Scheiding van<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Stage-geïnfecteerde erythrocyten met magnetische middelen

Lorena Michelle Coronado; Nicole Michelle Tayler; Ricardo Correa; Rita Marissa Giovani; Carmenza Spadafora

doi:10.3791/50342

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Scheiding van

13.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50342

⸱

2 maart 2013

Lorena Michelle Coronado¹^,² , Nicole Michelle Tayler¹^,² , Ricardo Correa¹^,² , Rita Marissa Giovani³ , Carmenza Spadafora¹

¹Centro de Biología Celular y Molecular de Enfermedades, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT AIP), ²Acharya Nagarjuna University, ³Departamento de Medios y Creativo, Instituto de Investigaciones Científicas y Servicios de Alta Tecnología (INDICASAT AIP)

In dit artikel

Samenvatting

De paramagnetische eigenschappen van hemozoin gebruikt in latere stadia van isolaat Plasmodium falciparum-Geïnfecteerde rode bloedcellen groeien in cultuur. De methode is eenvoudig en snel en heeft geen invloed op de latere invasieve mogelijkheden van de parasieten.

Samenvatting

In tegenstelling tot andere soorten Plasmodium, P. falciparum kunnen worden gekweekt in het laboratorium, dat de studie ¹ vergemakkelijkt. Terwijl de behaalde parasitemie bereikt u de ≈ 40%-grens, de onderzoeker houdt meestal het percentage op ongeveer 10%. In veel gevallen moet de parasiet bevattende rode bloedcellen (RBC's) van de geïnfecteerde die, isoleren de te verrijken met een bepaald experiment gaan.

Toen P. falciparum infecteert de erytrocyten, de parasiet degradeert en voert uit hemoglobine ^{2, 3.} Wel moet de parasiet maken met een zeer giftige ijzerhoudende haem groep ^{4, 5.} De parasiet ontsnapt toxiciteit door het transformeren van de haem in een inert kristalpolymeer genoemd haemozoin ^{6, 7.} Dit ijzerhoudende molecule opgeslagen in de vacuole voedsel en metaal in een oxidatieve toestand heeft die verschilt van die in haem ^8. De ferri toestand van ijzer in de haemozoin haar een paramagnetische eigenschap afwezig is in niet-geïnfecteerde erythrocyten. Als de binnenvallende parasiet volwassen is, de inhoud van haemozoin verhoogt ook ^9, die nog meer paramagnetisme schenkt de laatste stadia van de P. falciparum in de erytrocyt.

Op basis van deze paramagnetische eigendom, de laatste stadia van de P. falciparum geïnfecteerde rode bloedcellen worden gescheiden door het passeren van de cultuur door een kolom met magnetische korrels. Deze kralen magnetisch worden wanneer de kolommen met hen op een magneethouder. Geïnfecteerde erytrocyten, vanwege hun paramagnetisme, wordt dan ingesloten in de kolom, terwijl de doorstroom bevat, voor het grootste deel, geïnfecteerde erytrocyten en die welke vroege stadia van de parasiet.

Hier beschrijven we de methodologie voor de bevolking van laat stadium parasieten verrijken met magnetische kolommen, die een goede parasiet levensvatbaarheid ¹⁰ onderhoudt.Nadat deze procedure kan de losse cultuur worden teruggestuurd naar een incubator om de resterende parasieten blijven groeien.

Protocol

Alle stappen van het protocol, behalve centrifugeren, worden uitgevoerd in een kap om het monster steriel.

1. Late Stage Isolatie van P. falciparum geïnfecteerde erythrocyten

Alle late stadia van Plasmodium-geïnfecteerde erythrocyten kunnen worden gescheiden met deze methode, aangezien hemozoin die paramagnetisme verleent de parasiet, een gemeenschappelijke metaboliet het genus. Een hoge parasitemie (3-10%) in cultuur wordt aanbevolen om betere opbrengsten te krijgen met dit protocol, maar een typische cultuur 2-4% hematocriet (volumepercentage van rode bloedcellen) en 1-8% parasitemie (percentage geïnfecteerde bevatten rode bloedcellen). Parasieten kunnen worden gekweekt zoals beschreven door Trager en Jansen ^1.

Een eenvoudige, multi-part setup moet worden gemonteerd voor elke schizont isolatie procedure. Hiervoor LS kolommen, een magnetische MidiMACS Separator en een MACS MultiStand van Miltenyi Biotec (figuur 1 ) gebruikt. Bevestig eerst de magnetische scheider naar de metalen standaard en plaats de magnetische kolom aan de afscheider.
In een afzonderlijke buis (gebruik in 50 ml conicals), meng 23,2 ml van RPMI 1640 en 750 ul van 7,5% natriumbicarbonaat het werk oplossing. Hebben extra buizen bij de hand voor het teruggooien en het verzamelen van de doorstroming van de parasiet cultuur.
3 ml van de oplossing werken de kolom te equilibreren en gooi de doorstroming in een buis.
Voeg 8 ml P. falciparum cultuur naar kolom zorgen dat zodra het laatste deel van het werk oplossing is geduwd uit de kolom door de cultuur wordt de ontvangende buis vervangen door een verzameling tot herstel van de vrije cultuur beginnen. Dit is noodzakelijk om verdunnen de cultuur verder.
Zodra de stroom van de cultuur door de kolom is beëindigd, voeg 1 ml van de oplossing werken de resterende RBC duwen van de kolom.
Wasstap: Voeg een 3 ml van de oplossing werken de kolom en verzamel de stromende vloeistof in de "ontdoen" tube om te voorkomen verdunnen cultuur opgeslagen als doorstroom in de andere buis.
Elutie: Wanneer de 3 ml zijn door de kolom geleid, deze loslaten van de stand en op een 15 ml buisje.
Nogmaals, 3 ml werk oplossing op de kolom. Deze stap elueert de erytrocyten geïnfecteerd met parasieten late die werden opgesloten in de kralen van de kolom.

Opmerking: Op dit punt, afhankelijk van de hoeveelheid vereiste parasieten, een ander rond / s bezit, uiteraard binnen de grenzen van de parasitemie in de oorspronkelijke cultuur. De kolom kan worden gebruikt zolang de stroming onderhoudt een steady state.

Concentratie van de verzamelde parasieten: Centrifugeer de 15 ml buis met het eluaat gedurende 5 min bij 150 xg bij kamertemperatuureen donkere pellet vormen van geparasiteerde erytrocyten.
Verwijder het supernatant met genoeg vloeistof een zeer klein monster te nemen en de concentratie en de totale opbrengst door microscopie bepalen (zie stap 2).
Op dit moment, als de isolatie en vastleggen van late parasieten naar tevredenheid uitgevoerd, opnieuw geïncubeerd de verzamelde cultuur met vers medium.
Verdun de verzamelde parasieten in het volume en oplossing nodig voor verdere experimenten.

2. Zuiverheid en opbrengst Analyse

Controleer de concentratie van parasieten verkregen door een hemocytometer en tellen onder een lichtmicroscoop. Te tellen, voeg 10 ul van de mix van de verzamelde parasieten en de media onder het deksel slip van de hemocytometer. Tel het aantal parasieten in de vier kwadranten van het hemocytometer en verdeel het totale aantal met 4. Vermenigvuldig dat met 10 ⁴ om de concentratie van geïnfecteerde e verkrijgenrythrocytes per ml.

Opmerkingen: a) De concentratie van het mengsel wordt bepaald door de gebruiker op het moment van resuspenderen van het pellet, door meer of minder medium. Voorgestelde werkconcentratie 5,5 X 10 ⁴ schizonten per ul (dit wordt typisch bereikt door toevoeging 100-300 pi de verzamelde parasieten). Als 20 ul van deze concentratie wordt toegevoegd aan een eindvolume van 100 pi mix van media en erytrocyten, een parasitemie van ongeveer 1% in een typisch 4% hematocriet cultuur worden verkregen. b) tellen onder hemocytometer moet snel, aangezien de erytrocyten start lyseren het monster droogt binnen de kamer. Geïnfecteerde erythrocyten, die moet de meerderheid zijn, zal een donkere vlek binnen, die hen ten opzichte van niet-besmette dieren.

Voer een dunne laag Giemsa kleuring om de zuiverheid van de collectie beoordelen door vaststelling van de slides zeer snel in 10% methanol, drogen, en onderdompelen tzoom in een 20% oplossing van Giemsa kleuring verdund met gedestilleerd water. Vlekken op de dia gedurende 10 min, waarna ze worden gedroogd door lucht en onder de microscoop onderzocht. Een parasitemie ruim boven de 70% haalbaar moeten zijn.