Methodenartikel

De Specificatie van Telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen

DOI:

10.3791/50321

⸱

14 april 2013

 ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, The University of Connecticut Health Center, 2Department of Genetics and Developmental Biology, The University of Connecticut Health Center, 3Stem Cell Institute, The University of Connecticut Health Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze procedure levert telencephalic neuronen door door checkpoints die vergelijkbaar zijn met die waargenomen in menselijke ontwikkeling. De cellen mogen spontaan differentiëren blootgesteld aan risicofactoren te duwen naar de neurale stam, geïsoleerd en uitgeplaat op dekglaasjes om voor terminale differentiatie en maturatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier is een stapsgewijze procedure voor het efficiënt genereren telencephalic glutamaat neuronen van menselijke pluripotente stamcellen (PSC) beschreven. Het differentiatieproces wordt geïnitieerd door het breken van de menselijke loketten tot klonten die afgerond naar aggregaten wanneer de cellen worden geplaatst in een suspensiekweek. De aggregaten worden vervolgens gekweekt in medium hESC van dag 1-4 om voor spontane differentiatie. Gedurende deze tijd de cellen hebben het vermogen te worden elk van de drie kiembladen. Vanaf dag 5-8, werden de cellen in een neurale inductie medium te duwen in de neurale lineage. Rond dag 8 worden de cellen mag hechten op 6 well platen en gedurende welke tijd de cellen neuro vorm differentiëren. Deze neuro cellen kunnen worden geïsoleerd op dag 17. De cellen worden gehouden als neurosferen tot ze gereed zijn uitgeplaat op dekglaasjes. Met behulp van een basisch milieu, zonder enige caudalizing factoren, neuro-epitheliale cellen zijn specified in telencephalic voorlopers, die vervolgens verder kunnen worden onderscheiden in dorsale telencephalic voorouders en glutamaat neuronen efficiënt. Algemeen ons systeem een ​​hulpmiddel om menselijke glutamaat neuronen voor onderzoekers genereren om de ontwikkeling van deze neuronen en de ziekten die hen beïnvloeden bestuderen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke pluripotente stamcellen (PSC), zowel menselijke embryonale stamcellen (hESC ') en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs), de capaciteit om elk celtype in het lichaam, waaronder neuronen 1-3 genereren. Gerichte differentiatie van verschillende neuronale subtypes van menselijke PSC heeft de sleutel voor de toepassing van deze cellen in de regeneratieve geneeskunde. De productie van functionele neuronale subtypes tijdens ontwikkeling een complex proces, waarbij de inductie van neurale stam, de specificatie van regionale progenitors langs de rostro-caudale as en de differentiatie van post-mitotische neuronen types van de regionale progenitoren 4,5. Vanaf 2001 zijn er verschillende systemen opgezet om neurale afstamming genereren uit hESC 's, die een platform hebben voor de volgende generatie van neuronale subtypes 6,7. Op basis ontwikkelingsprincipes verschillende types neuron zoals spinale motorische neuronen 8-12, midbrain dopaminerge neuronen 13-15, en neurale retinale cellen 16,17 zijn efficiënt opgegeven vanaf het menselijk PSC's. Dit werd gedaan door kritische morfogenen die belangrijk zijn voor de specificatie van deze types neuron tijdens in vivo ontwikkeling. Andere protocollen zijn ook ontwikkeld om de differentiatie van hESC 'via in neuronen met behulp van aanvullende factoren 18-20 zoals kleine moleculen of co-kweken met andere celtypen om differentiatie 21 bevorderen.

De menselijke neocortex is sterk ontwikkeld en bevat vele soorten cellen, met inbegrip van glutamaat neuronen die een belangrijke rol bij het ​​leren, het geheugen en cognitieve functies 22,23 af te spelen. De eerste stap in het genereren glutamaterge neuronen in cultuur te geven telencephalic progenitorcellen. Yoshiki Sasai groep voor het eerst gemeld de gerichte differentiatie van telencephalic voorlopers van muis SER (mESCs) met behulp van een serum-vrij suspension kweken in aanwezigheid van Dkk1 (die remt Wnt signalering) en LeftyA (die remt nodale signalering) 24. Vervolgens hebben verschillende groepen waaronder ons rapporteerden ook de specificatie van telencephalic precursors uit humaan PSC in serumvrij medium 25-27. De generatie van telencephalic precursors van menselijke PSC vereist niet het gebruik van exogene morfogenen en de efficiëntie in het genereren van deze precursors is veel hoger dan van mESCs 26,27. Hier is een chemisch welbepaalde systeem voor neurale inductie die goed werd opgericht door de groep Zhang's 7 is beschreven. Zonder de toevoeging van exogene caudalizing factoren, dit protocol genereert efficiënt telencephalic voorlopers van menselijke PSC's 27. Deze voorlopers kunnen dan worden onderscheiden in dorsale of ventrale voorouders door het reguleren van de signalering van Wnt en sonic hedgehog (SHH). De dorsale voorouders kan verder differentiëren in glutamaat neuronen efficiently 27. Daarnaast heeft dit protocol werkt ook goed voor het genereren van glutamaat neuronen van menselijke iPSCs 28, waardoor het genereren van patiëntspecifieke neuronen die kunnen worden gebruikt om het werkingsmechanisme en potentiële therapieën voor een groot scala aan ziekten verkennen . Bovendien ons systeem biedt ook een platform voor de ontwikkeling en specificatie van diverse types neuronale in het telencephalon verkennen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Generatie van menselijke pluripotente stamcellen Aggregaten (D1-D4)

  1. Menselijke pluripotente stamcellen zijn gekweekt op muis embryonale fibroblasten (MEF) feeders in aanwezigheid van hESC medium aangevuld met basic fibroblast growth factor (bFGF, 4 ng / ml). Na 5-7 dagen kweken bij de kolonies groot, maar nog niet gedifferentieerd zijn ze klaar voor de volgende stap.
  2. De enzymoplossing moet eerst worden bereid. In een 50 ml buis ontbinden dispase (of collagenase) bij 1 mg / ml concentratie in DMEM/F12 medium. Omdat deze oplossingen te mengen best wanneer verwarmd, zet de buis met het medium en enzym in een 37 ° C waterbad gedurende 10-15 minuten en vervolgens gesteriliseerd met behulp van een Steriflip filter.
  3. Zuig uit het medium van de cellen, spoel ze met DMEM/F12, en zuig dit dan ook uit. Voeg 1 ml dispase in elk putje en in de incubator gedurende 3-5 min voor hESC '(tot 10 min voor iPSCs). Kijken naar de cellen onder een microscoop, wanneerde randen iets opkrullen / zien er een beetje donkerder, de cellen zijn klaar voor de volgende stap. Het beste is om de cellen te controleren na 3 min en leg ze terug in indien nodig. Bij gebruik van dit protocol voor de eerste keer, het beste met slechts een plaat van cellen beginnen tegelijk, is het belangrijk om de cellen uit de dispase zo snel mogelijk.
  4. Zuigen van de dispase uit de cellen. Zachtjes (de cellen zijn erg kwetsbaar in dit stadium en weg van de plaat relatief gemakkelijk komen) voeg 1,5 ml DMEM/F12 medium aan elk putje om te spoelen de dispase. Zuigen van de DMEM/F12 en voeg 1,5 ml van hESC medium aan elk putje.
  5. Om los te maken en breken de cellen, plaats de punt van een 10 ml glazen pipet naar de rechterbenedenhoek van een goed (het aanraken van de cellen) en beweeg de pipet op en neer (verticaal) - de opwaartse stoke moet in de nabijheid om de procedure neerwaartse slag. Nadat de andere zijde van de put bereikt is, herhalen de horizontale directie.
  6. Zodra alle cellen in suspensie zijn, ze in 15 ml en centrifugeer bij 200 xg ze gedurende 2 minuten. Er moet een pellet van cellen op de bodem van de buis. Zuig uit het medium van boven de pellet.
  7. De grootte van de celkweek kolf die moeten worden gebruikt om de aggregaten in afhankelijk van de oorspronkelijke hoeveelheid cellen. Voor 6 putten (1 plaat) van hESC 's, een niet-weefselkweek behandeld T75 fles met 50 ml van hESC medium moet worden gebruikt. Breng de cellen van stap 1.6 de kolf en incubeer bij 37 ° C.
  8. Om te ontdoen van de celresten, moet het celmedium en kolf ongeveer 12 uur later vervangen. Om dit te doen, plaatst al het medium / cellen in een 50 ml buis naar beneden draaien van de cellen (200 xg gedurende 2 min), en zuig de oude medium. Voeg vervolgens 50 ml verse hESC medium aan de cellen, en plaats in een nieuwe T75 kolf. De cellen kunnen vervolgens dagelijks gevoerd volgens dezelfde procedure (tot dag 5).

2. Inductie van neuroepitheliale cellen (D5-D17)

  1. Breng de cellen / medium in een 50 ml buis en centrifugeer de cellen gedurende 2 min bij 200 x g. Vervolgens aspireren het supernatant en breng de cellen naar een nieuwe (niet behandeld weefselkweek) T75 kolf met 50 ml van neurale inductie medium (NIM).
  2. Zodra de cellen in NIM, moet de helft van het medium vervangen om de dag. De aggregaten moet groot genoeg om waar ze naar de bodem van een 50 ml conische buis op zichzelf na enkele minuten (geen centrifugatie vereist). Na 2-3 dagen in NIM (D7 D8-totaal) moeten de cellen klaar voor plaat. Laminine of foetaal runderserum (FBS) kan worden gebruikt om de cellen hechten aan de platen.
  3. Het aantal weefselkweek behandeld 6 well platen die nodig zijn afhankelijk van de dichtheid van de cellen elk aggregaat moet kunnen op de plaat groeien enkele dagen zonder aan een van de anderen. Gemiddeld de cellen van eenT75 fles levert ongeveer 4-6 6 goed platen ter waarde van cellen.
    1. Bij gebruik laminine, verdund in NIM tot 10-20 ug / ml het bekleden van de plaat met 6 putjes (~ 0,5 ml / putje). Na coating voor 2-3 uur, celaggregaten plaat op platen met 6 putjes (~ 20-30 aggregaten per well). Na de aggregaten hebben gehecht, voeg 1,5 ml van NIM.
    2. Bij gebruik FBS, een mengsel van 90% NIM en 10% FBS (1,5 ml / putje). Voeg 1,5 ml medium met de cellen in elk putje, schud de plaat heen en weer te spreiden de aggregaten, en laat de cellen om O / N hechten in een incubator. Zorg ervoor dat u het medium (2 ml / putje van NIM) veranderen de volgende ochtend aan de FBS te verwijderen.
  5. Na een dag of twee van zijn verguld, zal ieder aggregaat verspreid naar een monolaag vormen. Binnen een paar dagen, zal de centra van de meeste van deze cellen morfologisch lijken op zuilvormige cellen (langwerpig). Tijdens deze periode, wijzigt u de NIM om de andere dag. Sommige PSC lijnen (especially IPSC), kunnen vormen zuilvormige cellen minder efficiënt. Als dit gebeurt, kan de toevoeging van BMP en TGF remmers (Dorsomorphin 29, SB431542 19 bij 2 uM) gedurende fase 2 nuttig zijn.
  6. Rond dag 14-17, zal de zuilvormige cellen blijken compacter. Soms zijn deze cellen vormen ruggen of ringen met zichtbare lumen binnen. Naast de kolomvormige morfologie, cellen in dit stadium neuro markers zoals PAX6 en SOX1 12,26.
  7. Voor de isolatie kan beginnen moet men eerst onderzoeken cellen om te bepalen of er niet neuro cellen aanwezig. Een objectieve marker kan worden gebruikt om de niet-neuro kolonies geven. Deze kunnen vervolgens worden geëlimineerd door schrapen ze af met een pipet tip.

3. Generatie van Telencephalic voorouders (D17-D24)

  1. De middens van de kolonies bevatten de neuro cellen en worden geïsoleerd van de rest van de kolonie. Dit kan meteen micropipet en een steriele 1 ml gefilterd pipetpunt. Wanneer een kleine hoeveelheid druk wordt uitgeoefend op het centrale deel van de kolonie, tilt algemeen af ​​heel gemakkelijk. Wees voorzichtig niet te laten het buitenste gedeelte van de kolonie los ook. Als de centra koppig en niet loskomen als zodanig kunnen ze worden verwijderd door uitsnijden met behulp van een naald onder een microscoop in een steriele kap. Breng de centrale delen van de kolonies naar een 15 ml buis en draaien bij 200 xg gedurende 2 minuten.
  2. Het medium moet worden afgezogen van de cellen. Twee platen waarde van cellen kan vervolgens worden overgedragen aan een niet-weefselkweek behandeld T25 kolf met 10 ml van NIM met de toevoeging van B27 (zonder vitamine A, 1:50). Gebruik 5-10 ml medium per een plaat van cellen.
  3. Wanneer de cellen gezien de volgende dag worden ze als een bol uiterlijk. Het is noodzakelijk deze cellen over in een nieuwe kolf (in aanwezigheid van NIM en B27, 1:50) zoals vaak het perifere cellensluipen en die hechten aan de bodem van de kolf.
  4. De neurosferen moet dan in suspensie gekweekt gedurende een week met NIM aangevuld met B27 (1:50). Om celduurzaamheid bevorderen en proliferatie, cyclische AMP (cAMP, 1 uM) en insuline-groeifactor (IGF1, 10 ng / ml) worden toegevoegd aan het medium tijdens suspensiekweek. Op dit punt, de neurosferen bevatten telencephalic voorlopercellen (FOXG1 +) en zijn klaar om te worden uitgeplaat op dekglaasjes voor terminale differentiatie.

4. Verdere differentiatie in de Telencephalic Neuronen (D25 +)

    1. Bereid de poly-ornithine/laminin beklede dekglaasjes (in 24-well platen) voor het uitplaten van de cellen. Dekglaasjes worden eerst gereinigd en worden vervolgens bekleed met truc-ornithine (bij 0,1 mg / ml, 37 ° C, O / N, en opgeslagen in de vriezer).
      Poly-ornithine coating:
      1. Steriliseer de dekglaasjes: Plaats de dekglaasjes in eenbeker die salpeterzuur en voorzichtig in de zuurkast schud gedurende een uur. Giet het salpeterzuur, meerdere malen afspoelen met DI-water, en laat de dekglaasjes onder stromend DI water gedurende tenminste 15 minuten. Plaats de dekglaasjes in 95% ethanol en schud gedurende 30 minuten (bij gebruik direct) of opslag in ethanol bij kamertemperatuur.
      2. In een steriele kap, giet de inhoud van de buis met 50 ml gesteriliseerd dekglaasjes in de deksel van een 6-well plaat. Gebruik een steriele tang, pick-up een dekglaasje op een moment en zet rechtop in een putje van een 24-wells plaat. Herhalen zodat elk putje een dekglaasje heeft.
      3. Nadat ze volledig droog, tikt u op de platen tot dekglaasjes zijn gevallen flat in elk putje. Voeg vervolgens 100 pl poly-ornithine (0,1 mg / ml in steriele dH 2 O) aan elk dekglaasje en incubeer de platen O / N bij 37 ° C.
      4. De volgende dag verwijderd platen uit de incubator en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur. Verstuif poly-ornithine af van elkaar dekglaasje (vanaf de rand van thij dekglaasje) en zorg ervoor niet aan te raken of de dekglaasjes krassen in het proces. Laat de coverslips drogen gedurende ongeveer 30 minuten voor het wassen.
      5. Voeg 1 ml steriel dH 2 O goed aan elk laten staan ​​gedurende 10 min, en zuig het water uit elk putje. Herhaal deze wasstap nog twee keer. Nadat de platen drogen, (verlof dekt af in de kap) plaats de deksels op, dek af met aluminiumfolie en bewaar bij -20 ° C.
      1. Het bekleden van de dekglaasjes met laminine, voeg 50 ul van een mengsel van neurale differentiatiemedium en laminine (uiteindelijke concentratie van 20 ug / ml) aan elk poly-ornithine behandeld dekglaasje zorg dat alleen de vloeistof raken dekglaasje zelf (en niet morsen uit). Incubeer ze bij 37 ° C gedurende 1-2 uur voor het bereiden van de cellen voor bevestiging.
  2. Verzamel en centrifugeer de neurosferen bij 200 xg gedurende 2 minuten in een 15 ml buis. Zuig het supernatant.
    1. Spoel de cellen met DMEM-F12 en opnieuw gecentrifugeerd cellen. Als de neurosferen te groot om goed hechten, kunnen ze gescheiden in Accutase ten deze stap.
    2. Bij gebruik Accutase: Na wassen van de cellen met DMEM-F12, de neurosferen worden gescheiden van kleine clusters door toevoeging Accutase (~ 2 ml) en de cellen te incuberen bij 37 ° C gedurende 3 minuten. Voeg vervolgens dezelfde hoeveelheid trypsine inhibitor (~ 2 ml) en gecentrifugeerd bij 200 xg cellen gedurende 3 minuten. De cellen moeten vervolgens geresuspendeerd in NDM en gebroken met een P200 pipet. De kleine clusters kan vervolgens worden uitgeplaat op vooraf beklede dekglaasjes.
  4. Zuigen van de meerderheid van het medium en zet de cellen op een 6 cm Petrischaal in een paar druppels medium zodat ze gemakkelijker te selecteren. Voeg ongeveer 4-5 neurosferen aan elke pre-coated dekglaasje aan. Er is geen behoefte om te zuigen uit de laminine eerste.
  5. Laat de neurosferen hechten ten minste 2-4 uur. Zodra ze eengoed ttached, moet meer medium (0,5 ml / dekglaasje) worden toegevoegd. Het moet bestaan ​​uit neurale differentiatie medium aangevuld met B27 (1:50), cAMP (1 uM), en neurotrofe factoren (BDNF, GDNF en IGF, alle bij 10 ng / ml). Op dit punt helft van het medium kan worden om de andere dag en deze cellen kunnen gedurende meerdere maanden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier een protocol differentiëren menselijke loketten in telencephalic glutamaat neuronen via verschillende belangrijke stappen: de vorming van aggregaten PSC, de inductie van neuroepitheliale cellen, de productie van telencephalic voorlopercellen, en de terminale differentiatie van deze stamcellen in telencephalic neuronen (Figuur 1) beschreven. Dit systeem is robuust en doeltreffend bij het genereren van telencephalic voorlopers en glutamaat neuronen. Als voorbeeld (figuur 2), zonder t...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn verschillende kritische stappen tijdens het neurale differentiatieproces. Het is belangrijk dat de menselijke loketten pluripotent zijn omdat anders de cellen al voorgespannen richting van een niet-neuronale oorsprong. Dit wordt bevestigd door het kleuren van de menselijke loketten met antilichamen tegen pluripotentie markers zoals Oct4, SOX2, NANOG en Tra-1-60 1-3. Als de menselijke PSC's niet goed hechten na passage hen kan ROCK inhibitor (Y27632) worden toegevoegd om te helpen. Voor diegenen di...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen graag Dr Y. Sasai bedanken voor royaal verstrekken van de FOXG1 antilichaam. Dit werk werd ondersteund door Connecticut Stem Cell Research Grants (08-SCB-UCHC- 022 en 11-SCB24) en spastische paraplegie Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dulbecco's modified eagle medium with F12 nutrient mixture (DMEM/F12)Gibco11330-032
Knockout Serum ReplacerGibco10828-028
L-glutamine (200 mM)Gibco25030
Non Essential Amino AcidsGibco1140-050
2-Mercapt–thanol (14.3 M)SigmaM-7522
Neurobasal mediumGibco21103-049
N2Gibco17502-048
B27Gibco12587-010
HeparinSigmaH3149
Poly-L-ornithine hydrobromide (polyornithine)Sigma116K5103
Laminin (human)SigmaL-6274
Laminin (mouse)Invitrogen23017-015
FBSGemini100-106
Bovine serum albumin (BSA)SigmaA-7906
DispaseGibco17105-041
CollagenaseInvitrogen17104-019
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
ROCK InhibitorStemgent04-0012
SB431542Stemgent04-0010
DorsomorphinStemgent04-0024
Fibroblast growth factor 2 (FGF2, bFGF)Invitrogen13256-029
Trypsin inhibitorGibco17075
0.1% gelatinMilliporeES-006-B
Foxg1 antibodyDr. Y. Sasai
Hoxb4 antibody (1:50)Developmental Studies Hybridoma BankI12
Pax6 antibody (1:5000)Developmental Studies Hybridoma BankPAX6
Nkx2.1 antibody (1:200)ChemiconMAB5460
Tbr1 antibody (1:2000)ChemiconAB9616
vGLUT1 antibody (1:100)Synaptic Systems135302
Brain derived neurotrophic factor (BDNF)PrepoTech Inc.450-02
Glial derived neurotrophic factor (GDNF)PrepoTech Inc.450-10
Insulin growth factor 1 (IGF1)PrepoTech Inc.100-11
Cyclic AMP (cAMP)SigmaD-0260
Sonic hedgehog (SHH)R&D1845-SH
50 ml tubesBecton Dickinson (BD)352098
15 ml tubesBD352097
6 well platesBD353046
24 well platesBD353047
T25 flasks (untreated)BD353009
T75 flasks (untreated)BD353133
CoverslipsChemiglass Life Sciences1760-012
6 cm Petri dishesBD353004
9'' glass pipetesFisher13-678-20D
Steriflip filters (0.22 µM)MilliporeSCGP00525
Stericup filters 1,000 ml (0.22 µM)MilliporeSCGPU10RE
Phase contrast microscope (Observer A1)ZeissR2625
Carbon dioxide incubator (Hera Cell 150)Thermo Electron Corporation
Biosafety hood (Sterilgard III Advance)The Baker Company
Centrifuge (5702 R)Eppendorf

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Takahashi, K., Tanabe, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  2. Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  3. Yu, J., Vodyanik, M. A., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  4. Jessell, T. M. Neuronal specification in the spinal cord: inductive signals and transcriptional codes. Nat. Rev. Genet. 1, 20-29 (1038).
  5. Wilson, S. I., Edlund, T. Neural induction: toward a unifying mechanism. Nat. Neurosci. 4, 1161-1168 (2001).
  6. Reubinoff, B. E., Itsykson, P., et al. Neural progenitors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1134-1140 (2001).
  7. Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 19, 1129-1133 (2001).
  8. Hu, B. Y., Weick, J. P., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 4335-4340 (2010).
  9. Singh Roy, N., Nakano, T., et al. Enhancer-specified GFP-based FACS purification of human spinal motor neurons from embryonic stem cells. Exp. Neurol. 196, 224-234 (2005).
  10. Lee, H., Shamy, G. A., et al. Directed differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived motoneurons. Stem Cells. 25, 1931-1939 (2007).
  11. Boulting, G. L., Kiskinis, E., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 29, 279-286 (2011).
  12. Li, X. J., Du, Z. W., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, 215-221 (2005).
  13. Perrier, A. L., Tabar, V., et al. Derivation of midbrain dopamine neurons from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 12543-12548 (2004).
  14. Roy, N. S., Cleren, C., et al. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat Med. 12, 1259-1268 (2006).
  15. Yan, Y., Yang, D., et al. Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes from human embryonic stem cells. Stem Cells. 23, 781-790 (2005).
  16. Meyer, J. S., Shearer, R. L., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 16698-16703 (2009).
  17. Osakada, F., Ikeda, H., et al. Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 26, 215-224 (2008).
  18. Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. Enrichment of neurons and neural precursors from human embryonic stem cells. Exp. Neurol. 172, 383-397 (2001).
  19. Chambers, S. M., Fasano, C. A., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat. Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
  20. Chambers, S. M., Qi, Y., et al. Combined small-molecule inhibition accelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cells into nociceptors. Nat. Biotechnol. 30, 715-720 (2012).
  21. Kawasaki, H., Mizuseki, K., et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron. 28, 31-40 (2000).
  22. Rubenstein, J. L., Beachy, P. A. Patterning of the embryonic forebrain. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 18-26 (1998).
  23. Hevner, R. F., Hodge, R. D., Daza, R. A., Englund, C. Transcription factors in glutamatergic neurogenesis: conserved programs in neocortex, cerebellum, and adult hippocampus. Neurosci. Res. 55, 223-233 (2006).
  24. Watanabe, K., Kamiya, D., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, 288-296 (2005).
  25. Watanabe, K., Ueno, M., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 25, 681-686 (2007).
  26. Pankratz, M. T., Li, X. J., et al. Directed neural differentiation of human embryonic stem cells via an obligated primitive anterior stage. Stem Cells. 25, 1511-1520 (2007).
  27. Li, X. J., Zhang, X., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136, 4055-4063 (2009).
  28. Zeng, H., Guo, M., et al. Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 5, e11853(2010).
  29. Kim, D. S., Lee, J. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Rev. 6, 270-281 (2010).
  30. Zhang, X., Huang, C. T., et al. Pax6 is a human neuroectoderm cell fate determinant. Cell Stem Cell. 7, 90-100 (2010).
  31. Stern, C. D. Initial patterning of the central nervous system: how many organizers. Nat. Rev. Neurosci. 2, 92-98 (2001).
  32. Ma, L., Hu, B., et al. Human embryonic stem cell-derived GABA neurons correct locomotion deficits in quinolinic acid-lesioned mice. Cell Stem Cell. 10, 455-464 (2012).
  33. Li, W., Wei, W., et al. Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors. Cell Stem Cell. 4, 16-19 (2009).
  34. Lowry, W. E., Richter, L., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from dermal fibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2883-2888 (2008).
  35. Dimos, J. T., Rodolfa, K. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321, 1218-1221 (2008).
  36. Ebert, A. D., Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
  37. Lee, G., Papapetrou, E. P., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
  38. Park, I. H., Arora, N., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  39. Chamberlain, S. J., Chen, P. F., et al. Induced pluripotent stem cell models of the genomic imprinting disorders Angelman and Prader-Willi syndromes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 17668-17673 (2010).
  40. Kiskinis, E., Eggan, K. Progress toward the clinical application of patient-specific pluripotent stem cells. J. Clin. Invest. 120, 51-59 (2010).
  41. Koch, P., Tamboli, I. Y., et al. Presenilin-1 L166P mutant human pluripotent stem cell-derived neurons exhibit partial loss of gamma-secretase activity in endogenous amyloid-beta generation. Am. J. Pathol. 180, 2404-2416 (2012).
  42. Walsh, R. M., Hochedlinger, K. Modeling Rett syndrome with stem cells. Cell. 143, 499-500 (2010).
  43. Egawa, N., Kitaoka, S., et al. Drug Screening for ALS Using Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cells. Sci. Transl. Med. 4, (2012).
  44. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates. Nature Reviews Drug Discovery. 3, 711-716 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neuraal inductiemediumneuroepitheelcellenvorming van neurosferendifferentiatie naar glutamaterge neuronenFoxG1 expressieTBR1 markerVGLUT1 expressieimmunokleuringanalyse

Gerelateerde artikelen