Om de veranderingen van nociceptieve intraepidermal zenuwvezels (IENFs) in pijnlijke neuropathieën (PN) te bestuderen, ontwikkelden we protocollen die direct kon onderzoeken driedimensionale morfologische veranderingen waargenomen in nociceptieve IENFs. Drie-dimensionale analyse van IENFs heeft de potentie om de morfologische veranderingen van IENF in PN evalueren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Driedimensionale beeldvorming van Nociceptieve Intraepidermal zenuwvezels in Menselijke huid Biopsieën
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Een punch biopsie van de huid wordt vaak gebruikt om intraepidermal zenuwvezel dichtheden (IENFD) te kwantificeren voor de diagnose van perifere polyneuropathie 1,2. Momenteel is het gebruikelijk om 3 mm huid biopten te verzamelen van het distale been (DL) en proximale dij (PT) voor de beoordeling van lengte-afhankelijke polyneuropathieën 3. Echter, vanwege de aard van multidirectionele IENFs, is het een uitdaging om te onderzoeken overlappende zenuwstructuren door de analyse van tweedimensionale (2D) beeldvorming. Alternatief zou driedimensionale (3D) beeldvorming een betere oplossing voor dit dilemma.
In het huidige rapport presenteren we methoden voor de toepassing van 3D-beeldvorming om pijnlijke neuropathie (PN) te bestuderen. Om IENFs identificeren, zijn huid monsters verwerkt voor immunofluorescent analyse van eiwit-genproduct 9,5 (PGP), een pan neuronale marker. Op dit moment is het gebruikelijk om kleine vezels neuropathie behulp IENFD ontmoedigen diagnosticerenbepaald door immunohistochemie met PGP helderveld microscopie 4. In de huidige studie, dubbele immunofluorescentie-analyse pasten wij aan totale IENFD identificeren, PGP en nociceptieve IENF, door het gebruik van antilichamen die tropomyosine-receptor-kinase herkennen A (Trk A), de hoge affiniteit receptor voor zenuwgroeifactor 5. De voordelen van co-kleuring IENF met PGP en Trk A antilichamen ten goede aan de studie van PN door duidelijke kleuring PGP-positieve, nociceptieve vezels. Deze fluorescerende signalen kunnen worden gekwantificeerd om nociceptieve IENFD en morfologische veranderingen van IENF geassocieerd met PN bepalen. De fluorescerende beelden worden overgenomen door confocale microscopie en verwerkt voor 3D-analyse. 3D-imaging biedt rotatie capaciteiten om verder te analyseren morfologische veranderingen geassocieerd met PN. Samen genomen, fluorescerende co-kleuring, confocale imaging en 3D-analyse duidelijk ten goede aan de studie van PN.
Inleiding
Momenteel is het gebruikelijk voor artsen om intraepidermal zenuwvezel dichtheden (IENFD) kwantificeren van de huid stansbiopsieën, die kan worden gebruikt om kleine vezels neuropathieën 3, 6-8 diagnosticeren. Biopten worden genomen uit de distale been (DL), 10 cm boven de laterale malleolus, en de proximale dij (PT), 20 cm onder de voorste iliaca wervelkolom 9. Alle IENF worden geëtiketteerd met proteïnegen product 9,5 (PGP), een pan neuronale marker 10-12. Momenteel is het gebruikelijk om kleine vezels neuropathieën middels diagnosticeren IENFD bepaald door kleuring met PGP helderveld microscopie 6. Daarnaast hebben versc....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Deel A: Immunohistochemistry
Bereiding van 96-well plaat en voorkoming van achtergrondkleuring Punch skin biopsies verzameld van proefpersonen en gedurende 12-24 uur in fixeeroplossing (2% paraformaldehyde bij 0,75 M L-lysine-oplossing (pH 7,4) en 0,05 mM natriumperjodaat) bij 4 ° C zoals eerder beschreven 8. Monsters worden vervolgens cryoprotected in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 20% glycerol bij 4 ° C gedurende 1 week, ingebed in fixeermiddelen optimale snijtemperatuur (OCT), vervolgens in coupes 50 urn dikke secties op een cryostaat. Het hieronder beschreven protocol is geschikt voor 8 huidsecties, het maximum aan....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
We pasten het huidige protocol naar de morfologie van IENF in PT en DL huidbiopsies bestuderen van patiënten met PN. De huid, uit drie onderwerpen, werd verzameld aan de Universiteit van Utah aan de pathomorphology geassocieerd met PN demonstreren. De onderwerpen zijn onder meer: Case 1: een 51-jarige man met een geschiedenis van PN van type 2 diabetes (duur: 14 maanden; pijn score: 51); Case 2: een 56-jarige man met een geschiedenis van PN van type 2 diabetes (duur: 108 maanden; pijn score: 47), en arrest van 3: een .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Meting van IENFD is op grote schaal gebruikt om de mate van perifere neuropathieën 13,14 bepalen. Momenteel is de meest gebruikte protocol meet alleen de dichtheden van zenuwvezels die de basale membraan van de epidermis doordringen, het niet in aanmerking nemen axonale vertakkingen en / of morfologische veranderingen van de zenuwen. Bovendien heeft de huidige IENFD analyse niet aangetoond IENFD correleren met de aanwezigheid van pijn in PN 15.
We eerder gemeld dat verh.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten te verklaren.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Subsidies K08 NS061039-01A2, het programma voor Neurology Research & Discovery en The A. Alfred Taubman Medical Research Institute van de Universiteit van Michigan. Dit werk gebruikt de morfologie en beeldanalyse Kern van de Michigan Diabetes Research en Training Center, gefinancierd door de National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 van het National Institute of Diabetes en Maag-, Darm-en Kidney Diseases. De auteurs willen graag Robinson Singleton en Gordon Smith (Universiteit van Utah) bedanken voor hun gulle donatie van menselijke huid monsters aan de initiële ontwikkeling van de nociceptieve b....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP399-4 | Om 1X PBS te maken |
| Image-IT FX Signaal | Invitrogen | I36933 | Image-IT |
| Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal konijn) | AbD Serotec | 7863-0504 | PGP |
| Tropomyosine-gerelateerde-Kinase A (Polyclonal geit) | R&D Systems | AF1056 | Trk A |
| Alexa Fluor 488 ezel α-konijn | Invitrogen | A21206 | AF488 ezel α-geit |
| Alexa Fluor 647 ezel α-geit | Invitrogen | A21447 | AF647 ezel α-geit |
| Albumine, uit runder serum | Sigma-Aldrich | A7906-100 | BSA |
| Triton X- 100 | Sigma-Aldrich | T9284 | TX-100 |
| Niet-gekalibreerd lusje | LeLoop | MP 199025 | Inoculantielusje |
| 96-wells assay plaat | Corning Incorporated | 3603 | Wellplaat |
| Prolong Gold antifade reagens met DAPI | Invitrogen | P36931 | DAPI |
| Microscoopdekglas 22x22 mm | Fisher Scientific | 12-541-B | Dekglazen |
| Superfrost Plus Microscoopglazen | Fisher Scientific | 12-550-15 | Microscoopglazen |
| Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal Microscoop | Olympus | FV500 | Confocal Microscoop |
| Optimum snijtemperatuur | Sakura | 4583 | OCT |
| Leica cryostat | Leica | CM1850 | Cryostat |
Referenties
- Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
- Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
