Methodenartikel

Beoordelen van Muizen Resistance Artery functie gebruiken Pressure myography

DOI:

10.3791/50328

⸱

7 juni 2013

 , 
1Anesthesia Center for Critical Care Research, Department of Anesthesia, Critical Care, and Pain Medicine, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In druk myography wordt een intacte klein segment van een vaartuig aan twee kleine canules geplaatst en een druk van een geschikte luminale druk. Hier beschrijven we de methode om vasorelaxatie respons van de muis 3 meten Rd Om mesenteriale slagaders in C57 en sGCα 1 - / - Muizen met behulp van druk myography.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pressure myograph systemen prachtig bruikbaar in de functionele beoordeling van kleine slagaders, op druk gebracht tot een geschikte transmurale druk. De bijna fysiologische toestand bereikt druk myography maakt het diepgaande onderzoek intrinsieke reacties op farmacologische en fysiologische stimuli die kunnen worden geëxtrapoleerd naar de in vivo gedrag van het vasculaire bed. Druk myograph heeft een aantal voordelen ten opzichte van conventionele draad myographs. Zo kunnen kleinere weerstand schepen worden bestudeerd op streng gecontroleerd en fysiologisch relevante intraluminale druk. Hier bestuderen we de mogelijkheid van 3e orde mesenteriale slagaders (3-4 mm lang), preconstricted met fenylefrine, om vaso-ontspannen in reactie op acetylcholine. Mesenterische slagaders twee canules aangesloten op een onder druk en gesloten systeem wordt gehandhaafd op een constante druk van 60 mmHg geplaatst. Het lumen en buitendiameter van het vat zijn continuously opgenomen met een videocamera, waardoor real time kwantificering van de vasoconstrictie en vasorelaxatie in reactie op fenylefrine en acetylcholine, respectievelijk.

Om de toepasbaarheid van de druk myography de etiologie van cardiovasculaire ziekte onderzoeken aantonen, onderzochten we endotheel-afhankelijke vasculaire functie in een muismodel van systemische hypertensie. Muizen deficiënt in de α 1 subeenheid van oplosbaar guanylaatcyclase (sGCα 1 - / -) zijn hypertensieve wanneer op een 129S6 (S6) achtergrond (sGCα 1 -/-S6) maar niet wanneer een C57BL / 6 (B6) achtergrond (sGCα 1 -/-B6). Met behulp van druk myography, tonen we aan dat sGCα 1-deficiëntie resulteert in een verminderde endotheel-afhankelijke vaatverwijding. De vasculaire dysfunctie is meer uitgesproken in sGCα 1 -/-S6 dan in sGCα 1 -/-B6 muizen, waarschijnlijk contributing tot de hogere bloeddruk in sGCα 1 -/-S6 dan in sGCα 1 -/-B6 muizen.

Pressure myography is een relatief eenvoudig, maar gevoelig en mechanisch nuttige techniek die kan worden gebruikt om het effect van verschillende stimuli op vasculaire contractie en relaxatie evalueren, waardoor het inzicht in de mechanismen verhogen onderliggende hartaandoening.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pressure myograph systemen worden gebruikt om de fysiologische functie en eigenschappen van kleine slagaders, aders en andere vaartuigen meten. Een intact klein segment van een slagader of ader aan twee kleine glazen canules geplaatst en een druk van een geschikte luminale druk, waardoor het vaartuig meeste handhaven in vivo eigenschappen (figuren 1 en 2). De buurt van fysiologische toestand in een druk myograaf weerspiegelt het in vivo gedrag van het vasculaire bed, waardoor het onderzoek van intrinsieke eigenschappen (bv. myogene tonus) van geïsoleerde schepen. Enkele van de voordelen van druk myography via draad myography waar spiercontractie wordt beoordeeld door directe mechanische koppeling met een krachtopnemer 1 bevatten (i) dat micro weerstand slagaders, waardoor de totale weerstand ontwikkelde vasculaire stelsel te definiëren, kan worden bestudeerd, terwijl wire myograph beperkt tot grotere leiding slagaders, (ii) tpet het risico voor het endotheel beschadigen verminderd omdat er geen draden nodig zijn gepasseerd door het vat lumen, (iii) dat de natuurlijke vorm van het vat is beter onderhouden en (iv) dat vaartuig dimensie kan worden bekeken op uiteenlopende drukken of shear stress 2.

Studeren micro schepen kunnen meer informatief dan het bestuderen van grotere leiding slagaders te helpen begrijpen van de pathofysiologie en de moleculaire mechanismen die bijdragen aan veranderde vasculaire tonus in hart-en vaatziekten, zoals hoge bloeddruk. Bijvoorbeeld kan aantasting van endotheliale functie in verband met invoer muizen een vetrijk dieet gedurende 8 weken worden aangetoond 2e orde mesenterische arteriën 3, maar niet in aorta ringen (figuur 3). Een ander voordeel is dat de druk myography intrinsieke myogene vernauwing van het drukvat aanwezig is, en dat de rol en functie van het endotheel van dit verschijnsel kan worden bestudeerd. Hier hebben we descrIbe het gebruik van een druk myograph vasculaire reactiviteit van muis mesenteriale 3e orde weerstand slagaders bestuderen in een omgeving voor verminderde stikstofoxide (NO)-cGMP signaaltransductie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van oplossing

  1. 500X EDTA voorraad: weeg 500 mg EDTA-Na 2 • 2H 2 O en los op in 50 ml gedeïoniseerd water. Bewaar bij kamertemperatuur.
  2. KCl depolariserende oplossing.
    1. Bereid K10X voorraad oplossing: 3,69 g NaCl, 18,64 g KCl, 0,36 g MgSO4 watervrij, 0,41 g KH 2 PO 4, 0,46 g CaCl2 • 2H 2 O. Los op in 250 ml gedeïoniseerd water. Bewaar bij kamertemperatuur.
    2. Voor 100 ml uiteindelijke KCl depolariserende oplossing 1X: Los 0.21 NaHCO3, 0,18 g glucose in 90 ml gedeïoniseerd water. Voeg 10 ml K10X voorraad oplossing. Voeg 95 ul van 500X EDTA oplossing. Meng goed. Bewaren bij 4 ° C. Gebruik binnen een week.
  3. Bereid verse HEPES-PSS-oplossing op de dag van het experiment (voor 1 liter).
    1. 6,96 g NaCl, 0,35 g KCl, 0,288 g MgSO4 • 7H 2 O, 0,1605 g KH 2 PO 4, 2,38 g HEPES. Oplossen in 100 mlgedemineraliseerd water. Markeren als kolf A.
    2. 0,312 g CaCl2 • 2H 2 O. Los op in 100 ml gedeïoniseerd water. Markeren als kolf B.
    3. 1,25 g NaHCO 3, 0,991 g glucose. Los op in 98 ml gedeïoniseerd water. Markeren als kolf C.
  4. Voeg 2 ml 500X EDTA in kolf C. Neem 700 ml gedemineraliseerd water in een grote fles. Giet de inhoud van de kolf A, B en C in grote fles met doorlopende vortexen. Breng de pH op 7,4 met NaOH.

2. Drugs gebruikt

  1. Fenylefrine (10 -2 M): Los 20,37 mg in 10 ml gedeïoniseerd water. Aliquot 1 ml en bewaar bij -80 ° C. Serieel verdund ter verkrijging 10 -3, 10 -4, -5 10 en 10 -6 mol / L op de dag van het experiment.
  2. Acetylcholine (10 -2 M): Los 18,17 mg in 10 ml gedeïoniseerd water. Aliquot 1 ml en bewaar bij -80 ° C. Serieel verdunnen te verkrijgen 10 -3, 10 -4, 10 -5 en 10 -6mol / L op de dag van het experiment.

3. Muizen

Mannelijke WT en sGCα 1 - / - muizen op de S6 en B6 achtergrond werden in deze studie onderzocht. De sGCα 1 - / - werden gegenereerd zoals eerder beschreven 4,5. Huisvesting en procedures waarbij proefdieren (muizen) werden goedgekeurd door de Subcommissie Onderzoek Animal Care van het Massachusetts General Hospital, Boston, MA.

4. Meting van Vasculaire reactiviteit in mesenterica

  1. Euthanaseren de muizen met pentobarbital (200 mg / kg, ip). Open de buikholte en ontleden de mesenteriale weefsel. Isoleren en ontleden een mesenterica van 3e orde vrij van bind-en vetweefsel, en plaats de slagader in ijskoude HEPES-PSS oplossing pre-evenwicht gebracht met 95% O 2/5% CO 2 gedurende 15 minuten. Knip ringen 2-3 mm lengte zonder vertakking van de mesenterischeslagader. Onderscheid tussen slagaders en aders op micro vaartuigen niveau problematisch wanneer er geen bloed in de vaten. Daarom raden wij het identificeren van het schip terwijl het nog intact in het dier voordat het ontleden het uit.
  2. Vul de glazen canules in de druk myograph kamer (DMT Model 110P en 11P versie 1.31, figuur 2) met HEPES-PSS-oplossing met behulp van een 10 ml spuit door inlaat-en uitlaatkleppen. Het vullen van de canule moet voorzichtig en zorgvuldig gebeuren als hoge druk kan in de fragiele transducer aangesloten canules beschadigen. Na het vullen van canules sluit beide inlaat-en uitlaatkleppen strak.
  3. Monteer het ene uiteinde van het vat op juiste canule en zorgvuldig bind het met een fijne draad van nylon hechtdraad. Met behulp van een spuit, spoelen en in het vat met HEPES oplossing via de inlaatklep te vullen. Breng de linker canule dichter bij het vaartuig en monteer het andere uiteinde van het vaartuig op het. Bind het met nylon hechtdraad. Vullende kamer met maximaal met HEPES oplossing 10 ml. Controleer het lek spuitopening zachtjes HEPES oplossing via ingangsafsluiter met behulp van een spuit.
  4. Installeer de kamer op de myograph en onder de videocamera. Start de zuurstof en warmte (37 ° C) in de kamer. Sluit de inlaatklep met buis P1 van de eerste HEPES oplossing reservoir, terwijl de klep gesloten. Laat elke bel en oplossing pas door de buis totdat er geen luchtbellen in de buis. De klep te openen.
  5. Sluit de linker klep van de kamer met buis P2 uit drukregelaar. Nogmaals controleren op eventuele luchtbellen. Er mag geen sprake zijn van luchtbellen of lekkage in het gehele systeem.
  6. Ga naar het menu druk op de myo-interface-paneel of in de software en schakel de pomp tijdens het draaien van de stroom.
  7. Open het programma en klik op COLLECT. Vaartuig moet worden gezien op het scherm nu (Figuur 3). Het schip is gevisualiseerd met een camera gemonteerd op een microscoop, zodat monitoring en analyse van het vat lumen, vaatdiameter en wanddikte.
  8. Geleidelijk verhogen van het interluminal druk via de P1 klep door het selecteren van P1 druk in de myo-interface-paneel of in het programma en voer de druk waarde als volgt; 5 mmHg → 10 → 20 → 40 → 60 mmHg. Schip ergens de neiging om verdraaien of convoluut terwijl de druk toeneemt, de spanning aan te passen of dienovereenkomstig stam met behulp van verticale of lengterichting micropositioner (Figuur 2). Evenwicht vaartuig op 60 mmHg en 37 ° C ten minste 45 minuten. Wijzig het bad oplossing eenmaal met voorverwarmd HEPES tijdens evenwicht.
  9. Breng 10 ml KCl depolariserende oplossing, voorverwarmd bij 37 ° C, naar het bad volledig depolariseren gladde spiercellen en een maximale vernauwing. Na stabiele vernauwing, spoel het bad met HEPES oplossing 3 keer om de 10 minuten.
  10. Controleer de levensvatbaarheid van het schip en de integriteit van het endotheel door stabiele en reproductievebaar reacties op het toevoegen van fenylefrine (10 -5 M) en acetylcholine (10 -5 M). Spoel 3 keer met HEPES oplossing elke 10 minuten.
  11. Voeg fenylefrine (10 -5 M) aan het vat preconstrict, en wanneer een stabiele vernauwing is verkregen, voert een cumulatieve concentratie-vasodilatatie respons curve (CRC) door achtereenvolgende toevoeging van toenemende doses van acetylcholine (10 -9, 3 x 10 - 9, 10 -8, 3 x 10 -8, -7 10, 3 x 10 -7, 10 -6, 3 x 10 -6 en 10 -5 M). Na de laatste dosis, spoel 3 keer met HEPES oplossing om de 10 min. voor het starten van nieuwe CRC.
  12. Bepaal de passieve lumen diameter door toepassing van Ca 2 +-vrij PSS bevattende 2 mM EGTA. Uit de opgenomen traces maatregel lumen diameter voor elke dosis-respons (figuur 4), die zal worden gebruikt om alle parameters berekenen.
  13. Uiten alle acetylcholine ontspanning reacties als percentage verandering in lumendiameter na fenylefrine preconstriction vergelijking met het verschil tussen de calcium-free diameter en diameter na fenylefrine vernauwing, met de volgende vergelijking:
  14. Percentage dilatatie = 100% x [(D x - D i) / (D Ca-free - D i)], waarbij D de gemeten lumen diameter en x, i, en Ca-free duiden arteriële diameters aan beide dosis agonist (x), aanvangsdiameter volgende fenylefrine vernauwing (i), en in Ca2 +-vrije buffer (Ca-vrij).

5. Statistische analyse

Alle continue metingen worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. De vasculaire reactiviteit in mesenteriale slagaders wordt geanalyseerd door herhaalde-maatregelen twee-weg ANOVA. In alle gevallen, P <0,05 wordt als statistisch significant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NO is centraal betrokken bij het ​​onderhoud van de bloeddruk homeostase zowel bij de mens 6 en in diermodellen 7. Het vermogen van NO om vasculaire gladde spierrelaxatie controle wordt gemedieerd door oplosbare guanylaatcyclase (sGC), een heem-bevattend enzym dat heterodimere genereert cGMP 8. Onlangs werd een bloeddruk-modificerend genetische variant geïdentificeerd in een locus die de sGCα 1 en sGCβ 1-genen bevat, illustreert het belang van sGC in reguleren van d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muizen zijn de experimenteel model van keuze voor vele onderzoekers, mede door de mogelijkheid om genetische modificaties, zo werden muismodellen voor humane pathofysiologie voeren. De vasoactieve status van kleine weerstand, maar niet van de grotere leiding schepen bepaalt grotendeels de regulatie van de bloedstroom door het hele vaatstelsel 11. De grootte van de weerstand slagaders in kleine dieren, zoals muizen, gaat het gebruik van een draad myograph om microvasculaire functie te bestuderen. Druk myograph...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs willen graag Drs erkennen. Paul Huang en Dmitriy Atochin voor het gebruik van DMT druk myograaf en Drs. Binglan Yu en Chong Lei voor het verstrekken van muizen gevoed met een hoog vet dieet of standaard dieet.

BRON VAN FINANCIERING

Dit werk werd ondersteund door Scientist Development Grant 10SDG2610313 van de American Heart Association (tot ES Buys), en een Eleanor en Miles Shore 50e verjaardag Fellowship programma voor Geleerden in de geneeskunde aan de Harvard Medical School (ES naar Buys).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
NaClFisher ScientificBP358
CaCl2 (2H2O)Fisher ScientificC79-500
KClSigmaP9333
MgSO4 Fisher ScientificM65-500
KH2PO4 SigmaP3786
NaHCO3 Fisher ScientificBP328
NaOHFisher ScientificS318
D-GlucoseSigmaG8270
EDTAFisher ScientificBP121
HEPESSigmaH3375
PhenylephrineAcros OrganicsAC20724
AcetylcholineSigmaA6625
Pressure Myograph SystemDMT

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bridges, L. E., Williams, C. L., Pointer, M. A., Awumey, E. M. Mesenteric artery contraction and relaxation studies using automated wire myography. J. Vis .Exp. (55), e3119(2011).
  2. Arribas, S. M., Daly, C. J., McGrath, I. C. Measurements of vascular remodeling by confocal microscopy. Methods Enzymol. 307, 246-273 (1999).
  3. Lei, C., Yu, B., et al. Inhaled Nitric Oxide Attenuates the Adverse Effects of Transfusing Stored Syngeneic Erythrocytes in Mice with Endothelial Dysfunction after Hemorrhagic Shock. Anesthesiology. , (2012).
  4. Buys, E. S., Cauwels, A., et al. sGCα1β1 attenuates cardiac dysfunction and mortality in murine inflammatory shock models. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 297 (2), H654-H663 (2009).
  5. Buys, E. S., Sips, P., et al. Gender-specific hypertension and responsiveness to nitric oxide in sGCα1 knockout mice. Cardiovasc. Res. 79 (1), 179-186 (2008).
  6. Panza, J. A., Quyyumi, A. A., Brush, J. E., Epstein, S. E. Abnormal endothelium-dependent vascular relaxation in patients with essential hypertension. N. Engl. J. Med. 323 (1), 22-27 (1990).
  7. Huang, P. L., Huang, Z., et al. Hypertension in mice lacking the gene for endothelial nitric oxide synthase. Nature. 377 (6546), 239-242 (1995).
  8. Friebe, A., Koesling, D. The function of NO-sensitive guanylyl cyclase: what we can learn from genetic mouse models. Nitric Oxide. 21 (3-4), 149-156 (2009).
  9. Ehret, G. B., Munroe, P. B., et al. Genetic variants in novel pathways influence blood pressure and cardiovascular disease risk. Nature. 478 (7367), 103-109 (2011).
  10. Buys, E. S., Raher, M. J., et al. Genetic modifiers of hypertension in soluble guanylate cyclase alpha1-deficient mice. J. Clin. Invest. 122 (6), 2316-2325 (2012).
  11. Kauffenstein, G., Laher, I., Matrougui, K., Guerineau, N. C., Henrion, D. Emerging role of G protein-coupled receptors in microvascular myogenic tone. Cardiovascular Research. 95 (2), 223-232 (2012).
  12. Ruilope, L. M. Hypertension in 2010: Blood pressure and the kidney. Nat. Rev. Nephrol. 7 (2), 73-74 (2011).
  13. Michael, S. K., Surks, H. K., et al. High blood pressure arising from a defect in vascular function. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (18), 6702-6707 (2008).
  14. Mendelsohn, M. E. In hypertension, the kidney is not always the heart of the matter. J. Clin. Invest. 115 (4), 840-844 (2005).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mesenterische arterievasculaire reactiviteitendotheelafhankelijke vasodilatatiefenylefrine constrictieacetylcholine relaxatieSGC alfa n knock outmuismodel voor hypertensiemeting van de luminale diametertechniek voor vaatmontage

Gerelateerde artikelen