Methodenartikel

Langdurige zwijgen van Intersectin-1s in Muis Longen door Herhaalde levering van een specifiek siRNA via kationische liposomen. Evaluatie van Knockdown Effects van Electron Microscopy

10.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50316

⸱

21 juni 2013

 ,  , 
1Department of Pharmacology, Rush University, 2Pulmonary and Critical Care Department, Rush University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Herhaalde retro-orbitale injectie van kationische complexen liposomes/siRNA/ITSN-1s in muizen, elke 72 uur gedurende 24 dagen, efficiënt siRNA duplex leveren aan de muizenlong microvasculatuur verminderen ITSN 1s-mRNA en eiwitexpressie met 75%. Deze techniek is zeer reproduceerbaar in een dierlijk model, heeft geen bijwerkingen en sterfgevallen voorkomt.

Samenvatting

Eerdere studies toonden aan dat knockdown van ITSN-1s (KD ITSN), een endocytisch eiwit betrokken bij de regulering van long vasculaire permeabiliteit en endotheelcellen (EC) overleving, geïnduceerde apoptotische celdood, een belangrijk obstakel in de ontwikkeling van een celcultuur systeem met verlengde ITSN-1s inhibitie 1. Met behulp van kationische liposomen als dragers, we het tot zwijgen brengen van ITSN-1s-gen in de muis longen onderzocht door systemische toediening van siRNA gericht ITSN-1 gen (siRNA ITSN). Kationische liposomen bieden een aantal voordelen voor siRNA levering: veilig bij herhaalde toediening, immunogeen, niet giftig en gemakkelijk te produceren 2. Liposomen prestaties en biologische activiteit afhankelijk van hun grootte, lading, lipidensamenstelling stabiliteit, dosis en toedieningsroute 3 Here, efficiënte en specifieke KD ITSN in muizenlongen werd verkregen met een cholesterol en dimethyl dioctadecyl ammonium bromide combinatie. Intraveneuze leveringvan siRNA ITSN / kationische liposoom complexen tijdelijk neergehaald ITSN-1s eiwit en mRNA in muizenlongen op dag 3, die herstelde na nog eens 3 dagen. Profiterend van de kationische liposomen als een herhaalbare veilige drager, de studie verlengd voor 24 dagen. Dus, retro-orbitale behandeling met vers gegenereerd complexen werd toegediend elke 3e dag, induceren aanhoudende KD ITSN gehele studie 4. Muizenweefsels op verschillende tijdstippen na-siRNA ITSN verzameld werden onderworpen aan elektronenmicroscopie (EM) analyse van de effecten van chronische KD ITSN evalueren, long endotheel. Hoge-resolutie EM beeldvorming liet ons toe om de morfologische veranderingen veroorzaakt door KDITSN in de long vaatbed evalueren (dwz verstoring van de endotheliale barrière, verminderd aantal caveolae en opregulatie van alternatief vervoer routes), kenmerken niet-detecteerbaar met lichtmicroscopie. Algehele deze bevindingen opgericht een belanglangrijke rol van ITSN-1s in de EC-functie en de longen homeostase, terwijl ter illustratie van de effectiviteit van de levering siRNA-liposomen in vivo.

Inleiding

Naakte siRNA bij ondoordringbare het celmembraan, wordt negatief geladen, en gemakkelijk wordt afgebroken door enzymen in het bloed, weefsels en cellen. Zelfs met recent structurele modificaties optimale stabiliteit, siRNA accumulatie op de aanbrengplaats na toediening uiterst laag en vereist een efficiënte intracellulaire voertuig 5. Kationische liposomen ontwikkeld tot veilige nucleïnezuren dragers met de mogelijkheid om grote stukken DNA / RNA te brengen in cellen door inkapselen en beschermen van de nucleïnezuren van enzymatische afbraak 6. Ook kationische liposomen spontaan interactie met DNA / RNA, waardoor genoverdracht bevorderen om de cellen 2. Meer recent liposomen toegepast op vaccins en laag molecuulgewicht drugs 7 leveren. Liposomale aflevering van microRNA-7-expressie plasmide overwint epidermale groeifactor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistentie in longkankercellen 8. Bij het richten van devasculair endotheel, de intraveneuze levering is essentieel omdat de complexen is onwaarschijnlijk dat de endotheliale barrière te passeren en extravaseren in het interstitium 9. In vergelijking met andere organen, EC uit de capillairen van de longen hebben de grootste opname en gretig kationische liposoom internaliseren en DNA / RNA complexen, gevolgd door de lymfeknopen en Peyer's Patches 9. Intraveneuze levering in knaagdier modellen van siRNA via retro-orbitale of staartader injecties is bewezen onschadelijk, zelfs in hoge concentraties, zoals 50 mg / kg 10. In de gepubliceerde literatuur de samenstelling van kationische liposomen verschilt op basis van de lipiden formulering en hun equimolaire verhouding 11, 12. Er is een breed scala aan mogelijke toepassingen met behulp van kationische liposomen voor genafgifte in vivo, of richten down-regulation/over-expression van de eiwitten, levering van vaccins of anti-tumor therapie 13-15. Belangrijk om te onthoudenis dat de efficiëntie van DNA / RNA-celmembraan interactie wordt geregeld door de vorm koppeling tussen gegenereerd complexen en membraanlipiden. Dit suggereert dat het afstemmen van de lipiden samenstelling gerichte celmembraan profielen hoge transfectie gunstige en resulteren kan in een bepaald celtype 6.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Kationische liposomen Voorbereiding

  1. Autoclaaf een schone rondbodemkolf worden gebruikt lipososmes bereiding.
  2. Bereid voorraad oplossingen:
    1. - Los 200 mg dimethyl dioctadecyl ammonium bromide (doab) in 10 ml chloroform met een klein glazen flesje.
    2. - Los 200 mg cholesterol in 10 ml chloroform met een kleine glazen fles.
    3. - Voorbereiden en autoclaaf tot 5% glucose steriliseren in 100 ml van RNA / DNA-ase vrij gedistilleerd water.
  3. Spoel de rondbodemkolf met chloroform. Voeg 5-10 ml op de kolf, werveling, en laat het zitten voor enkele minuten. Laat de kolf af met aluminiumfolie allen tijde. Leeg de chloroform uit de kolf.
  4. Bereiding van liposomen:
    1. - Voeg 315 ul van Doab voorraad oplossing voor de rondbodemkolf.
    2. - Voeg 200 ul van cholesterol voorraadoplossing aan de kolf.
    3. - Voeg 9,5 ml chloroform aan de kolf eennd meng door werveling.
  5. Stel de rotavapor bij 37 ° C, 100 omwentelingen per minuut (rpm) of meer (100-120 rpm). De rotavapor moet worden aangesloten op een water-vacuum regeling met zuigbuis goed is bevestigd.
  6. Sluit de argon gas tank en de rotavapor.
  7. Bevestig de kolf aan de rotavapor en de optimale instellingen aan te passen wanneer u ze in het waterbad. Open de eerste klep voor de argon helemaal door naar links te draaien. Altijd open en dicht deze klep eerst. De tweede klep regelt de argondruk waait in de kolf. De druk moet altijd zacht.
  8. Verlaag de rotavapor in het waterbad, genoeg voor de kolf aan het water raken zonder volledig ondergedompeld en zet de snelheid.
  9. Wacht totdat het chloroform verdampt, ongeveer 10 minuten. Vervolgens stopt u de machine.
  10. Schakel de rotavapor snelheid en de argon tankafsluiters. Nu de kolf moet worden verwijderd.
  11. Voeg 2 ml 5% glucose te stee kolf aan de lipiden te ontbinden.
  12. Krassen op de bodem van de kolf grondig met 1 ml pipet tip om alle lipiden te ontbinden. Na het krassen, verwijder alle resterende lipiden uit de 1 ml tip in de kolf, indien nodig, met een tweede tip.
  13. Incubeer de verkregen oplossing in 42 ° C waterbad terwijl langzaam vortexen (15 rpm) de kolf.
  14. Vul het sonicator vat met koud water. Sonificeer de oplossing gedurende ten minste 20-30 min met de kolf opgehouden en de onderkant nog net aanraken van het water.
  15. De kolf in een waterbad van de rotavapor voor 20 min bij 42 ° C, in de nulstand, met ronde bodem ondergedompeld in water, deze keer.
  16. Filter de liposomen door een 0,47 micron en vervolgens, 0,22 micron spuit filters.
  17. Met een kleine extruder, filter de liposomen door een 50 nm membraan een homogene populatie van unilamellaire liposoom blaasjes genereren.
  18. Breng de liposomen om een ​​Eppendorf buis en plaats het op het ijs.

2. Bereid de Liposomen: siRNA-ITSN-1 Complexen

  1. Resuspendeer de on-target muis siRNA ITSN siRNA in buffer die 20 mM HEPES en 150 mM natriumchloride, pH 7,4, tot een uiteindelijke concentratie van 2 ug / ul. Houd het op het ijs alvorens te mengen.
  2. Bereid de liposomen: ITSN siRNA complexen in een verhouding van 8 nmol liposomen: 2 ug RNA (of 400 nmol liposomen: 100 ug siRNA ITSN). In deze studie, voegden wij 50 gl van siRNA ITSN van de stockoplossing (50 uM) aan 100 gl vers bereide liposomen met behulp van een RNA / DNA-ase vrij Eppendorf buis. Merk op dat de concentratie van siRNA ITSN is zeer belangrijk omdat een maximum van 150 ui mengsel bilateraal en retro-orbitale ingespoten in de muis mogelijk tegelijk.
  3. Houd het mengsel op ijs tijdens het wachten om de muizen te injecteren.

3. Muis retro-orbitale Vein Injectie (Interne Hoek van de oogkas)

jove_content "> Alle muizen experimenten werden goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het Rush University Institutional Animal Care en gebruik Comite.

  1. Verdoven de muis door intraperitoneale injectie van 50 mg / kg lichaamsgewicht ketamine en 5 mg / kg lichaamsgewicht xylazine (in de handel verkrijgbaar mengsel). Afhankelijk van het dier gewicht en leeftijd, stel de anesthesie volume en concentratie. De muizen in de studie muizen CD1 mannelijke muizen, 6-8 weken oud en weegt ongeveer 25 gram. De spuiten zijn tuberculine 1 ml type met de naald.
  2. Houd de muis oren met een hand vast en draai de muis naar beneden aan een kant aan de inwendige hoek van het oog bloot. Richt mediaal van de plica semilunaris; raak de oogbol.
  3. Benader de traan caruncle van het oog houden van de spuit met het mengsel bij een hoek van 45 graden in alle drie de assen.
  4. Injecteer langzaam het mengsel en laat de muis te herstellen met de geïnjecteerde kant naar boven. Als een grote vloeistofdruppel vormen op de naald inbrengen plaats, trekken de naald, zuig weer de druppel in de spuit en probeer het opnieuw. Herhaalde injecties zijn best gedaan door afwisselend de ogen, om een ​​perfecte herstel mogelijk te maken. Bij twijfel, kan deze techniek worden gecontroleerd door het injecteren blauwe kleurstof (50 pl, 0,5% kristalviolet in methanol) en het blootstellen van de muis longen naar de blauwe vasculatuur observeren.
  5. De muizen in deze studie werden elke 3e dag geïnjecteerd gedurende 3 weken zonder doden of nadelige effecten.

4. Muis Long perfusie en Tissue Collection voor Biochemische Studies

  1. Stel de peristaltische pomp te draaien op 1,5 ml / min.
  2. Bereid de instelling: ventilator, operatietafel, instrumenten, steriele wattenstaafjes, q-tips, strings, bekers, gedestilleerd water, gebalanceerde zout Hank's, tracer.
  3. Verdoven de muis door intraperitoneale injectie van het anestheticum mengsel (100 mg / kg lichaamsgewicht ketamine en 10 mg / kg lichaamsgewicht xylazine).
  4. In de nek niveau, verwijder de speekselklieren en bloot de luchtpijp.
  5. Begin met laparotomie, accijnzen het middenrif, en volg met thoracotomie, het blootstellen van de longen en het hart.
  6. Verwijder de thymus.
  7. Met behulp van de lichtmicroscoop voor betere nauwkeurigheid, katheteriseren de longslagader.
  8. Doe tracheostomie en intuberen de muis met behulp van de tracheostoma. Zet de ventilator op een snelheid van 150 slagen / min en slagvolume van 150 pl.
  9. Zoals outlet, opent u het linker atrium.
  10. Perfuseren de muizenlong vaatstelsel vrij van bloed gedurende 5 min met behulp van de peristaltische pomp en Hank's oplossing opgewarmd tot 37 ° C.
  11. Perfuseren de tracer (8 nm goud-albumine 16) voor nog eens 10 minuten bij dezelfde stroomsnelheid.
  12. Spoel de ongebonden tracer door 5 min longperfusie met Hank's oplossing.
  13. Volgen met in situ fixatie van de longen door 10 min perfusie van 4% (gew / vol) formaldehyde, 2,5% glutaaraldehyde en 1% looizuur in 0,1 PIPESbuffer, pH 7,2.
  14. Verzamel de longen, verwijder de excessieve weefsel, snijd kleine blokjes (3/3 mm), en plaats ze in een gelabelde scintillatieflesje met 2 ml fixeermiddel mengsel.

De muizen zullen vervallen volledig verdoofd tijdens de procedure.

5. Muis longweefsel Processing voor EM

  1. Bereid voorraad oplossingen: 1% Palade OsO 4, acetaat veronal en Kellenberger buffer.
    1. - 1% Palade-OsO 4 buffer bevat: 1 ml acetaat veronal voorraad, 1,25 ml 4% OsO 4, 1 ml 0,1 N zoutzuur en gedestilleerd water tot 5 ml eindvolume.
    2. - Acetate veronal voorraad oplossing wordt verkregen door het oplossen van 1,15 g natriumacetaat andydrous en 2,94 g barbital in 100 ml gedestilleerd water.
    3. -Kellenberger oplossing bevat 2 ml acetaat veronal voorraad, 2,8 ml 0,1 N zoutzuur, 0,05 g uranylacetaat, en 5,1 mlgedestilleerd water, pH = 6.
  2. Was de long blokken in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer, pH = 7,4, 3 keer kort.
  3. Bevestig de specimens in de 4% (gew / vol) formaldehyde, 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 PIPES buffer, pH 7,2, gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  4. Post-fix met 1% osmium-Palade gedurende 1 uur in de kap, op ijs in het donker.
  5. Eenmaal spoelen met Kellenberger buffer.
  6. Incubeer specimens in Kellenberger buffer gedurende 2 uur tot overnacht bij kamertemperatuur.
  7. Keer spoelen in 50% ethanol.
  8. Dehydrateren met gegradeerde reeks van ethanol, 5 min / st: 70%, 95%, daarna 2 x 15 min 100% ethanol.
  9. Schakelen naar 100% propyleenoxide, 2 x 15 minuten.
  10. Verwijder het propyleenoxide en voeg een mengsel van 50% propyleenoxide en 50% EPON 812, incubeer overnacht, draaiend op een wiel, bij kamertemperatuur.
  11. Volgende ochtend, verwijder het mengsel en voeg verse EPON 812, althans voor 4-5 uur op het wiel.
  12. Gebruik verdubbeld conische vormen, gevuldhalverwege met verse 100% EPON 812, voeg geselecteerde exemplaren en plaats ze aan de randen.
  13. Bewegingssnelheid van de vormen van de incubator ingesteld op 60 ° C en laat ze uitharden 48-72 uur.
  14. Toen gepolymeriseerd, stuur de blokken te dun (60-70 nm dik) coupes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

ITSN 1s-eiwit en mRNA niveaus werden gevolgd op verschillende tijdstippen na siRNA ITSN bezorging Western blot conventionele en kwantitatieve PCR zoals in 4. ITSN-1s eiwit en mRNA niveaus in siRNA ITSN behandelde muis longen waren ongeveer 75% lager aan de hand van controles tijdens de continue neerhalen van ITSN-1s voor 21 dagen. Zonder ITSN-1s, dynamine-2, een belangrijke interactie partner van ITSN-1s en essentiële speler in onthechting van caveolae uit de plasmamembraan is niet effic...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Op basis van eerdere studies gepubliceerd door anderen 9 en ons 1, 18 we deze methodologie voor de lange termijn neerhalen van ITSN-1s in vivo door herhaalde intraveneuze toediening (om de 72 uur, gedurende 24 opeenvolgende dagen) van specifieke siRNA / liposoom complexen ontwikkeld. Deze experimentele benadering is efficiënt, veilig en herhaaldelijk gebruik en kan gemakkelijk worden uitgebreid om de betrokkenheid van een gen dat codeert voor een eiwit van interesse in de longen endotheel ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Institute of Health Subsidies R01HL089462 naar SP.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dimethyl Dioctadecyl Ammonium Bromide (DOAB)Sigma-AldrichD2779
LiposoFast stabilisator (mini-extruder)Avestin Inc.LF-STB
Polycarbonaatmembraan, 19 mm diameter, 50 nm poriënAvestin Inc.LFM-50
CholesterolSigma-AldrichC-8667
ChloroformMallinckrodt Chemicals4432-04
Hank's balanced saltsSigma-AldrichH1387
Flacon met ronde bodemFisher ScientificFHB-275-030X
Mouse siRNAITSN - on targetDharmacon/ThermoScientificJ-046912-11
PeristaltiekpompIsmatecREGLO-CDF digitaal met RHOO pompkop
VentilatorHugo Sachs ElectronikNA
BarbitaalSigma-AldrichB-0500
UranylacetaatEM Sciences22400
Epon812EM SciencesNiet meer verkrijgbaar door de fabrikant
PropyleenoxideEM Sciences20400
InbeddingsvormenEM Sciences69923-05
TanninezuurEM Sciences21710
8 nm goud-albumine tracerBereidt in het laboratorium zoals in16
Opmerkingen
Uitgerust met 2 Avestin 1 ml gasdichte spuiten (cat. # LF-1)
Pyrex, 100 ml
Gemodificeerde siRNA, in vivo
Onderdeel van IDEX corp.
D-79232 March, Duitsland
Vervangen door Embed812, cat. # 14120

Referenties

  1. Predescu, S. A., Predescu, D. N., Knezevic, I., Klein, I. K., Malik, A. B. Intersectin-1s regulates the mitochondrial apoptotic pathway in endothelial cells. J. Biol. Chem. 282 (282), 17166-17178 (2007).
  2. Uddin, S. Cationic lipids used in non-viral gene delivery systems. Biotechnology and Molecular Biology Review. 2 (2), 58-67 (2007).
  3. Barenholz, Y., et al. Influence of lipid composition on the thermotropic behavior and size distribution of mixed cationic liposomes. J. Colloid Interface Sci. (356), 46-53 (2011).
  4. Predescu, D. N., Neamu, R., Bardita, C., Wang, M., Predescu, S. A. Impaired caveolae function and upregulation of alternative endocytic pathways induced by experimental modulation of intersectin-1s expression in mouse lung endothelium. Biochem. Res. Int.. (2012), 672705(2012).
  5. Higuchi, Y., Kawakami, S., Hashida, M. Strategies for in vivo delivery of siRNAs: recent progress. BioDrugs. 24 (24), 195-205 (2010).
  6. Caracciolo, G., Amenitsch, H. Cationic liposome/DNA complexes: from structure to interactions with cellular membranes. Eur. Biophys. J. , (2012).
  7. Barnier Quer, C., Elsharkawy, A., Romeijn, S., Kros, A., Jiskoot, W. Cationic liposomes as adjuvants for influenza hemagglutinin: more than charge alone. Eur. J. Pharm. Biopharm. 81 (81), 294-302 (2012).
  8. Rai, K., et al. Liposomal delivery of MicroRNA-7-expressing plasmid overcomes epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor-resistance in lung cancer cells. Mol. Cancer Ther. (10), 1720-1727 (2011).
  9. McLean, J. W., et al. Organ-specific endothelial cell uptake of cationic liposome-DNA complexes in mice. Am. J. Physiol. (273), H387-H404 (1997).
  10. Soutschek, J., et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature. (432), 173-178 (2004).
  11. Barenholz, Y. Liposomes enhance bioremediation of oil-contaminated soil. J. Liposome Res. (13), 1-8 (2003).
  12. Zamboni, W. C. Liposomal, nanoparticle, and conjugated formulations of anticancer agents. Clin. Cancer Res. (11), 8230-8234 (2005).
  13. Newman, M. S., Colbern, G. T., Working, P. K., Engbers, C., Amantea, M. A. Comparative pharmacokinetics, tissue distribution, and therapeutic effectiveness of cisplatin encapsulated in long-circulating, pegylated liposomes (SPI-077) in tumor-bearing mice. Cancer Chemother Pharmacol. (43), 1-7 (1999).
  14. Martino, S., et al. Efficient siRNA delivery by the cationic liposome DOTAP in human hematopoietic stem cells differentiating into dendritic cells. J. Biomed. Biotechnol. (2009), 410260(2009).
  15. Zhang, G., et al. A delivery system targeting bone formation surfaces to facilitate RNAi-based anabolic therapy. Nat. Med. 18 (18), 307-314 (2012).
  16. Predescu, D., Palade, G. E. Plasmalemmal vesicles represent the large pore system of continuous microvascular endothelium. Am. J. Physiol. (265), H725-H733 (1993).
  17. Koh, T. W., Verstreken, P., Bellen, H. J. Dap160/intersectin acts as a stabilizing scaffold required for synaptic development and vesicle endocytosis. Neuron. (43), 193-205 (2004).
  18. Miyawaki-Shimizu, K., et al. Lung Cell Mol. Physiol. (290), L405-L413 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Intersectin 1s knockdownsiRNA afleveringlongendotheelretro orbitale injectieWestern blot analyseQ RT PCRliposoompreparatieendotheelbarri re

Gerelateerde artikelen