Method Article

De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

DOI:

10.3791/50321

⸱

April 14th, 2013

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, The University of Connecticut Health Center, 2Department of Genetics and Developmental Biology, The University of Connecticut Health Center, 3Stem Cell Institute, The University of Connecticut Health Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze procedure levert telencephalic neuronen door door checkpoints die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in menselijke ontwikkeling. De cellen mogen spontaan differentiëren blootgesteld aan risicofactoren te duwen naar de neurale stam, geïsoleerd en uitgeplaat op dekglaasjes om voor terminale differentiatie en maturatie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier is een stapsgewijze procedure voor het efficiënt genereren telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen (PSC) beschreven. Het differentiatieproces wordt geïnitieerd door het breken van de menselijke loketten tot klonten die afgerond naar aggregaten wanneer de cellen worden geplaatst in een suspensiekweek. De aggregaten worden vervolgens gekweekt in medium hESC van dag 1-4 om voor spontane differentiatie. Gedurende deze tijd de cellen hebben het vermogen te worden elk van de drie kiembladen. Vanaf dag 5-8, werden de cellen in een neurale inductie medium te duwen in de neurale lineage. Rond dag 8 worden de cellen mag hechten op 6 well platen en gedurende welke tijd de cellen neuro vorm differentiëren. Deze neuro cellen kunnen worden geïsoleerd op dag 17. De cellen worden gehouden als neurosferen tot ze gereed zijn uitgeplaat op dekglaasjes. Met behulp van een basisch milieu, zonder enige caudalizing factoren, neuro-epitheliale cellen zijn specified in telencephalic voorlopers, die vervolgens verder kunnen worden onderscheiden in dorsale telencephalic voorouders en glutamaat neuronen efficiënt. Algemeen ons systeem een ​​hulpmiddel om menselijke glutamaat neuronen voor onderzoekers genereren om de ontwikkeling van deze neuronen en de ziekten die hen beïnvloeden bestuderen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke pluripotente stamcellen (PSC), zowel menselijke embryonale stamcellen (hESC ') en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), de capaciteit om elk celtype in het lichaam, waaronder neuronen 1-3 genereren. Gerichte differentiatie van verschillende neuronale subtypes van menselijke PSC heeft de sleutel voor de toepassing van deze cellen in de regeneratieve geneeskunde. De productie van functionele neuronale subtypes tijdens ontwikkeling een complex proces, waarbij de inductie van neurale stam, de specificatie van regionale progenitors langs de rostro-caudale as en de differentiatie van post-mitotische neuronen types van de regionale progenit....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generatie van menselijke pluripotente stamcellen Aggregaten (D1-D4)

  1. Menselijke pluripotente stamcellen zijn gekweekt op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeders in aanwezigheid van hESC medium aangevuld met basic fibroblast growth factor (bFGF, 4 ng / ml). Na 5-7 dagen kweken bij de kolonies groot, maar nog niet gedifferentieerd zijn ze klaar voor de volgende stap.
  2. De enzymoplossing moet eerst worden bereid. In een 50 ml buis ontbinden dispase (of collagenase) bij 1 mg / ml concentratie in DMEM/F12 medium. Omdat deze oplossingen te mengen best wanneer verwarmd, zet de buis met het medium en enzym in een 37 ° C waterbad gedurende 10-15 minute....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier een protocol differentiëren menselijke loketten in telencephalic glutamaat neuronen via verschillende belangrijke stappen: de vorming van aggregaten PSC, de inductie van neuroepitheliale cellen, de productie van telencephalic voorlopercellen, en de terminale differentiatie van deze stamcellen in telencephalic neuronen (Figuur 1) beschreven. Dit systeem is robuust en doeltreffend bij het genereren van telencephalic voorlopers en glutamaat neuronen. Als voorbeeld (figuur 2), zonder t.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende kritische stappen tijdens het neurale differentiatieproces. Het is belangrijk dat de menselijke loketten pluripotent zijn omdat anders de cellen al voorgespannen richting van een niet-neuronale oorsprong. Dit wordt bevestigd door het kleuren van de menselijke loketten met antilichamen tegen pluripotentie markers zoals Oct4, SOX2, NANOG en Tra-1-60 1-3. Als de menselijke PSC's niet goed hechten na passage hen kan ROCK inhibitor (Y27632) worden toegevoegd om te helpen. Voor diegenen di.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag Dr Y. Sasai bedanken voor royaal verstrekken van de FOXG1 antilichaam. Dit werk werd ondersteund door Connecticut Stem Cell Research Grants (08-SCB-UCHC- 022 en 11-SCB24) en spastische paraplegie Foundation.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)Gibco11330-032
Knockout Serum ReplacerGibco10828-028
L-glutamine (200 mM)Gibco25030
Non Essential Amino AcidsGibco1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M)SigmaM-7522
Neurobasal mediumGibco21103-049
N2Gibco17502-048
B27Gibco12587-010
HeparinSigmaH3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)Sigma116K5103
Laminin (human)SigmaL-6274
Laminin (mouse)Invitrogen23017-015
FBSGemini100-106
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA-7906
DispaseGibco17105-041
CollagenaseInvitrogen17104-019
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
ROCK InhibitorStemgent04-0012
SB431542Stemgent04-0010
DorsomorphinStemgent04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)Invitrogen13256-029
Trypsin inhibitorGibco17075
0.1% gelatinMilliporeES-006-B
Foxg1 antibodyDr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50)Developmental Studies Hybridoma BankI12
Pax6 antibody (1:5000)Developmental Studies Hybridoma BankPAX6
Nkx2.1 antibody (1:200)ChemiconMAB5460
Tbr1 antibody (1:2000)ChemiconAB9616
vGLUT1 antibody (1:100)Synaptic Systems135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF)PrepoTech Inc.450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF)PrepoTech Inc.450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1)PrepoTech Inc.100-11
Cyclic AMP (cAMP)SigmaD-0260
Sonic hedgehog (SHH)R&D1845-SH
50 ml tubesBecton Dickinson (BD)352098
15 ml tubesBD352097
6 well platesBD353046
24 well platesBD353047
T25 flasks (untreated)BD353009
T75 flasks (untreated)BD353133
CoverslipsChemiglass Life Sciences1760-012
6 cm Petri dishesBD353004
9'' glass pipetesFisher13-678-20D
Steriflip filters (0.22 μM)MilliporeSCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 μM)MilliporeSCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1)ZeissR2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150)Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance)The Baker Company
Centrifuge (5702 R)Eppendorf

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Telencephalic Glutamatergic NeuronsHuman Pluripotent Stem CellsNeural Induction MediumNeuroepithelial CellsNeurosphere FormationGlutamatergic Neuron DifferentiationFoxG1 ExpressionTBR1 MarkerVGLUT1 ExpressionImmunostaining Analysis

Related Articles