Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Driedimensionale beeldvorming van Nociceptieve Intraepidermal zenuwvezels in Menselijke huid Biopsieën

12.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50331

⸱

29 april 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology, University of Michigan , 2Department of Internal Medicine, University of Michigan

In dit artikel

Samenvatting

Om de veranderingen van nociceptieve intraepidermal zenuwvezels (IENFs) in pijnlijke neuropathieën (PN) te bestuderen, ontwikkelden we protocollen die direct kon onderzoeken driedimensionale morfologische veranderingen waargenomen in nociceptieve IENFs. Drie-dimensionale analyse van IENFs heeft de potentie om de morfologische veranderingen van IENF in PN evalueren.

Samenvatting

Een punch biopsie van de huid wordt vaak gebruikt om intraepidermal zenuwvezel dichtheden (IENFD) te kwantificeren voor de diagnose van perifere polyneuropathie 1,2. Momenteel is het gebruikelijk om 3 mm huid biopten te verzamelen van het distale been (DL) en proximale dij (PT) voor de beoordeling van lengte-afhankelijke polyneuropathieën 3. Echter, vanwege de aard van multidirectionele IENFs, is het een uitdaging om te onderzoeken overlappende zenuwstructuren door de analyse van tweedimensionale (2D) beeldvorming. Alternatief zou driedimensionale (3D) beeldvorming een betere oplossing voor dit dilemma.

In het huidige rapport presenteren we methoden voor de toepassing van 3D-beeldvorming om pijnlijke neuropathie (PN) te bestuderen. Om IENFs identificeren, zijn huid monsters verwerkt voor immunofluorescent analyse van eiwit-genproduct 9,5 (PGP), een pan neuronale marker. Op dit moment is het gebruikelijk om kleine vezels neuropathie behulp IENFD ontmoedigen diagnosticerenbepaald door immunohistochemie met PGP helderveld microscopie 4. In de huidige studie, dubbele immunofluorescentie-analyse pasten wij aan totale IENFD identificeren, PGP en nociceptieve IENF, door het gebruik van antilichamen die tropomyosine-receptor-kinase herkennen A (Trk A), de hoge affiniteit receptor voor zenuwgroeifactor 5. De voordelen van co-kleuring IENF met PGP en Trk A antilichamen ten goede aan de studie van PN door duidelijke kleuring PGP-positieve, nociceptieve vezels. Deze fluorescerende signalen kunnen worden gekwantificeerd om nociceptieve IENFD en morfologische veranderingen van IENF geassocieerd met PN bepalen. De fluorescerende beelden worden overgenomen door confocale microscopie en verwerkt voor 3D-analyse. 3D-imaging biedt rotatie capaciteiten om verder te analyseren morfologische veranderingen geassocieerd met PN. Samen genomen, fluorescerende co-kleuring, confocale imaging en 3D-analyse duidelijk ten goede aan de studie van PN.

Inleiding

Momenteel is het gebruikelijk voor artsen om intraepidermal zenuwvezel dichtheden (IENFD) kwantificeren van de huid stansbiopsieën, die kan worden gebruikt om kleine vezels neuropathieën 3, 6-8 diagnosticeren. Biopten worden genomen uit de distale been (DL), 10 cm boven de laterale malleolus, en de proximale dij (PT), 20 cm onder de voorste iliaca wervelkolom 9. Alle IENF worden geëtiketteerd met proteïnegen product 9,5 (PGP), een pan neuronale marker 10-12. Momenteel is het gebruikelijk om kleine vezels neuropathieën middels diagnosticeren IENFD bepaald door kleuring met PGP helderveld microscopie 6. Daarnaast hebben verschillende onderzoeksgroepen gebruikt immunofluorescerende protocollen voor PGP immunohistochemie 7-9. Kleine vezels neuropathie wordt vaak geassocieerd met neuropathische pijn. Om de rol van IENF essentieel voor pijn verwerking verder begrijpen we een techniek ontwikkeld om samenwerking label totale IENF met vezels die pijn produceren. Nociceptieve IENF, specifiek Aδ en C-vezels, kan worden bestudeerd door de co-etikettering van IENF met PGP en de nociceptieve marker, tropomyosine-receptor-kinase A (Trk A) 5. TrkA is de hoge affiniteit receptor voor zenuwgroei-factor die essentieel is voor de ontwikkeling van nociceptie. De Trk A-positieve nociceptieve zenuwvezels zijn peptidergisch vezels die express substance P (SP) en calcitonine gen gerelateerd peptide (CGRP). Voorheen Lauria en collega's paste de dubbel-labeling techniek om PN, co-labeling PGP-positieve IENF met een nociceptieve marker 10 bestuderen. In onze eerdere studie hebben we aangetoond dat Trk A-positief IENF, maar niet Trk A-negatieve IENF werden opgereguleerd in een diermodel van pijnlijke diabetische neuropathie 5. Deze co-labeling techniek biedt de mogelijkheid om te vergelijken kwantificering van nociceptieve IENFD aan IENFD en het vermogen om morfologische veranderingen geassocieerd met PN bestuderen totaal. De mogelijkheid om nociceptieve IENF en bedrij visualiserenre kwantificering van totaal IENFD tot nociceptieve IENFD kan objectief bewijs voor de aanwezigheid van pijn en mogelijk inzicht in de ernst van pijn bij PN. Deze techniek is ook toepasbaar op huid van diermodellen. In vergelijking met eerdere studies, het huidige protocol beschrijft methoden voor 3D beeldanalyse, het creëren van de mogelijkheid om fouten die kunnen optreden in 2D beeldanalyse voorkomen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Deel A: Immunohistochemistry

Bereiding van 96-well plaat en voorkoming van achtergrondkleuring Punch skin biopsies verzameld van proefpersonen en gedurende 12-24 uur in fixeeroplossing (2% paraformaldehyde bij 0,75 M L-lysine-oplossing (pH 7,4) en 0,05 mM natriumperjodaat) bij 4 ° C zoals eerder beschreven 8. Monsters worden vervolgens cryoprotected in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met 20% glycerol bij 4 ° C gedurende 1 week, ingebed in fixeermiddelen optimale snijtemperatuur (OCT), vervolgens in coupes 50 urn dikke secties op een cryostaat. Het hieronder beschreven protocol is geschikt voor 8 huidsecties, het maximum aantal huidsecties mogelijk vrij zwevende immunohistochemie ondergaan in een 96-well plaat.

DAG 1:

1. Preventie van niet-specifieke immunoreactiviteit in de hoornlaag

  1. Label 96-well plaat zoals getoond in figuur 1.
  2. Voeg 150 ul van Image-IT FX Signal (Image-IT), effectief voor het blokkeren achtergrondkleuring 11,12, in elk putje in rij 1 van de 96-well plaat.
  3. Voeg 150 pi 1X PBS aan elk putje in rij 2 en 3 van de 96-well plaat.
  4. Verwerven twee 50 micrometer secties per patiënt: een sectie van de biopsie genomen op DL, een sectie van de biopsie genomen bij PT. Een entnaald (LeLoop) wordt gebruikt om delen van de ene spoel naar de volgende morfologische schade te voorkomen. Zachtjes elke 50 pm sectie overdragen, met behulp van een entnaald, in een individuele welzijn van Rij 1, met daarin Afbeelding-IT. Incubeer secties in Beeld-IT voor 30 min bij RT op een vlakke rocker.
  5. Spoel secties tweemaal met 1X PBS (rijen 2 en 3) gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Plaats wells plaat op een vlakke rocker tussen spoelingen.

2. Bereiding van 5% BSA Blocking Solution en 1% spoeloplossing

  1. Terwijl biopsie secties zijn incuberen in Beeld-IT, bereiden 5% blokkerende oplossingtie (5% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-Vortex oplossing totdat BSA volledig oplost).
  2. Voeg 150 ul van 5% BSA blokkerende oplossing in elk putje van Row 4.
  3. Met behulp van een entnaald, secties te zetten in afzonderlijke putjes van 5% BSA blokkerende oplossing. Incubeer secties in 5% BSA blokkerende oplossing voor 1-2 uur bij kamertemperatuur op een vlakke rocker.

3. Bereiding van 1% BSA-oplossing en spoelen Verdunning van Primaire antilichamen

  1. Terwijl secties incuberen in 5% BSA blokkerende oplossing, bereid 1% spoeloplossing (1% BSA, 0,3% TX-100, 0,1 M PBS-BSA Vortex oplossing tot volledig opgelost).
  2. Terwijl secties incuberen in 5% BSA blokkerende oplossing primaire antilichamen verdund in 1% spoeloplossing.
    1. Voor acht secties (8 x 150 = 1200 pi pi) in totaal 1.200 gl nodig. De primaire antilichamen worden bereid in 1500 pl (ongeveer 20% extra volume).
    2. Verdunningen van het primaire antilichamen: PGP, 1:500; Trk A,1:500 in 1% BSA spoeloplossing.

4. Incubatie van Sectioned Biopsieën in primair antilichaam

  1. Voeg 150 pi van het verdunde primaire antilichamen in de aangegeven putjes van de 96-well plaat (rij 5).
  2. Overdragen secties van 5% blokkerende oplossing (rij 4) in de daarvoor bestemde primaire antilichaam putten (rij 5).
  3. Sluit de 96-well plaat met parafilm en aluminium folie om uitdrogen te voorkomen en blootstelling aan licht.
  4. Incubeer de 96-well plaat O / N bij 4 ° C op een vlakke rocker.

DAG 2:

5. Spoel Biopsieën in 1% BSA Spoelen Solution

  1. Voeg 150 ul van 1% BSA spoeloplossing in elk putje in rij 6, 7 en 8.
  2. Spoel secties driemaal met 1% BSA spoeloplossing (rijen 6, 7, en 8) gedurende 1 uur elke keer bij kamertemperatuur. Bedek goed plaat met aluminiumfolie en plaats op vlakke rocker tussen spoelingen.

6. Verdunning van secundaire antilichamen

  1. Terwijl secties worden geïncubeerd in de laatste spoelgang van 1% BSA spoeloplossing (rij 8), secundaire antilichamen verdund in 1% BSA spoeloplossing:
    1. Voor acht secties (8 x 150 = 1200 pi pi) in totaal 1.200 gl nodig. De secundaire antilichamen worden bereid in 1500 pl (ongeveer 20% extra volume).
    2. Verdunningen van de secundaire antilichamen: voor PGP (Alexa Fluor 488 ezel anti-konijn, 1:250), voor Trk A (Alexa Fluor 647 ezel anti-geit, 1:250) in 1% BSA spoeloplossing.

7. Incubatie van Sectioned Biopsieën in secundair antilichaam

  1. Voeg 150 pi van het verdunde secundaire antilichamen in de aangegeven putjes van de 96-well plaat (rij 9).
  2. Overdragen secties van 1% BSA blokkerende oplossing (rij 8) in secundaire antilichaam goed (rij 9).
  3. Sluit de 96-well plaat met parafilm en aluminium folie om uitdrogen te voorkomen en blootstelling aan licht.
  4. Incubeer secties in de aangewezen secundaire antilichamen O/ N bij 4 ° C op een vlakke rocker.

8. Spoel Biopsieën in 1% BSA Spoelen Solution

  1. Voeg 150 ul van 1% BSA spoeloplossing in elk putje in rij 10, 11 en 12.
  2. Spoel secties driemaal met 1% BSA spoeloplossing (rijen 10, 11 en 12) gedurende 1 uur elke keer bij kamertemperatuur. Bedek goed plaat met aluminiumfolie en plaats op een vlakke rocker tussen spoelingen.

9. Voorbereiding van de Microscope Slides en montage Sectioned Biopsieën

  1. Terwijl biopsie secties worden incuberen in de laatste spoeling van 1% BSA spoelvloeistof (rij 12), bereiden objectglaasjes.
  2. Plaats 50 gl 1% BSA spoeloplossing op een dia tegelijk.
  3. Verwijder coupes van 1% BSA spoeloplossing (rij 12), en plaats deze in de 50 ul druppel van 1% BSA spoeloplossing op de aangewezen microscoopglaasje. Na het optimaliseren van de positie van de sectie, verwijder overtollig 1% BSA spoelen oplossing met een bulbed glazen pipet, het nemen van voorzorgsmaatregelenom te voorkomen dat het monster aan te raken.

OPMERKING: Zorg ervoor dat sectie is nog niet voorbij gevouwen; het monster moet vlak zijn tegen het oppervlak van de microscoop dia.

  1. Plaats 1 druppel Verleng Gold antifade montage reagens met DAPI bij de biopsie op de microscoop dia. Neem een ​​22x22 mm microscoop glas dekglaasje en plaats deze voorzichtig over biopsie en een druppel Verleng Gold antifade reagens met DAPI neerzetten. Herhaal dit voor elke sectie.
  2. Laat objectglaasjes droog O / N bij RT in het donker.

OPMERKING: Verwijder eventuele luchtbellen met behulp van een pipet tip. Veeg overtollige Verleng Gold antifade reagens.

Deel B: confocale Imaging

10. Confocale Imaging

  1. Afbeelding fluorescentie signalen met behulp van een Olympus FluoView 500 laser scanning confocale microscoop met een 40X olie-immersie (1.3 NA) objectieve en zoom twee keer met FluoView versie 5.0 software.
  2. Gebruik Alexa Fluor 488 en Alexa Fluor 647 de 543-nm HeNe green laser en 633 nm HeNe-laser Red respectievelijk wekken. De Alexa Fluor 488 signaal wordt door een groene opzoektabel (LUT) en het Alexa Fluor 647 door een rode LUT.
  3. Stel de confocale openingen voor elke detector bij 400 urn tot signaalversterking. Sequentiële scans moeten worden genomen met een resolutie van 1024 x 1024 te signaalscheiding maximaliseren.
  4. Leg drie-dimensionale z-series met 1,2 urn z-stappen van (gebaseerd op de optimale scaneenheid berekend door de software FluoView) met Kalman gemiddeld (twee frames).

Deel C: Drie-dimensionale visualisatie en animatie

11. Driedimensionale (3D) Visualisatie en Animatie

  1. Open FluoView bestanden in Imaris x64-software (versie 7.3, Bitplane AG) te visualiseren het 3D-beeld sets.
  2. Het scherm aanpassen als nodig is om het contrast van de zenuw specifiek signaal te versterken.
  3. Maak een surface naar de dermale-epidermale grens visualiseren. Gebruik de Contour instrument in gelijkspel modus om de grens te trekken.
  4. Wijs een semi-transparante oppervlak aan de grens om de onderliggende fluorescentiesignalen bekijken.
  5. Stilstaande beelden van de 3D-fluorescerende signalen naar Snapshot beelden van de 3D-film te maken.
  6. Gebruik de functie Animation om een ​​3D-film te maken. De beelden kunnen worden gedraaid 360 graden een paar keer om elk signaal apart en samengevoegde zien (figuren 2, 3 en 4). Stel animatie om films bestaande uit 200 frames geanimeerd op 15 frames per seconde te maken. Opslaan elke film als een rauwe AVI-bestand.
  7. Druk de uiteindelijke AVI-film met VirtualDub-software (versie 1.9.4).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

We pasten het huidige protocol naar de morfologie van IENF in PT en DL huidbiopsies bestuderen van patiënten met PN. De huid, uit drie onderwerpen, werd verzameld aan de Universiteit van Utah aan de pathomorphology geassocieerd met PN demonstreren. De onderwerpen zijn onder meer: ​​Case 1: een 51-jarige man met een geschiedenis van PN van type 2 diabetes (duur: 14 maanden; pijn score: 51); Case 2: een 56-jarige man met een geschiedenis van PN van type 2 diabetes (duur: 108 maanden; pijn score: 47), en arrest van 3: een ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Meting van IENFD is op grote schaal gebruikt om de mate van perifere neuropathieën 13,14 bepalen. Momenteel is de meest gebruikte protocol meet alleen de dichtheden van zenuwvezels die de basale membraan van de epidermis doordringen, het niet in aanmerking nemen axonale vertakkingen en / of morfologische veranderingen van de zenuwen. Bovendien heeft de huidige IENFD analyse niet aangetoond IENFD correleren met de aanwezigheid van pijn in PN 15.

We eerder gemeld dat verh...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health Subsidies K08 NS061039-01A2, het programma voor Neurology Research & Discovery en The A. Alfred Taubman Medical Research Institute van de Universiteit van Michigan. Dit werk gebruikt de morfologie en beeldanalyse Kern van de Michigan Diabetes Research en Training Center, gefinancierd door de National Institutes of Health Grant 5P90 DK-20572 van het National Institute of Diabetes en Maag-, Darm-en Kidney Diseases. De auteurs willen graag Robinson Singleton en Gordon Smith (Universiteit van Utah) bedanken voor hun gulle donatie van menselijke huid monsters aan de initiële ontwikkeling van de nociceptieve biomarker immunohistochemie techniek ondersteunen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10X PBSFisher ScientificBP399-4Om 1X PBS te maken
Image-IT FX SignaalInvitrogenI36933Image-IT
Protein Gene Product 9.5 (Polyclonal konijn)AbD Serotec7863-0504PGP
Tropomyosine-gerelateerde-Kinase A (Polyclonal geit)R&D SystemsAF1056Trk A
Alexa Fluor 488 ezel α-konijnInvitrogenA21206AF488 ezel α-geit
Alexa Fluor 647 ezel α-geitInvitrogenA21447AF647 ezel α-geit
Albumine, uit runder serumSigma-AldrichA7906-100BSA
Triton X- 100Sigma-AldrichT9284TX-100
Niet-gekalibreerd lusjeLeLoopMP 199025Inoculantielusje
96-wells assay plaatCorning Incorporated3603Wellplaat
Prolong Gold antifade reagens met DAPIInvitrogenP36931DAPI
Microscoopdekglas 22x22 mmFisher Scientific12-541-BDekglazen
Superfrost Plus MicroscoopglazenFisher Scientific12-550-15Microscoopglazen
Olympus Fluoview Laser Scanning Confocal MicroscoopOlympusFV500Confocal Microscoop
Optimum snijtemperatuurSakura4583OCT
Leica cryostatLeicaCM1850Cryostat

Referenties

  1. Lauria, G., Holland, N., et al. Epidermal innervation: changes with aging, topographic location, and in sensory neuropathy. J. Neurol. Sci. 164 (2), 172-178 (1999).
  2. Sullivan, K. A., Hayes, J. M., et al. Mouse models of diabetic neuropathy. Neurobiol. Dis. 28 (3), 276-285 (2007).
  3. McArthur, J. C., Stocks, E. A., Hauer, P., Cornblath, D. R., Griffin, J. W. Epidermal nerve fiber density: normative reference range and diagnostic efficiency. Arch. Neurol. 55 (12), 1513-1520 (1998).
  4. Griffin, J. W., McArthur, J. C., Polydefkis, M. Assessment of cutaneous innervation by skin biopsies. Curr. Opin. Neurol. 14 (5), 655-659 (2001).
  5. Cheng, H. T., Dauch, J. R., Hayes, J. M., Yanik, B. M., Feldman, E. L. Nerve growth factor/p38 signaling increases intraepidermal nerve fiber densities in painful neuropathy of type 2 diabetes. Neurobiol. Dis. 45 (1), 280-287 (2012).
  6. Lauria, G., Lombardi, R., Camozzi, F., Devigili, G. Skin biopsy for the diagnosis of peripheral neuropathy. Histopathology. 54 (3), 273-285 (2009).
  7. Vlckova-Moravcova, E., Bednarik, J., Dusek, L., Toyka, K. V., Sommer, C. Diagnostic validity of epidermal nerve fiber densities in painful sensory neuropathies. Muscle Nerve. 37 (1), 50-60 (2008).
  8. Casanova-Molla, J., Morales, M., et al. Axonal fluorescence quantitation provides a new approach to assess cutaneous innervation. J. Neurosci. Methods. 200 (2), 190-198 (2011).
  9. Wang, L., Hilliges, M., Jernberg, T., Wiegleb-Edstrom, D., Johansson, O. Protein gene product 9.5-immunoreactive nerve fibres and cells in human skin. Cell Tissue Res. 261 (1), 25-33 (1990).
  10. Lauria, G., Morbin, M., et al. Expression of capsaicin receptor immunoreactivity in human peripheral nervous system and in painful neuropathies. J. Peripher. Nerv. Syst. 11 (3), 262-271 (2006).
  11. Penna, G., Fibbi, B., et al. Human benign prostatic hyperplasia stromal cells as inducers and targets of chronic immuno-mediated inflammation. J. Immunol. 182 (7), 4056-4064 (2009).
  12. Lentz, S. I., Edwards, J. L., et al. Mitochondrial DNA (mtDNA) Biogenesis: Visualization and Duel Incorporation of BrdU and EdU Into Newly Synthesized mtDNA In Vitro. J. Histochem. Cytochem. 58 (2), 207-218 (2010).
  13. Polydefkis, M., Hauer, P., Griffin, J. W., McArthur, J. C. Skin biopsy as a tool to assess distal small fiber innervation in diabetic neuropathy. Diabetes Technol. Ther. 3 (1), 23-28 (2001).
  14. Lauria, G. Small fibre neuropathies. Curr. Opin. Neurol. 18 (5), 591-597 (2005).
  15. Sorensen, L., Molyneaux, L., Yue, D. K. The relationship among pain, sensory loss, and small nerve fibers in diabetes. Diabetes Care. 29 (4), 883-887 (2006).
  16. Lauria, G., Morbin, M., et al. Axonal swellings predict the degeneration of epidermal nerve fibers in painful neuropathies. Neurology. 61 (5), 631-636 (2003).
  17. Herrmann, D. N., McDermott, M. P., et al. Epidermal nerve fiber density, axonal swellings and QST as predictors of HIV distal sensory neuropathy. Muscle Nerve. 29 (3), 420-427 (2004).
  18. Navarro, X. Chapter 27: Neural plasticity after nerve injury and regeneration. Int. Rev. Neurobiol. 87, 483-505 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Confocale microscopieimmunofluorescentieanalyseProtein Gene Product 9 5Tropomyosine receptor kinase Anociceptieve biomarkercoupes van huidbioptenmorfologische veranderingenpijnlijke neuropathie
Driedimensionale beeldvorming van Nociceptieve Intraepidermal zenuwvezels in Menselijke huid Biopsieën
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.