Stereotactische injectie van een virale vector voor voorwaardelijke Gene Manipulation in de muis Spinal Cord

Samenvatting

Virale vectoren kunnen gerichte genetische manipulatie. We tonen een werkwijze voor voorwaardelijke genexpressie of ablatie in de muis ruggenmerg, met stereotactische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn, een prominente plaats van synaptische contacten tussen primaire somatosensorische afferenten en neuronen van het centrale zenuwstelsel.

Samenvatting

Intraparenchymale injectie van een virale vector kan afhankelijk genmanipulatie in verschillende populaties van neuronen of bepaalde delen van het centrale zenuwstelsel. We tonen een stereotactische injectie techniek gerichte genexpressie of silencing in de dorsale hoorn van het ruggenmerg kan muis. De chirurgische procedure is kort. Het vereist laminectomie van een enkele wervel, die voorziet in een snel herstel van het dier en ongeschonden beweeglijkheid van de wervelkolom. Gecontroleerde injectie van een kleine vector schorsing volume bij lage snelheid en het gebruik van een micro-met afgeschuinde glazen canule minimaliseren het weefsel laesie. De lokale immuunrespons op de vector hangt af van de intrinsieke eigenschappen van de gebruikte virus, in onze ervaring is klein en kort als een recombinant adeno-geassocieerd virus wordt gebruikt. Een reportergen zoals versterkt groen fluorescent eiwit vergemakkelijkt controle ruimtelijke verdeling van de vector en de werkzaamheid en cellulaire specificity van de transfectie.

Inleiding

Geavanceerde technologieën voor voorwaardelijke genmanipulatie in de muis kan veelzijdige benaderingen van de exploratie van synaptische paden en functionele verbindingen in het centrale zenuwstelsel. Transgenen kan worden geregeld door kleine molecule effectoren zoals doxycycline die op een door tetracycline gecontroleerde transactivator, die kunnen worden ontworpen om als een repressor of activator van gentranscriptie, tamoxifen of herkennen van een gemuteerd ligand-bindend domein van de oestrogeen receptor ¹ . Onomkeerbare transgene modificatie wordt meestal bereikt door desoxyribonucleïnezuur (DNA) recombinases. Cre (oorzaken recombinatie) en Flp (flippase recombinatie enzym) katalyseren de excisie, inversie of translocatie van DNA-fragmenten die worden geflankeerd door loxP (locus of kruising x over, P1) of Frt (flippase erkenning doel) sites, respectievelijk ^1. Toepassingen omvatten genactivering of silencing en induceerbare ribonucleïnezuur (RNA) interferentie ^{2. Conditionele expressie van fluorescerende of enzymatische reporters zoals β-galactosidase of alkaline fosfatase kan worden gebruikt om neuronen labelen en onderzoek naar de actuele organisatie en verbinding 3. Grootschalige projecten mutagenese in Noord-Amerika ( http://www.norcomm.org/index.htm ) en Europa ( http://www.knockoutmouse.org/about/eucomm ) produceren van bibliotheken van muis embryonale stamcellen klonen met conditionele gen doelen en valkuilen die uiteindelijk de gehele muis genoom. Muizen gegenereerd uit deze klonen kunnen worden gekruist met een toenemend aantal muizenlijnen die uitdrukken DNA recombinases onder promoters of loci specifiek voor een bepaalde populatie neuronen voor selectieve genmanipulatie ( http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/index . php ).}

evenwel beperkt genmanipulatie tot afzonderlijke populaties van neuronen of bepaalde gebieden plaats niet worden bereikt door genetische richten alleen als een promotor specifiek voor de populatie neuron plaats niet bekend is of niet die door alle neuronen in de regio van belang. In het ruggenmerg kan experimenteel ontwerpen vereisen ruimtelijke beperking van de genetische manipulatie een of twee craniocaudale segmenten. Stereotactische injectie van een virale vector die Cre of Flp expressie kan beperken gen recombinatie regio in het ruggenmerg van muizen waarbij DNA-fragmenten worden geflankeerd door loxP of Frt sites, zogenaamde floxed of flrted allelen. In tegenstelling tot de constitutieve DNA herschikking, die zou voortvloeien uit kruisingen van de dieren met recombinase uitdrukken muizen, deze strategie biedt ook tijdelijke controle over gen-activatie of silencing. Virale vectoren die coderen floxed of flirtte transgenen bieden een omgekeerde optie van genetische manipulatie in muizen die het corresponding recombinase stroomafwaarts van een neuron-specifieke promoter. Verschillende recombinante vectoren met affiniteit voor neuronen zijn ^4. Hoge capaciteit (laf) adenovirus, adeno-geassocieerd virus, herpes simplex virus en lentivirus worden gebruikt neurotrope vectoren. Het selecteren van de juiste virus voor een onderzoeks-vraag is een cruciaal onderdeel van de experimentele opzet. Grootte van het transgen levering route, specificiteit van de infectie neuronen in tegenstelling tot gliacellen, infectie efficiëntie, ontstekings-en toxische bijwerkingen moeten worden overwogen ^4.

Hier beschrijven we de stereotaxische injectie van een virale vector in de dorsale hoorn van het ruggenmerg, een techniek die we gebruiken voor voorwaardelijke genregulatie in ons onderzoek naar de neurobiologie van pijn. De dorsale hoorn ontvangt afferente input van primaire somatosensorische neuronen inclusief nociceptieve neuronen. Lokale interneuronen verwerken de informatie voordat projectie neuronen het overbrengen vande dorsale hoorn naar de hersenen ^5. We demonstreren de infectie van dorsale hoorn neuronen spinale segmentale niveau L4 met een neurotrope recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) die versterkt groen fluorescent eiwit (EGFP) tot expressie brengt onder een constitutief actieve promoter cytomegalovirus.

Protocol

De beschreven chirurgische procedure is goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) van Columbia University.

1. Voorbereiding van apparatuur en Virus deeltjessuspensie

1. Reinig en desinfecteer de apparatuur, steriliseren van de chirurgische instrumenten en de V notch spikes die zullen worden gebruikt om de wervel L1 op te lossen.
2. Trek en schuine glazen pipetten. Wij gebruiken pipetten die een tip diameter van 40 urn en afgeschuind onder een hoek van 20 °. Steriliseer de glazen pipetten.
3. Stel de stereotactische frame, monteer de micro-injector op de manipulator en sluit de injector naar de controller.
4. Bevestig een van de glazen pipetten om de micro met behulp van de compressie montageset.
5. Verwijder de zuiger uit de micro en vul de spuit met minerale olie. Oil Red O (1 - (2,5-dimethyl-4-(2,5-dimethylphenylazo) fenylazo)-2-naftol) worden toegevoegd aan de minerale olie de v verhogenisibility. Plaats de zuiger en duw het helemaal naar de top. Zorg ervoor, het creëren van een luchtbel.
6. Bereid het virusdeeltje suspensie in een bioveiligheid kast. Ontdooi de bevroren virus op ijs en vlak voor gebruik te verdunnen met steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing om de gewenste deeltjesconcentratie.
7. Plaats de micro in de houder op de injector.
8. Pipetteer 5 ul van de virus suspensie op een plastic plaat, bijv. Parafilm. Laat de glazen pipet tip in de drop en trek de zuiger naar de micro te vullen. Maak een kleine luchtbel in de pipetpunt om te voorkomen dat verstopping.

2. Laminectomie

1. Bereid de operatie gebied schoon door bank en verwarming pad met een desinfecterend middel.
2. Verdoof de muis. We maken gebruik van inhalatie-anesthesie met isofluraan (3% tijdens de inductie, 2% -3% tijdens onderhoudswerkzaamheden).
3. Plaats glijmiddel op elk oog om de ogen te beschermen tegen uitdrogen tijdens dewerking.
4. Scheren de vacht van de lagere naar de hals van de muis en ontsmet de huid met afwisselende doekjes van een topisch antisepticum zoals chloorhexidine of povidon-jood en 70% ethanol. Isoleer de aseptisch bereide site met chirurgische doek en infiltreren de incisie site met bupivacaïne (0,25%, 1:10 verdund met een fysiologische zoutoplossing).
5. Insnijden van de huid aan het caudale einde van de ribbenkast langs de middellijn (2-3 cm) en scheid de fascia die de wervelkolom.
6. Omdat het ruggenmerg stopt met groeien eerder tijdens de postnatale ontwikkeling dan wervelkolom, spinale segment L4 ligt onder de eerste lendenwervel (L1). Wervel L1 ligt caudaal van de wervel dat de laatste paar ribben heeft. Identificeer en bloot wervel L1 door het verwijderen van de kleine spinale spieren en ligamenten gehecht aan zijn dorsale oppervlak.
7. Iets optillen en wervel L1 vast te houden met een Adson tang. Gebruik een speciale laminectomie een tang om de dorsale portio verwijderenn van de wervel (wervelkolom en lamina) en bloot het ruggenmerg. Voorkom beschadiging van het ruggenmerg.
8. Breng de muis op de verwarmingsplaat in de stereotactische frame. De temperatuur van de muis tijdens de volgende bewerking.

3. Injectie

1. Fix wervel L1 met V inkeping spikes. De spikes moeten stabiliseren de wervelkolom, zodat de wervels niet beweegt tijdens de ademhaling.
2. Breng de micro-dichter, zodat de pipet tip is boven de laminectomie site. Laat de zuiger totdat u de virussuspensie het verlaten van de pipet. Verwijder de druppel met een steriele wattenstaafje.
3. Plaats de pipetpunt in de rostrale meest deel van de blootgestelde ruggenmerg. Centreer de pipet boven de achterste mediaan sulcus, verplaats dan de tip 500 um lateraal. Laat de tip naar het oppervlak van het snoer en prik de dura mater, of, als u werkt met een unbeveled glazen pipet, een afgeschuinde stalen canule gebruiken om het doorprikken van de dura. Laat de uiteinde van de glazen pipet 300 pm in het ruggenmerg.
4. Injecteer 1 pl virussuspensie met een snelheid van 200 nl / min.
5. Aan het einde van de injectie, wacht tenminste 2 min voordat langzaam terugtrekken van de pipet.
6. Herhaal stap 3,3 tot 3,5 bij de caudale grootste deel van de blootgestelde ruggenmerg volledige verdeling van de virale vector in spinale segment L4 bereiken. De twee injectieplaatsen liggen rostrale en caudale van het segment L4 tot weefselschade in het doelgebied voorkomen.

4. Wondsluiting

1. Op de markt wervel L1 van de V notch klemmen en verwijder de muis van de stereotactische frame.
2. Hecht het fascia met 5,0 Vicryl. De gesloten fascia biedt dekking voor de laminectomie site.
3. Sluit de huid met nylon hechtingen of chirurgische nietjes.

5. Postoperatieve zorg

1. Breng de muis om een ​​herstel kooi met zachte, nonparticular beddengoed. Plaats het op thij kant voor comfortabele ademhaling. Bewaak het dier totdat het volledig alert, ambulante en begint te drinken.
2. Wij postoperatieve analgesie gedurende 72 uur met dagelijkse subcutane injecties van carprofen (5,0 mg / kg).
3. Monitor postoperatieve herstel door dagelijkse inspectie voor de eerste 3 dagen, daarna om de dag of 3 dagen per week tot het experiment is voltooid.
4. Verwijder de huid hechtingen of nieten 7 tot 10 dagen na de operatie, bij wondgenezing is voltooid.
5. Euthanaseren het dier na afloop van het experiment.

Resultaten

Succesvolle transfectie levert robuuste genexpressie in neuronen van de geïnjecteerde dorsale hoorn (Figuur 1), sparen de dorsale hoorn van de contralaterale zijde, de ventrale hoorn en de dorsale wortel ganglia.

Figuur 1. Transfectie van dorsale hoorn neuronen. (A) Expressie van het fluorescerende reporter EGFP (groen) in de linker dorsale hoorn van het ruggenmerg L4, twee weken na ster...

Discussie

Stereotactische injectie vector kan gericht ruggenmerg neuronen voor toepassingen zoals neuronale netwerk mapping op basis transsynaptic virusverspreiding ^6,7 of optogenetic dissectie ^8, axon begeleiding tijdens regeneratie van letsel ^9,10 of gentherapie voor de preventie of behandeling van neurodegeneratie ^{11, 12.} Virale vectoren zijn gebruikt voor genetische manipulatie in het ruggenmerg te bestuderen somatosensorische, motorische en autonome wegen ^9,10,13-15. De ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materiaalnaam	Vennootschap	Catalogus nummer
Spinal bodemplaat	David Kopf Instrumenten	912
Klein dier stereotaxische instrument	David Kopf Instrumenten	900
Muis gas narcose hoofd houder	David Kopf Instrumenten	923-B
Verstelbare voet mounts	David Kopf Instrumenten	982
V notch spikes	David Kopf Instrumenten	987
Kleine dieren temperatuur controle systeem	David Kopf Instrumenten	TCAT-2LV
Adson forceps	Fine Science Tools	11.006-12
Laminectomie tang	Fine Science Tools	11.223-20
UltraMicroPump (een) met SYS-Micro4 Controller	Wereld Precisie-instrumenten	UMP3-1
Micro-injectiespuit, 65RN	Hamilton	7633 tot 01
RN knelkoppeling, 1 mm	Hamilton	55.750-01
Borosilicaatglas haarvaten	Wereld Precisie-instrumenten	1B100F-4
Microgrinder	Narishige	EG-44