrijkte populaties van cellen.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat ze geen belangenconflicten hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk wordt gefinancierd door R01 NS052532 (tot HLH), de Moody Foundation, en het ministerie van Anesthesiologie. Wij danken Laurie Bolding, Christine Courteau Butler en Christy Perry voor hun redactionele ondersteuning, en Christy Perry voor lay-out en een uitstekende productie van alle figuren, tabellen en illustraties.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
PixCell IIe Laser Capture MicroscopeLife Technologies (Arcturus)
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent Technologies
RNAqueous Micro- KitLife Technologies (Ambion)AM1931
Agilent 6000 Pico KitAgilent Technologies5067-1513
Capsure LCM capsApplied BiosystemsLCM0211/LCM0214
Fluoro-JadeHisto-chem Inc.#1FJ
Cresyl Violet AcetateSigma-aldrichC5042-10G
Xylene (Histological grade)Fisher ScientificX3P-1GAL
Ethanol 200 proof (Histological grade)UTMB pharmacy
RNase free barrier pipette tipsFisher Scientific2123635, 212364, 212361, 21-236-2A
Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies)
Zeiss Laser Microdissection The PALM family
Leica Microsystems

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. The medial temporal lobe. Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).
  2. Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
  3. Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
  4. Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
  5. Schouten, J. W. Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature. Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).
  6. Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration. Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).
  7. Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy. Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).
  8. Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).
  9. Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063(2011).
  10. Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats. Neuroscience. 131 (1), 87-97 (2005).
  11. Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).
  12. Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
  13. Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS One. 6 (8), e2311(2011).
  14. Elstner, M., Morris, C. M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson's disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
  15. Chen, H., Liu, Z., et al. Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing. Front. Neurosci. 5, 98(2011).
  16. Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
  17. Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. Neurons, numbers and the hippocampal network. Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).
  18. Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus. Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).
  19. Schmued, L. C., Hopkins, K. J. Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration. Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).
  20. Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis-- preliminary findings. Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).
  21. Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis. Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hippocampale neuronenFluoro Jade kleuringreal time PCRwhole genome microarraycryostaatsnijdenOCT inbedding

Gerelateerde artikelen