GST-Zijn zuivering: een twee-staps Affiniteitszuivering Protocol Meegevende Full-length gezuiverde eiwitten

Samenvatting

In het huidige protocol, demonstreren we een zeer efficiënte en kosteneffectieve kleinschalige eiwitreiniging methode, die de zuivering van recombinante eiwitten mogelijk maakt door de unieke combinatie van een splitsbaar GST-tag en een kleine His-tag.

Samenvatting

Toets assays Enzymology de biochemische karakterisatie van eiwitten in vitro noodzakelijk hoge concentraties van het gezuiverde eiwit van belang. Eiwitzuivering protocollen te efficiency, eenvoud en kosteneffectiviteit ¹ combineren. Hier beschrijven we de GST-His Werkwijze nieuw kleinschalig affiniteit zuiveringssysteem voor recombinante proteïnen, op basis van een N-terminale Glutathion Sepharose tag (GST) ^2,3 en een C-terminaal tag 10xHis ^4, die beide gefuseerd het eiwit van belang. De laatste construct wordt gebruikt om baculovirussen genereren voor infectie van Sf9-geïnfecteerde cellen voor eiwitexpressie ^5. GST is een vrij lange tag (29 kDa) die dient om de zuivering efficiëntie te garanderen. Toch kan het fysiologische eigenschappen van het eiwit te beïnvloeden. Daarom is het vervolgens afgesplitst het eiwit met het enzym PreScission ^6. Om maximale zuiverheid te verzekeren en de gesplitste GST te verwijderen, wevoegde een tweede affiniteitszuiveringsfase gebaseerd op de relatief kleine His-tag. Belangrijk is onze techniek waarbij twee verschillende labels aan weerszijden van de twee uiteinden van het eiwit, dat een efficiënt middel om gedegradeerde eiwitten te verwijderen en bijgevolg verrijkt full-length eiwitten. De hier gepresenteerde methode heeft een dure instrumentale setup, zoals FPLC niet nodig. Daarnaast hebben we opgenomen _MgCl2 en ATP wast om heat shock protein onzuiverheden en nucleasebehandeling afschaffen verontreinigende nucleïnezuren te verwijderen. Samengevat, de combinatie van twee verschillende labels weerszijden van de N-en C-terminale en de mogelijkheid om splitsen van een van de labels, garandeert het herstel van een sterk gezuiverd en full-length eiwit van belang.

Inleiding

De zuivering van recombinante eiwitten is cruciaal om fundamentele vragen in de biochemie aan te pakken. Gebruikelijke manieren eiwitzuivering zoals ionenuitwisselingschromatografie en gelfiltratie afhankelijk fysische eigenschappen van het doeleiwit zoals de iso-elektrische punt en heffingen of grootte, respectievelijk. Deze proteïne kenmerken gedeeld door een verscheidenheid van eiwitten, die aanzienlijk de kans verontreinigende proteïnen in gebruikelijke eiwitzuivering strategieën toe. Dit probleem kan worden omzeild door het gebruik van meerdere kolommen zuivering, hetgeen tijdrovend. Tegelijkertijd, deze chromatografie methoden vereisen dure experimentele opstelling. Affiniteit-zuivering tag sterk toeneemt doel-specificiteit, zoals in de meeste gevallen het label uniek het eiwit van belang zijn. In recente studies is vlag-of HA-affiniteitszuivering grote schaal gebruikt.

In tegenstelling tot bestaande recombinant eiwitzuivering protocollen waarin enkele tags worden gebruikt, hebben we de unieke combinatie van twee tags. Onze werkwijze omvat de fusie van een GST-tag aan de N-terminus en een His-tag aan het C-uiteinde van het eiwit van belang, voor een optimale verhouding tussen de hoeveelheid en zuiverheid van het gewenste eiwit. De GST is een lange markering (29 kDa), die zeer efficiënt voor zuivering op glutathion Sepharose kralen. Bovendien gebruiken GST garandeert kosteneffectiviteit van onze methode ^1. De mogelijkheid splitsen van de GST met PreScission enzym (met herkenningssequentie LeuGluValLeuPheGln / GlyPro, waardoor de toevoeging van twee aminozuren) heeft vele voordelen, bijvoorbeeld, en vermijdt veranderingen van de fysiologische functies eiwit door allosterische belemmering. De kleine His-tag gefuseerd met het andere eiwit uiteinde dient in een tweede zuiveringsstap eiwit zuiverheid te verhogen door het wassen van de gesplitste GST, alsmede afgebroken eiwitten en andere verontreinigingen. Bovendien wordt het protocol geen dialyse stap nodig bij het overschakelen van de GST naar de kolom Zijn-zuiveringsstap (TALON hars). Gemeenschappelijke verontreinigingen dergelijke zuiveringswerkwijzen zijn heat shock eiwitten (HSP). De toevoeging van een incubatiestap met _MgCl2 en ATP maakt de verwijdering van deze verontreinigingen (figuur 1).

Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC) en High Performance Liquid Chromatography (HPLC) zijn gangbare technieken die afhankelijk zijn van dure instrumentatie hoge opbrengst van het gezuiverde eiwit van belang te genereren. De batch zuiveringsprotocol hier geïntroduceerde daarentegen is handmatig en niet dure instrumentele opstelling vereist. Een hoge opbrengst van eiwit kan worden bereikt door het opschalen van het protocol. Tegelijkertijd, partijnummer zuiveringsprotocol, het elutievolume kan worden aangepast om eiwitconcentratie, die niet wordt gegeven met FPLC en HPLC verbeteren.

ntent "> Ook, partijnummer GST-His zuiveringsprotocol, eiwitten met een grootte-bereik van ~ 10-300 kDa kunnen worden gezuiverd. Een van de grootste voordelen is gegeven door het feit dat een aantal eiwitten kunnen zuiveren tegelijkertijd bijvoorbeeld, zowel wild-type en de mutante eiwitten. Het succes van de gepresenteerde protocol alleen afhankelijk van het expressieniveau en de oplosbaarheid van het eiwit van belang.

Protocol

1. Productie van Recombinant Baculovirus

Baculovirussen worden gegenereerd met de Bac-to-Bac Baculovirus Expression System van Invitrogen voornamelijk volgens protocol van de fabrikant met slechts geringe wijzigingen:

1. Een gewijzigde pFastBac 1 vector (Gibco, leven) werd opgericht met de GST en His-labels (figuur 2). De multikloneringsplaats (MCS) van een PET-52b (+) vector (Novagen), met daarin een 10xHis-tag, werd ingebracht in de MCS van een pFastBac 1 vector om pFastBac 1-Strep-10xHis genereren. De pET-52b (+) MCS sequentie werd met PCR geamplificeerd tussen de Xbal en Blpl restrictieplaatsen, het toevoegen van een BglII-restrictieplaats aan het 5'-uiteinde en een HindIII restrictieplaats aan het 3 'uiteinde. Het PCR product werd vervolgens gekloneerd tussen HindIII en BamHI restrictieplaats van pFastBac 1, waarbij de verenigbaarheid van BamHI en BglII restrictie sequenties. Aangezien het doel was om een ​​pFastBac 1 die de expressie van genererenrecombinant eiwit met streptavidine-en 10xHis-labels, de BamHI restrictieplaats van de PET-52b (+) MCS sequentie werd niet gebruikt. Ook werd het Xbal restrictieplaats niet gebruikt om de redundantie van restrictieplaatsen die tussen de plaatsen reeds in de MCS van pFastBac 1 en deze ingebracht met de MCS van pET-52b (+) voorkomen. De GST coderende sequentie met de website PreScission Protease erkenning (LeuGluValLeuPheGln / GlyPro) werd vervolgens in pFastBac 1-Strep-10xHis. De GST cDNA sequentie van pGEX-6P-2 (GE Healthcare) werd PCR geamplificeerd met primers die NcoI en KpnI-restrictieplaatsen aan het 5 'en 3' uiteinden respectievelijk. De NcoI-plaats kan de toevoeging van een startcodon maar ook een alanine aan het GST. Het PCR product werd vervolgens gekloneerd in pFastBac 1-Strep-10xHis tussen de NcoI en KpnI-restrictieplaatsen, waardoor het verwijderen van de Streptavidine-tag. De aldus verkregen nieuwe fusievector werd genoemd pFastBac 1-GST-10xHis.
2. Kloon het cDNA dat codeert voor het protein van belang in de pFastBac-GST-10xHis vector tussen de GST (N-terminal) en de His-tag (C-terminal). Let op de cDNA stopcodon verwijderen om de fusie met het C-terminale His-tag mogelijk.
3. Transform E. DH10Bac coli met het recombinante pFastBac (verkregen bij stap 1.2) aan de bacmide genereren. Laat kolonies overnacht groeien bij 37 ° C en enige uren bij 30 ° C op selectieplaten met Bluo-gal en IPTG (10 ug / ml tetracycline, 50 ug / ml kanamycine, 7 ug / ml gentamycine, 100 ug / ml Bluo- Gal, 40 pg / ml IPTG).
4. Pick en restreak 2 witte kolonies (uit stap 1.3) over de selectie platen om de witte fenotype bevestigen.
5. Inoculeer 2 ml LB dat 10 ug / ml tetracycline, 50 ug / ml kanamycine, 10 ug / ml gentamycine met de twee witte kolonies van stap 1.4 en laat ze gedurende de nacht groeien onder schudden (250 rpm) bij 37 ° C.
6. Om de bacmide DNA zuiveren pellet bacteriën van stap 1.5,resuspendeer de cellen in 300 ul van oplossing I en voeg 300 ul van oplossing II (Maxiprep kit van Qiagen). Incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, voeg 300 pl 3 M KOAc pH 5,5 en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Centrifugeer de monsters bij 4 ° C, maximale snelheid gedurende 10 minuten. Voeg 800 ul isopropanol aan de supernatanten en incubeer gedurende 10 minuten op ijs. Centrifugeer de monsters gedurende 15 min bij 4 ° C en was het pellet met 500 ui 70% ethanol. Laat het pellet droog en resuspendeer het onder steriele omstandigheden in 40 pl Tris-EDTA pH 8,0. De bacmide DNA moet bij 4 ° C worden bewaard
7. Genereer baculovirussen zoals beschreven in het protocol van de fabrikant. Baculovirussen kan worden opgeslagen bij 4 ° C beschermd tegen licht.

2. Recombinante eiwitexpressie

1. Om de meest efficiënte baculovirus voor zuivering kiezen en te controleren hoe laat de piek van eiwitexpressie wordt bereikt, voert een mini-infectie assay eens volgt: Infect 2 x 10 ⁷ van Sf9 geïnfecteerde cellen gekweekt bij 27 ° C in Grace's medium (aangevuld met 10% FBS en 1% P / S) met 133 pl (1/150) van baculovirus. Verzamel fracties van 1,5 ml bij 0, 24, 48 en 72 uur na infectie. Pellet de cellen en de expressie van het eiwit van belang door western blotting met behulp van anti-tag antilichamen te analyseren.
2. Gebruik de meest efficiënte baculovirus van stap 2.1 een spinner die 1,0 x 10 ⁶ Sf9 cellen per ml in 500 ml medium in een verhouding van 1/150 tussen virus en media infecteren. Laat de geïnfecteerde cellen groeien in suspensie bij 27 ° C en oogst de cellen wanneer de maximale eiwitexpressie (zoals bepaald in stap 2.1) wordt bereikt. Gepelleteerde cellen worden opgeslagen bij -80 ° C tot verder gebruik.

3. Bereiding van oplosbaar cellysaat

Alle volgende incubatiestappen worden uitgevoerd bij 4 ° C uitgevoerd onder milde rotatie.

1. Lyse Sf9 cellen die de proteïne van belang in ~ 20 ml GST bindingsbuffer (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% Triton-X-100, 1 mM DTT PBS1X een eindconcentratie van NaCI van 250 mM, en proteaseremmer cocktail (Roche). In een ijswaterbad, dounce de oplossing 20x met een dounce homogeniseerapparaat, ultrasone trillingen 3x 30 seconden (70% vermogen), en Dounce weer 20x.
2. (Optioneel). Incubeer de totale cellysaat met 1 mM _MgCl2 en Benzonase ⁷ nuclease (2,5 U / ml) gedurende 30 min bij 4 ° C aan DNA of RNA verontreiniging te verwijderen.
3. Centrifugeer bij 18.000 rpm gedurende 30 min bij 4 ° C. Houd de bovenstaande vloeistof.
4. (Optioneel). Centrifugeer de supernatant opnieuw voor 30 min bij 18.000 rpm bij 4 ° C om een ​​heldere oplosbare lysaat krijgen. Passeren de bovenstaande vloeistof op een 0,2 of 0,45 pm filter om verstopping te voorkomen.

4. Binding van eiwit op GST Beads

1. Incubeer de oplosbare cellysaat met 1 ml GST-parels (vooraf gewassen tweemaal met10 ml GST bindingsbuffer) gedurende 1 uur bij 4 ° C onder voorzichtige rotatie.

Opmerking: De incubatietijd moet worden geoptimaliseerd overeenkomstig de stabiliteit van het eiwit en bindingsefficiëntie.

2. Snel centrifugeren op 700 toeren per minuut en supernatant die ongebonden eiwitten (dit kan voor verdere analyse worden bewaard). Was de GST-gebonden eiwitten (Figuur 3B, baan 1) met GST wasbuffer (GST binding buffer met 350 mM NaCl definitief).
3. Herhaal stap 4.2 2x. Bij de laatste wasbeurt, verwijder zoveel supernatant mogelijk.
4. Incubeer de kralen met 5 mM ATP en 15 mM _MgCl2 (in 10 ml GST bindingsbuffer) gedurende 1 uur bij 4 ° C te voorkomen specifieke binding van heat-shock eiwitten ^8. Was de kralen drie keer met GST wasbuffer.

5. PreScission Splitsing van GST

1. Centrifugeer de GST kralen, verwijder het supernatant en was de GST kralen met P5 buffer (50 mM NaHPO ₄ pH 7,0, 500 mM NaCl, 10% glycerol, 0,05% Triton-X-100, 5 mM imidazool).
2. Incubeer de GST-parels PreScission enzym in P5 buffer van 3 uur tot overnacht bij 4 ° C. (Verdeel het GST kralen in fracties van 100 ui en voeg 4-8 eenheden (2-4 pl) enzym verdund in 100 pl buffer P5).

Opmerking: De incubatietijd van de PreScission stap moet worden geoptimaliseerd volgens het molecuulgewicht en de stabiliteit van het eiwit. Indien wordt waargenomen, kan de incubatietijd nachts worden verlaagd tot ten minste 2 uur in plaats van.

3. Snelle draai en verzamel de bovenstaande vloeistof. Herhaal deze stap tweemaal na toevoeging van 100 ui P5 buffer op de kralen en bundelen alle fracties (Figuur 3B, baan 2).

Opmerking: De resterende parels worden gebruikt voor analyse van splitsing efficiëntie (Figuur 3B , baan 3). Meestal wordt 70-80% van het eiwit gesplitst.

6. -Eiwit binding aan TALON metaalaffiniteitshars

1. Verdeel de elutie van bovenaf in 3 fracties van 1 ml en incubeer elk met 100 ul Talon metaalaffiniteitshars droge parels (vooraf gewassen tweemaal met P5 buffer) gedurende 1 uur onder rotatie.

Commentaar: Het verdelen van de elutie in verschillende fracties verhoogt binding / wasbeurten efficiëntie.

2. Was de hars 5 minuten met P30 buffer (P5 buffer met een eindconcentratie van 30 mM imidazool).
3. Herhaal stap 6.2 2x en bundelen de kralen in een enkele buis. Vóór de laatste wasbeurt, verwijder zoveel supernatant mogelijk.

Commentaar: Dit komt overeen met de TALON gebonden monster (Figuur 3B, laan 4).

7. Elutie van het gezuiverde eiwit

1. Incubeer de eiwitgebonden TALON hars gedurende 5 minuten onder rotatie met P500 buffer (P5 buffer met een eindconcentratie van 500 mM imidazool). Gebruik een verhouding tussen buffer en kralen van 1:01 v / v. (Bijvoorbeeld, als je 200 pl droog kralen had genomen, moet je 200 ul P500 toevoegen). Herhaal deze stap twee keer en houden elkaar geëlueerde fractie afzonderlijk (genoemd elutie 1 (E1), elutie 2 (E2) en elutie 3 (E3); Figuur 3B, lanen 5-7).

Opmerking: De resterende parels worden gebruikt voor analyse van elutie efficiëntie (Figuur 3B, laan 8). Typisch wordt 60-80% van het eiwit geëlueerd in totaal.

2. Analyseer de kwantiteit en kwaliteit van uw gezuiverde eiwit door het laden van ongeveer 20-40 ul van elke fractie met een standaard BSA concentratie op een SDS-PAGE en vlek met Coomassieblauw (Figuur 3B) of SYPRO eiwit vlek voor visualisatie.

Commentaar: Het eiwit van belang kan ook worden thro gedetecteerdughout de zuiveringsprocedure met anti-GST en anti-His-antilichamen (Figuur 3C).

8. Opslag van het gezuiverde eiwit

1. Dialyseer het gezuiverde eiwit tegen een geschikte opslagbuffer (bijv. 20 mM Tris acetaat pH 8,0, 200 mM KAc, 10% glycerol, 1 mM EDTA, 0,5 mM DTT) bij 4 ° C. Het is belangrijk om te controleren op precipitatie van het gezuiverde eiwit gedurende de dialyse. We meestal dialyseren 2x gedurende 1 uur bij 4 ° C onder roeren rotatie.
2. Maak kleine hoeveelheden van het gezuiverde eiwit (10-20 pi) en bevriezing op droog ijs gedurende 30 minuten. Bewaar de monsters bij -80 ° C en voorkomen dat veel dooi / vries-cycli.

Resultaten

Teneinde de doelmatigheid van de GST-His zuiveringsprotocol illustreren we gezuiverd Rec14 een S. pombe eiwit van 32,9 kDa. De Rec14 cDNA werd gekloneerd in onze gemodificeerde pFastBac 1 vector waardoor de toevoeging van GST-en His-tag aan de N-en C-termini, respectievelijk (figuur 1A). Recombinant baculovirus werden vervolgens bereid en gebruikt om SF9 geïnfecteerde cellen te infecteren voor eiwitexpressie. De oplosbare cellysaten werden geïncubeerd met GST-parels en gebonden eiwitten werden ...

Discussie

De GST-His zuiveringsprotocol hier gepresenteerde geschikt voor de zuivering van een breed gebied van afmetingen van recombinant eiwit: We succesvol gezuiverd Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120kDa), PALB2 (130kDa), en een instabiele hoog molecuulgewicht eiwit Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) ^6,9. Bovendien, de eiwitten gezuiverd met dit protocol waren biochemisch actief ^6. Het succes van deze werkwijze hangt uitsluitend af van de expressie, oplosbaarheid en stabiliteit van het g...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
REAGENTS
E.Coli DH10Bac (competent)	Invitrogen
Bac-to-Bac Baculovirus Expression System	Invitrogen
Maxi Prep Kit	Qiagen	12163	Solution I en II
Ultra Pure Bluo-Gal	Gibco (Life)	15519028
IPTG	Gibco (Life)	15529019
Sf9 infected cells	ATCC	CRL-1711
PreScission enzyme	GE Healthcare	27084301
Grace's infected medium supplemented	Gibco (Life)	11605-094
Fetal Bovine Serum characterized	Hyclone	SH30396.03
P/S (Penicillin-Streptomycin)	Gibco (Life)	15070-063
Glutathione Sepharose resin	GE bioscience	17075605
Protease inhibitor cocktail	Roche	11873580001
Talon resin	Clontech	635504
Imidazole	BioShop	288324
Gentamicin	Gibco (Life)	15710064
Polyclonal GST-antibody	Production in house
Monoclonal 6X-His-antibody	Clontech	631212
EQUIPMENT
Dounce homogenizer (tight)	Wheaton	357546
Sonicator (Fisher dismembrator)	Fisher	Model 150
Dialysis bag (50 mm)	Fisher Scientific	2115217