Microfluïdische chip fabricage en methode om Influenza Detect

Samenvatting

Een geïntegreerde microfluïdische thermoplastische chip is ontwikkeld voor gebruik als een moleculaire diagnostische. De chip voert nucleïnezuur extractie, reverse transcriptase, en PCR. Werkwijzen voor het vervaardigen en gebruiken van een chip worden beschreven.

Samenvatting

Snelle en effectieve diagnostiek spelen een belangrijke rol in het controleren van infectieziekten door deze in staat effectieve behandeling van de patiënt en de behandeling. Hier geven we een geïntegreerde microfluïdische chip thermoplastische de mogelijkheid om influenza A virus in nasofaryngeale patiënt (NP) uitstrijkjes en zuigt amplificeren. Bij het laden van het monster, de microfluïdische apparaat voert sequentieel op-chip cellyse RNA zuivering en concentratie in de vaste fase extractie (SPE), reverse transcriptie (RT) en polymerase kettingreactie (PCR) in RT-PCR kamers, respectievelijk. Eindpunt detectie wordt uitgevoerd met behulp van een off-chip Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Voor randapparatuur, gebruikten we een injectiespuit pomp reagens en monsters rijden, terwijl twee dunne film verwarmingstoestellen werden gebruikt als warmtebron voor de RT en PCR kamers. De chip is ontworpen voor een laag en geschikt voor high throughput productie naar de Fabricati te verminderenop tijd en kosten. De microfluïdische chip biedt een platform voor allerlei virussen en bacteriën, alleen beperkt door veranderingen in ontwerp reagens om nieuwe pathogenen plaats detecteren analyseren.

Inleiding

Miljoenen doden zijn gemeld tijdens de drie grieppandemieën van de 20e eeuw ^1. Bovendien werd de meest recente grieppandemie uitgeroepen door de World Health Organization (WHO) ² in 2009, en vanaf 1 augustus 2010, 18.449 sterfgevallen werden gemeld door de WHO ^3. Deze pandemie toonde nogmaals de hoge belasting van besmettelijke ziekten, en de behoefte aan snelle en accurate detectie van influenza te vasten ziekte bevestiging, geschikt voor de volksgezondheid respons en effectieve behandeling ⁴ mogelijk te maken.

Er zijn verschillende methoden voor de diagnose gebruikte influenza, omvatten snelle immunoassays, direct fluorescent antigen testen (DFA) en virale kweekmethoden. Rapid immunoassays dramatisch niet gevoelig ^5-8, terwijl de andere twee methoden zijn arbeidsintensief en tijdrovend ^9. Moleculaire tests bieden meerdere voordelen, waaronder een korte doorlooptijd, hoge Sensitivity en hogere specificiteit. Verschillende commerciële entiteiten hebben gewerkt in de richting van een snelle moleculaire tests (ook wel nucleïnezuur tests of NAT) voor infectieziekten, en een aantal hebben influenza testen in hun pijpleidingen. Maar de meeste van hen vereisen off-chip monstervoorbereiding. Geen van de Clinical Laboratory Improvement Wijzigingen (CLIA) afgezien moleculaire tests monstervoorbereiding te nemen in de test cartridge of module.

Lab-on-a-chip technologie speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van point-of-care tests. Na de introductie van de eerste PCR chip in 1993 ¹⁰ zijn talrijke inspanningen aan het ontwikkelen nucleïnezuur test chips. Echter, slechts een paar van deze zijn geïntegreerd ruwe monstervoorbereiding met downstream versterking.

We hebben eerder aangetoond miniaturisatie van een vaste fase extractiekolom (SPE) in een plastic microfluïdische chip ¹¹ en de ontwikkelingment en optimalisatie van een continue stroom PCR chip ^12. Hier breiden we het eerdere werk van de SPE te integreren met RT-en PCR-stappen in een enkele chip voor klinische diagnostiek en blijk geven van haar vermogen om nucleïnezuren van de patiënt nasofaryngeale (NP) swabs en zuigt versterken.

Protocol

1. Chip Fabrication ¹²

1. Maak twee platen van Zeonex 690R pellets: verdelen 8-9 gram Zeonex pellets in het midden van een metaalplaat Verwarm de verwarmde pers bij 198 ° C gedurende 5 min, en vervolgens langzaam toe te passen druk tot 2500 psi nog 5 min. Om deze stap te voltooien, hebben we gebruik gemaakt van een Carver warme pers.
2. Embos de microfluïdische kanaal in de plaquette met een epoxy mal. Details over de matrijs fabricage elders ¹² (kanaalontwerp in Figuur 2b) beschreven: plaats een plaque op de epoxy matrijs; voorverwarmen ze op de verwarmde pers bij 157 ° C gedurende 10 min en vervolgens toepassen druk langzaam tot 1000 psi nog 10 minuten . Verwijder de plaque uit de mal met de hand of met behulp van een tang voordat het afkoelt. (Opmerking: draag thermische handschoenen tijdens deze stap.)
3. Boorgaten in het reliëf chip bij de inlaat, afvoerpoort en de uitlaat van de microfluïdische kanaal. We gebruikten een 1,25 mm diameter boor de drie gaten te maken.
4. Bond het reliëf chip met een andere plaque (boven): Was de chips met IPA, RNAse Away en gedeïoniseerd water in volgorde, droging en verwarm ze op de verwarmde pers bij 131 ° C gedurende 10 minuten en vervolgens op 350 psi nog eens 10 min.
5. Bevestig Nanoports bij de inlaat, afval en de uitlaatpoorten afzonderlijk met JB Weld Epoxy; uitharden gedurende 15 tot 24 uur volgens de fabrikant.
6. Spoel de SPE kanaal met 50 ul RNAse Away, gevolgd door 100 pi nuclease vrij water.
7. Plaats de SPE kanaal met 4 pi van het enten oplossing (methylmethacrylaat met 3% w / v benzofenon) en vervolgens verknopen van het methacrylaat incuberen gedurende 10 min in een oven onder UV 365 nm UV golflengte en 2000 mJ / cm ^2. Verwijder de resterende oplossing met vacuüm enten. We gebruikten de wand vacuum. Voor de beste resultaten moet een verse oplossing worden gebruikt. Het is meestal aanvaardbaar, maar naar een winkelbereide oplossing bij 4 ° C gedurende maximaal een week.
8. De SPE kolom oplossing (alle v / v%): 16% ethyleendimethacrylaat, 24% butylmethacrylaat, 42% 1-dodecanol, 18% cyclohexanol en voeg 1% 2-dimethylamino-4-(methyl-fenylamino)-fenol als foto-initiator.
9. Neem dezelfde hoeveelheid silica microsferen oplossing als de SPE kolom oplossing (een 1:1 mengsel te maken), en volledig droog bij 70 ° C overnacht in een vacuümoven. Breek de pellet door te tikken op de buis met gesloten deksel. Voeg de SPE kolom oplossing in de gedroogde silica microsferen buis en vortex om te mengen.
10. Plaats 4 ui van de SPE oplossing in hetzelfde kanaal en vervolgens verknopen door UV bestraling gedurende 2,5 min. Vervolgens draait u de chip over en bestralen nog eens 2,5 minuten. De gepolymeriseerde SPE kolom een ​​ondoorzichtige witte vaste stof zijn.
11. Was het kanaal met 500 pi van 100% methanol spoelen overtollige reactanten. Deze wash verwijdert ook intra-polymeer porogenic oplosmiddelen, waardoor de open poriestructuur van de SPE kolom wanneer gedroogd omgevingsomstandigheden.
12. Bevestig twee dunne-film verwarming aan de onderzijde van de chip met warmtegeleidende tape. De zijkanten van de verwarmers moeten worden gebracht met de rand van de brede kanalen voor denaturatie en annealing afzonderlijk (zie figuur 1).
13. Plaats vijf thermokoppels in de chip door het dode einde open zijde kanalen van elke chip (zie figuur 2b). De thermokoppels blijven in deze kanalen via perspassing. Tape werd gebruikt om verder vaststellen van de locatie van thermokoppels.

2. Solid Phase Extraction Method

1. Bereid 96 pl 70% ethanol met DEPC behandeld en geautoclaveerd water (gedeïoniseerd of Millipore).
2. Voeg 4 pi 25X RNA Secure tot 96 pl 70% ethanol in een buis en dupliceren hetzelfde mengsel met 100% ethanol in een afzonderlijke buis.
3. Bereid 300pi buffer kanaal door mengen van de volgende: 75 pi 6 M guanidine thiocyanaat (GuSCN), 150 pi 2-propanol, 63 ul nuclease-vrij water en 12 pi 25X RNA Secure.
4. Bereid 312 ul lysis buffer door het mengen van: 100 pi 6 M GuSCN, 200 ui 2-propanol en 12 ui 25X RNA Secure.
5. Verwarm de 70% ethanol, 100% ethanol, en lysis buffer kanaal buffers bij 60 ° C gedurende 10-20 min de RNA Secure activeren.
6. Om de microfluïdische kanaal evenwicht, voert u het kanaal buffer door de SPE kanaal bij een debiet van 0,8 ml / uur.
7. Quick-ontdooien Het monster wordt in VTM bij 37 ° C in een waterbad, en onmiddellijk verwijderen van de steekproef uit waterbad zodra het wordt ontdooid.
8. Centrifugeer monster bij 13.000 rpm gedurende 10 min, en overdracht 100 ul van de supernatant in 300 pi van de lysis buffer. Voltooid werd het mengsel door toevoeging van 6 pl van 1 ug / ul RNA drager.
9. Vortex te mengen, en na het centrifugeren voor5 sec, laadt u de hele lysaat in een Luer-lok 1 cc spuit.
10. Lysaat lopen door de SPE kanaal met een stroomsnelheid van 0,8 ml / uur.
11. Was de SPE kanaal met 100 pl 70% ethanol, gevolgd door 100 ul of100% ethanol per 1 ml / uur. (Er is een 50 ul dood volume in de spuit die niet zullen worden overgeheveld, dus eigenlijk alleen 50 pl gaat door het kanaal.)
12. Plaats een lege injectiespuit in de 0,5 ml markering en druk lucht door het kanaal te drogen bij 1 ml / uur.
13. Run 67,5 ul nuclease-vrij water door het kanaal om het gebonden nucleïnezuren elueren met 0,5 ml / uur en 13,5 ul van nanoport de afvoerpoort verzamelen. (De vloeistof te wijten is aan de 54 ul dode volume in de spuit en de SPE kanaal.)

3. RT-PCR

1. Bereid 36,5 ul van het RT-PCR Master Mix in de lucht droog stap (2.12) met de reagentia in een Qiagen OneStep RT-PCR kits.
2. Laad RT-pcR reagens in de nanoport bij het afval haven, en meng met RNA aan de volgende 50 pl RT-PCR-reactie te krijgen: 13,5 ul eluaat RNA in nuclease vrij water, 4 pi RT-PCR enzym mix, 10 pl Q-oplossing, 10 μl1X een stap buffer, 2 pl 25 mM _MgCl2, 1 pi 50 pM forward primer 5'-GAC TCC TGT CAC CRA CTC TGA C-3 ', 1 pi 50 uM reverse primer 5'-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 ', 2 pl dNTP, 0,75 ul 1,0% w / v BSA, 0,73 pl PEG8000 en 5,02 pi nuclease-vrij water.
3. Plaats de RT-PCR mengsel in de RT kanaal zachte vacuum (gemaakt van de wand vacuüm) en sluit de Nanoport met een gesloten fitting.
4. Breng 35 V op toestel 1. Bewaar de reagentia in de RT kanaal 30 min na de verwarming een evenwicht bereikt bij 50 ° C. Bewaar de reagentia in de RT kanaal 15 min na de verwarming een evenwicht bereikt bij 95 ° C.
5. Breng 27 V tot verwarmer 1 en 50 V tot verwarming 2, wacht ongeveer drie minuten of tot verwarmingselement 1 evenwicht bereikt op 60 & deg; C en verwarmer 2 evenwicht bereikt bij 95 ° C.
6. Druk de reagentia in de PCR kanaal 0,5 ul / min. Het duurt ongeveer 20 minuten voor de reagentia stromen door de serpentine kanaal.
7. Het monster wordt tot het einde van het slangachtige kanaal verzamelen PCR-producten bij de uitlaat met een geschikt bemeten pipet en tip.

4. PCR producten Detectie

1. We maken gebruik van een Agilent High Sensitivity DNA-test om de producten op te sporen. Voor het uitvoeren van deze test nemen de Agilent High Sensitivity DNA Kit uit de koelkast 30 min. voor het testen.
2. Zet de Bioanalyzer en open de 2100 Expert-software.
3. Plaats de 1 ul van het PCR producten in de test en volgt de Agilent protocol ( http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent% 20Manual.pdf ).
4. Analyseer en noteer de data.

Resultaten

Een typisch resultaat is weergegeven in figuur 3 voor een influenza A geïnfecteerd nasofaryngeale wash specimen. Door de verschillende hoeveelheden influenzavirus in elke patiënt specimen, de eindconcentratie van PCR product variëren. Een goed resultaat moet een geringe ruis, twee duidelijke pieken ladder (35 en 10380 bp) en een productpiek bij de ontworpen product grootte (107 bp) voor het positief monster. Terwijl het product piek moet theoretisch afwezig zijn voor de negatieve controles, we wel...

Discussie

De diagnostische methode hier gepresenteerde aangetoond over het vermogen van een geïntegreerde microfluïdische plastic chip aan influenza A RNA versterken van patiënt monsters met hoge specificiteit en een lage detectielimiet ¹³ Wij ontwierpen deze chip voor potentiële point of care testen:. (A) de temperatuur en vloeibare controle werden vereenvoudigd, (b) de chip is goedkoop en geschikt voor high throughput fabricage met behulp van spuitgieten, en (c) de chip is disposable en bestemd voor eenmalig gebruik,...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Naam van de Reagens / Materiaal	Vennootschap	Catalogus nummer
1-dodecanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	443816-500G
2,2-Dimethoxy-2-fenylacetofenon	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	196118-50G
2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	G2943CA
2-Propanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	19516
Benzofenon	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	239852-50G
BSA	Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA	A7979-50ML
Butylmethacrylaat	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	235865-100 ml
Carrier RNA	Qiagen, Valencia, CA	1017647
Cyclohexanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	105899-1L
Ethanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	E7023
Ethyleendimethacrylaat	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	335861
Ethyleenglycoldimethacrylaat	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	335681-100ML
Glazen spuit 250 pl	Hamilton, Reno, NV	81127
Guanidinethiocyanaat	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	50981
Hoge gevoeligheid DNA Kit	Agilent Technologies, Santa Clara, CA	5067-4626
Gloeipers	Carver, Wabash, IN	4386
JB Weld Epoxy	McMaster-Carr, Elmhurst, IL	7605A11
Luer-Lok spuiten	BD-Medical, Franklin Lakes, NJ	309628
Magnesium Chloride	Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA	AB-0359
Methanol	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	494437
Methylmethacrylaat	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	M55909
Nanoport	Upchurch Scientific	N-333-01
Nanoport Fitting	Upchurch Scientific	F-120x
Nuclease gratis water	Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA	PR-P1193
OneStep RT-PCR kit	Qiagen, Valencia, CA	210210
PEG8000	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	41009
Voeding	VWR, Radnor, PA	300V
RNAse Away	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	83931-250ML
RNASecure	Applied Biosystems, Foster City, CA	AM7005
Silica microsferen	Polysciences, Warrington, PA	24.324-15
Injectiepomp	Harvard Apparatus, Holliston, MA	HA2000P/10
Warmtegeleidende Tape	McMaster-Carr, Elmhurst, IL	6838A11
Thermoelement	Omega Engineering, Stamford, CT	5SRTC-TT-J-40-36
Dunne-film Heaters	Minco, Minneapolis, MN	HK5166R529L12A
Ultraviolet Crosslinker	UPV, Upland, CA	CL-1000
Zeonex	Zeon Chemicals, Louisville, KY	690R