Opnemen van elektrische activiteit van geïdentificeerde neuronen in de intacte hersenen van transgene Fish

Yali Zhao; Nancy L. Wayne

doi:10.3791/50312

Methodenartikel

Opnemen van elektrische activiteit van geïdentificeerde neuronen in de intacte hersenen van transgene Fish

13.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50312

⸱

30 april 2013

Yali Zhao¹ , Nancy L. Wayne¹

¹Department of Physiology, University of California, Los Angeles

In dit artikel

Samenvatting

In deze video laten we zien hoe de elektrische activiteit van de geïdentificeerde enkele neuronen in een hele brein voorbereiding, waarin complexe neurale circuits behoudt opnemen. We maken gebruik van transgene vissen waarbij gonadotropin-releasing hormoon (GnRH) neuronen genetisch worden gelabeld met een fluorescerend eiwit voor identificatie in de intacte voorbereiding hersenen.

Samenvatting

Inzicht in de cel fysiologie van neurale circuits die complexe gedrag reguleren sterk verbeterd door modelsystemen waarop dit kan worden gewerkt in een intact preparaat hersenen waar de neurale circuits van het CZS blijft intact. We maken gebruik van transgene vissen waarbij gonadotropin-releasing hormoon (GnRH) neuronen genetisch zijn gelabeld met groen fluorescerend eiwit voor identificatie in de intacte hersenen. Vissen hebben meerdere populaties van GnRH neuronen en hun functies zijn afhankelijk van de plaats binnen de hersenen en GnRH gen dat ze expressie ^1. We hebben onze demonstratie gericht op GnRH3 neuronen in de terminal zenuwen (TN) van het te reukbollen met de intacte hersenen van transgene vis medaka (Figuur 1B en C). Studies suggereren dat medaka TN-GnRH3 neuronen zijn neuromodulatory, als een zender van informatie uit de externe omgeving aan het centrale zenuwstelsel; they niet een directe rol spelen in het reguleren hypofyse-gonadale functies, net als de bekende hypothalamus GnRH1 neuronen ^{2, 3.} De tonic patroon van spontane actiepotentiaal afvuren van TN-GnRH3 neuronen is een intrinsieke eigenschap ^4-6, de frequentie waarvan wordt gemoduleerd door visuele signalen van soortgenoten ² en het neuropeptide kisspeptin 1 ^5. In deze video, gebruiken we een stabiele lijn van transgene medaka waarin TN-GnRH3 neuronen drukken een transgenbevattende de promotor regio van Gnrh3 gekoppeld aan verbeterde groen fluorescerend eiwit ⁷ te laten zien hoe je neuronen identificeren en controleren hun elektrische activiteit in de gehele hersenen voorbereiding ^6.

Protocol

1. Dissectie van Brains uit Adult Medaka

Verdoven volwassen mannelijke of vrouwelijke (figuur 1A) door onderdompeling in 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), en wacht een paar minuten na de kieuwen bewegingen voordat onthoofden hebben opgehouden. Alle procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Californië-Los Angeles.
Onthoofden de vis in zoutoplossing bij het staarteinde van de operculum met schaar 60 mm petrischaal.
Transfer vis kop op een 35-mm petrischaal, half gevuld met vis zoutoplossing en bekleed met Sylgard dat een depressie bij deze in stand en zet het hoofd voor de hersenen dissectie heeft. Positie en zet het hoofd dorsale-side up met insecten pinnen.
Snijd voorzichtig het dorsale gedeelte van de schedel rond de omtrek met fijne schaar en verwijder deze voorzichtig met een pincet, het blootstellen van het dorsale gedeelte van de hersenen volledig met inbegrip van het voorste deel van het ruggenmerg.
Til het ruggenmerg voorzichtig met fijn-tip pincet en verbreken de bilaterale verbindende zenuwen met fijne punt schaar: hersenzenuwen, spinale zenuwen, en oogzenuwen aan de buikzijde van de hersenen, en de olfactorische zenuwen op het voorste deel van de hersenen.
Plaats de volledig ontleed hersenen in een frisse petrischaal gevuld met vis zout en controleer zorgvuldig onder de microscoop om ervoor te zorgen het hele brein intact is (inclusief de hypofyse) zonder enige sneden of lekken. Beschadigde hersenen worden niet gebruikt voor experimenten.

2. Montage van de hersenen in een opname Kamer

Plaats een kleine druppel cyanoacrylaat of een andere snelwerkende lijm met een naald in het midden van de opname kamer en verspreid de lijm ongeveer 1 cm ^2.
Snel de de hersenen en lijm deze vast in een ventrale-side up positie.
Voeg 1 ml zoutoplossing vis zodat vult de opname kamer en bedekt de hersenen. Continu perfuserende hersenen met beluchte vis zoutoplossing met een snelheid van ten minste 200 ul / min.
Met behulp van de fine-tip pincet verwijder voorzichtig de hersenvliezen over het oppervlak van de opname gebied van de hersenen.

3. Elektrofysiologie

Losse patch opname van actiepotentiaal afvuren
1. Glazen micro-elektroden (6-10 MQ) zijn gemaakt van borosilicaatglas pipetten (1B150F-4, World precisie-instrumenten) met behulp van een elektrode trekker (bijv. Sutter P-87), en terug gevuld met de losse-patch opnameoplossing halverwege de electrode.
2. Met behulp van een rechtop fluorescentiemicroscoop met een gekoelde charge-coupled device (CCD) camera, vind de GFP-expressie TN-GnRH3 neuronen via 10x (Figuur 1B), dan 40x onderdompeling doelstellingen water (figuur 1C). Ze bevinden zich op of nabij het ventrale oppervlak van de reukkwabben, anterieure het telencefalon.
3. Overschakelen naar een video-monitor die is het verstrekkenreal-time beelden van de microscoop naar het TN-GnRH3 neuron cluster (figuur 1C) te lokaliseren.
4. Plaats de micro-elektrode in het bad dat de punt van de elektrode boven het doelwit neuron. Toepassen constante lichte positieve druk op de micro-elektrode zodat het verstopt raken en rustiger manier het doelwit neuron met de punt van de elektrode.
5. Controleren en bewaken de elektrode weerstand in voltage-clamp modus met behulp AxoGraph software en versterker Axoclamp 200B met Axograph software (Axon Instruments). Als je kunt zien op de video-monitor dat het uiteinde van de elektrode is op het oppervlak van het neuron en van de AxoGraph scherm dat de weerstand verandert iets, laat de positieve druk en oefen lichte negatieve druk indien nodig op een lage weerstand afdichting te maken op het neuron (<100 MQ).
6. Schakel over naar de huidige-clamp-modus, en noteer de membraan spanning continu zonder stroom ingang, het aanpassen van de schaalspanning en snelheid van registratie indien nodig. Gegevens worden verzameld en geanalyseerd door Powerlab software (ADInstruments Inc).
7. Record basislijn elektrische activiteit in normale zoutoplossing vis ongeveer 5 minuten voor elke behandeling (Figuur 2A). Bath perfusie van geneesmiddelen, hormonen, peptiden, enzovoort. toegevoegd aan vissen zoutoplossing verder met een snelheid van 200 pl / min, gevolgd door een uitwasperiode in normale zoutoplossing vis ^{5, 6, 11.}
Gehele cel opnemen van membraanpotentiaal
De gehele cel patch clamp elektrofysiologie procedure is dezelfde als die van de extracellulaire losse patch opname hierboven beschreven procedure van stap 3.1.1 - 3.1.4. Dan wijken de procedures dienovereenkomstig:
1. Controleren en bewaken de elektrode weerstand in voltage-clamp-modus. Als je kunt zien op de video-monitor dat het uiteinde van de elektrode is op het oppervlak van het neuron en van de oscilloscoop die de weerstand verandert iets, los van de positievedruk en met een beetje negatieve druk om een hoge weerstand zegel op het neuron (~ 3 Giga Ω) te maken. Solliciteer zachte zuigkracht via de mond te scheuren de gepatchte membraan, je zal een plotselinge daling van de weerstand tot ongeveer 120-250 MQ zien.
2. Schakel over naar de huidige-clamp-modus, en noteer de membraan spanning continu zonder stroom ingang, het aanpassen van de omvang van de spanning en snelheid van opname indien nodig.
3. Record basislijn elektrische activiteit in normale zoutoplossing vis ongeveer 5 minuten voor een behandeling, zoals beschreven in 3.1.7 (figuur 2B).