Meten Intracellulaire Ca 2 + Veranderingen in Human Sperm behulp Vier Technieken: Conventionele fluorometrie, Gestopt Flow fluorometrie, flowcytometrie en Single cell imaging

Summary

Intracellulaire Ca ^{2 +} Dynamieken zijn erg belangrijk in spermafysiologie en Ca ^{2 +}-Gevoelige fluorescente kleurstoffen vormen een veelzijdige tool om ze te bestuderen. Bevolking experimenten (fluorometrie en stopte doorstroming fluorometrie) en single cell experimenten (flowcytometrie en single cell imaging) worden gebruikt voor het volgen tijdruimtelijke [Ca ^{2 +}] Veranderingen in de menselijke zaadcellen.

Abstract

Spermatozoa zijn mannelijke voortplantingscellen speciaal ontworpen om te bereiken, herkennen en fuseren met het ei. Om deze taken uit te voeren, moet zaadcellen bereid zijn een voortdurend veranderende omgeving geconfronteerd en diverse fysieke barrières te overwinnen. Omdat het in wezen transcriptioneel en translationeel stille, deze beweeglijke cellen vertrouwen diep op diverse signalerende mechanismen om zich te oriënteren en zwemmen in een gerichte manier, en te kampen met uitdagende omgevingsomstandigheden tijdens hun reis naar de eicel te vinden. Vooral Ca ^{2 +-gemedieerde} signalering is cruciaal voor meerdere sperma functies: activering van motiliteit, capacitation (een complex proces dat sperma de acrosoomreactie bereidt) en acrosoomreactie (exocytotische een gebeurtenis die sperma-ei fusie maakt). Het gebruik van fluorescente kleurstoffen intracellulaire fluctuaties van deze ionen volgen is opmerkelijk belang vanwege hun gemak van toepassing, gevoeligheid en veelzijdigheid van deteel. Met behulp van een enkele dye-loading protocol gebruiken we vier verschillende fluorometrische technieken om toezicht te houden sperma Ca ^{2 +} dynamiek. Elke techniek geeft duidelijke informatie die het mogelijk maakt ruimtelijke en / of temporele resolutie, het genereren van data zowel op enkele cel en cel-populatie niveau.

Introduction

Ca ^{2 +} is een universele tweede boodschapper van signaaltransductie in eukaryote cellen. Intracellulaire Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +} _i) neemt deel aan de regulatie van vele fundamentele fysiologische processen zowel prikkelbaar en niet-exciteerbare cellen. Het belang en de universaliteit van Ca ^{2 +} als tweede boodschapper tijdens signaaltransductie gebeurtenissen wordt afgeleid uit zijn tijdruimtelijke veelzijdigheid in de overdracht van informatie binnen de cel. Terwijl ^{Ca2 +} kan niet worden gesynthetiseerd of afgebroken in de cel, de intracellulaire concentratie ^{([Ca2 +]} _i) blijven binnen zeer enge grenzen door verschillende cellulaire mechanismen die continu buffer, sekwestreren, hokjes en / of verzamelen ^{Ca2 +.} Veranderingen in de concentratie van deze ionen kan op zeer gelokaliseerde gebieden binnen de cel ¹ en ontcijferen dergelijke schommelingen essentieel voor het verkrijgen van een deEPER begrip van (1) hun rol in de signalering mechanisme, (2) hun fysiologische betekenis, en (3) de algemene mechanismen van cell signaling. Ca ^{2 +-gemedieerde} signaaloverdracht is van bijzonder belang in spermafysiologie ^2. De beweeglijkheid van sperma is een van de belangrijkste functies voor bevruchting succes en in feite kunnen verschillende motiliteit gebreken steriliteit ^3-5 veroorzaken. Het belang van ^{Ca2 +} in flagellaire beweging sinds lang bekend ^6, maar is het mechanisme van hoe ^{Ca2 +} controleert de specifieke vorm van flagellaire buigen niet volledig begrepen.

Voordat fuseren met het ei, moet spermatozoa capacitation, een complex proces afhankelijk sperma residence in het vrouwelijke darmkanaal ondergaan. Tijdens capacitation, worden de zaadcellen membraan lipide architectuur en organisatie aangepast, voornamelijk als gevolg van cholesterol verwijdering uit de plasmamembraan. Bovendien zijn een aantal eiwitten tyrosine-fosforylated ^7. Belangrijker is dat uit capacitation er een toename in de intracellulaire pH (pH _i) en [Ca ^{2 +]} _i, en de membraanpotentiaal hyperpolariseert bij sommige species ^2. Capacitatie vindt alleen plaats in een subpopulatie van spermatozoa (20-40%), en het betrokken zijn bij al deze cellulaire veranderingen mechanismen zijn verre van duidelijk. Algemeen wordt aangenomen dat slechts een subpopulatie van capacitated zaadcellen ondergaan acrosoomreactie (AR) bij blootstelling aan fysiologische spoelen. De AR is een ^{Ca2 +-gereguleerde} geval gehouden meststof voor alle soorten bezitten een acrosome (gespecialiseerd organel met buitenste en binnenste membranen). Tijdens dit proces worden de buitenste membraan acrosomale zekeringen met plasmamembraan van het sperma, het vrijgeven van hydrolytische enzymen die het mogelijk maken de zaadcel naar de glyco-eiwit-matrix rond het ei (zona pellucida, of ZP) penetreren. De AR onthult een nieuwe fusogenic zaadcel oppervlak dat samenwerkt methet ei plasmamembraan voor de uiteindelijke fusie van beide gameten. Er zijn verschillende cellulaire liganden die induceren AR, progesteron een van de meest bestudeerde onder hen.

In dit werk presenteren we vier verschillende technieken met gebruik van een ^{Ca2 +-gevoelige} fluorescente kleurstof te meten [Ca ^{2 +]} _i veranderingen in menselijk sperma veroorzaakt door progesteron (behalve flowcytometrie, waarin wij meten de [Ca ^{2 +} ] _i verhoging geïnduceerd tijdens de in vitro capacitation proces). In dit geval gebruikten we Fluo-3 AM (Life Technologies, Grand Island, NY), een membraan-doorlatende kleurstof met een _Kd = 325 nM. In vitro bewaakt we fluorescentie verandert als een functie van tijd met drie van de methoden, en met de vierde techniek die we gemeten fluorescentie waarde op een bepaald tijdstip. Deze verschillende benaderingen vullen elkaar aan, omdat helemaal bieden zij de ruimtelijke en temporele resolutieolution op zowel de enkele cel en cel-populatie niveau.

Cel Bevolking of Bulk Experimenten

Bulk technieken worden veel gebruikt niet alleen omdat de instrumenten die zij nodig zijn direct beschikbaar, maar ook omdat ze eenvoudig, goed ingeburgerd, en zorgen voor de middeling van de gegevens van metingen op miljoenen cellen in een enkel experiment.

Techniek # 1. Conventionele fluorometrie
Deze techniek bewaakt veranderingen in fluorescentie als functie van de tijd, de experimenten worden uitgevoerd in glazen cuvetten met monsterhoeveelheden van 200 tot 1.000 III. Goede menging van de toegevoegde reagentia vereist magnetisch roeren, en derhalve de temporele resolutie verkregen in de orde van seconden. De normale mobiele concentratiebereik van de geanalyseerde monsters 10 ⁵ -10 ⁸ cellen / ml.

Techniek # 2. Gestopt Flow fluorometrie
Tzijn techniek volgt ook veranderingen in fluorescentie als functie van de tijd, maar de reagentia worden snel gemengd (met druk) in een opname cuvet met een zeer klein monstervolume (variërend 25-100 pl). Daarom homogenisering van reagentia onmiddellijk, waardoor een hoge temporele resolutie in de orde van milliseconden. Analyse van de verkregen fluorescentie vs tijd sporen geschikt voor het bepalen van reactiesnelheden, ophelderen van de complexiteit van het reactiemechanisme, verkrijgen van informatie over kortstondige reactietussenproducten, etc. De gemeenschappelijke cel concentratiebereik van de geanalyseerde monsters 10 ⁵ -10 ⁷ cellen / ml.

Single Cell Experimenten

Bulk experimenten rapporteren het gemiddelde gedrag van een groot aantal cellen, maar kan een populatie vertonen vaak heterogeen kenmerken die het hoofd gezien gedurende deze soort metingen. Enkele cel technieken worden dus gebruikt om e te vullene informatie verkregen met celpopulatie experimenten.

Techniek # 3. Flowcytometrie
Ondanks het belang van de gegevens verkregen uit een cel metingen is het belangrijk om een ​​groot aantal cellen te analyseren om de onjuiste extrapolatie van celspecifieke eigenschappen om een ​​gehele populatie te voorkomen. Daarom worden high-throughput technieken voorkeur en de meest populaire methode is flowcytometrie, waarbij 10.000 cellen per conditie conventioneel geanalyseerd. Deze methode maakt multi-parametrische analyse van heterogene bevolking als het categoriseert cellen op basis van hun grootte (voorwaartse verstrooiing (FSC)), granulariteit (zijwaartse verstrooiing (SSC)) en fluorescentie-intensiteit (specifieke etiketteringsvoorschriften met een antilichaam, levensvatbaarheid marker, enz.) , waardoor het verstrekken van informatie over de distributie van de parameters 'voor een groep cellen. Flowcytometrie biedt direct plaats tijdsafhankelijke informatie ^8. Voorwaartse en zijwaartse verstrooiing waarden are ook nuttig voor het selecteren van een poort die cellen omvat maar discrimineert celresten, stof, enz. Voor fluorescentiemetingen, negatieve en positieve controles fluorescentie moet worden opgenomen. Als meer dan een fluorescentie kanaal wordt gebruikt, moet een proces dat bekend staat als compensatie worden uitgevoerd (voor details zie http://www.bdbiosciences.com/resources/protocols/setting_compensation.jsp ). Compensatie zorgt voor spectrale overlap discriminatie tussen fluoroforen. Flowcytometrie kan ook discriminatie van dode cellen, gewoonlijk door middel van propidium jodide kleuring.

Techniek # 4. Single Cell Imaging
Microscopie is een andere veel voorkomende methode om enkele cel gedrag te bestuderen, het is goed geschikt voor tijdsafhankelijke studies en het biedt ook ruimtelijke resolutie. Een belangrijk nadeel is dat de hoge-doorvoer analyse is nog in de kinderschoenen momenteel ^9.

Protocol

In dit artikel beschrijven we het gebruik van de vier hiervoor genoemde technieken voor het meten van [Ca ^{2 +]} _i veranderingen in menselijke zaadcellen. We gebruikten progesteron een ^{Ca2 +} respons teweegbrengen, zoals vaststaat dat deze steroïden veroorzaakt een voorbijgaande [Ca ^{2 +]} _i toename spermatozoa. Vooral in menselijk sperma, progesteron activeert direct een ^{Ca2 +-kanaal} (namelijk CatSper) uitsluitend uitgedrukt in de plasmamembraan van zaadcellen ^10,11. We maten ook resting [Ca ^{2 +]} _i vóór en na capacitation aangezien het ook algemeen aanvaard dat een toename van [Ca ^{2 +]} _i optreedt tijdens capacitation. Voor technieken die een positieve controle gebruikten we een ^{Ca2 +} ionofoor ionomycine naar maximaal ^{Ca2 +} opname induceren in de cel en dus maximale fluorescentie respons, de minimale fluorescentie waarde, we gebruikten Mn ^{2 +} te lessen fluorescentie.

1. Sperma Monstervoorbereiding door de Swim-up-methode (zie figuur 1)

Gebruik alleen ejaculated monsters (verkregen door masturbatie) waarvan de eigenschappen voldoen aan de vastgestelde parameters van de laatste editie van de World Health Organization laboratorium handleiding (beschikbaar op http://whqlibdoc.who.int/publications/2010/9789241547789_eng.pdf ) voor het onderzoek en verwerking van menselijk sperma.

1. Verkrijgen van het sperma monster in een steriele verpakking en leg het (met los deksel) in een incubator bij 37 ° C en CO ₂ 5% / 95% lucht gedurende 30 minuten. Deze stap is voor het monster vloeibaar maken.
2. Plaats 500 gl aliquots van de vloeibare sperma onderaan schone reageerbuizen (1,0 x 7,5 cm). Ongeveer acht reageerbuizen nodig van gemiddeld gewicht monster (4 ml).
3. Zorgvuldig layer 1 ml Ham's F-10 medium (su. pplemented met 2 mM _CaCl2 en 5 mg / ml bovine serum albumine capacitation in vitro) bevorderen op elkaar sperma monster (zie figuur 1) TIP: Druk op de wand van de buis met de punt van de micropipet, en zachtjes afzien het medium boven het monster. Het is cruciaal om langzaam te doen zoals het mengen van beide lagen (monster en medium) moet worden vermeden.
4. Leun voorzichtig de buizen tot een hoek van 30 ° ongeveer. Dit oppervlak toenemen tussen de twee vloeistoffen, waardoor de verplaatsing (swim-up) van menselijke cellen uit het monster aan het medium tijdens incubatie verbeteren.
5. Plaats de groep boog reageerbuizen in een incubator bij 37 ° C en 5% CO _2/95% lucht gedurende 1 uur.
6. Met behulp van een micropipet verwijder voorzichtig de bovenste 700 pl HAM's F-10 medium (nu met beweeglijke spermatozoa) van elke buis en zwembad alle verzamelde monsters in een schone glazen buis (1.0 x 7.5 cm, voor grotere volumes maken gebruik van een 15 mlFalcon buis), het vermijden van blaasjes. Plaats 10 ul van gepoolde monster op de optische vlakglas van een Makler Tellen Kamer basis, en leg dan de dekking van glas (zodra het deksel op zijn plaats is, vermijd tillen of weer met betrekking tot de uniforme verspreiding van het spermastaal te behouden). Zorg ervoor om blaasvorming te voorkomen in de kamer, omdat dit zou leiden op een onjuiste celgetal.
7. De plaat onder een samengestelde microscoop (het gebruik van een 20X objectief wordt aanbevolen). De dekking van glas van de Makler Counting Kamer heeft een groot plein bestaat uit 100 kleinere vierkantjes (dwz een 10 bij 10 raster). Tel de cellen in een strook van 10 vierkantjes. Dit aantal vertegenwoordigt de concentratie in miljoen cellen / ml. Herhaal de telling in twee extra 10-vierkante strips, en berekent het gemiddelde van de drie punten. OPMERKING: Als een Makler telkamer (die speciaal is ontworpen om zaadcellen tellen) niet beschikbaar is, kan elke hemocytometer kamer worden gebruikt.
8. Pas fina het monsterl concentratie 1x10 ⁷ cellen / ml aangevuld in Ham's F-10 medium. Indien nodig, incuberen van het monster bij 37 ° C en 5% CO _2/95% lucht gedurende 5 uur tot capacitation promoten.

2. Fluorescerende kleurstof laden voor Ca ^{2 +} Metingen

Er zijn verschillende fluorescente kleurstoffen beschikbare intracellulaire Ca ^{2 +} te meten, waarbij een adequate men moet worden gekozen volgens de _Kd en de emissie-en excitatiegolflengten (kwalitatieve en kwantitatieve metingen, enkele en dubbele emissie en excitatiegolflengten, respectievelijk moet gebruikt) meer informatie). Voor de huidige kwalitatieve applicatie gebruikten we Fluo-3 AM, een cel-permeant kleurstof met een K _d = 325 nM, en enkele emissie en excitatie golflengten van 506/526 nm, respectievelijk ^12.

1. Bereid 50 pi van een 1 mM Fluo-3:00 voorraadoplossing door oplossen van de inhoud van een 50 ug kleurstof flacon (MW = 1130 g / mol) in 44 pl watervrije DMSO.
2. Met een 1,5 ml microcentrifugebuis mengen van de benodigde hoeveelheid spermasuspensie (zie benodigde hoeveelheid voor elke specifieke techniek hieronder) met voldoende 1 mM Fluo-3:00 voorraadoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 2 uM Fluo-3 AM (dus 1 pl vinden voorraad Fluo-03:00 wordt toegevoegd voor elke 500 ul van sperma schorsing).
3. Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C en beschermd tegen licht.
4. Centrifugeer de buis bij 750 g gedurende 5 min met behulp van een microcentrifuge, zuigen en gooi het supernatant en resuspendeer de pellet in het juiste volume (zie vereiste concentratie voor elke specifieke techniek hieronder) van Human Sperm Medium (HSM; mM: 120 NaCl, 15 _NaHCO3 , 4 KCl, 1,8 _CaCl2, 1 _MgCl2, 10 HEPES, 10 Na lactaat, 5 D-glucose, 1 Na pyruvaat, pH = 7,4) Opmerking: De vorming van een wolk in plaats van een pellet geeft aan dat de cellen in goede staat.
5. De cellen worden nu geladen met de kleurstof, en levensvatbaar blijven (bij 37 ° C bewaard en beschermd tegen licht) gedurende ongeveer twee uur, en kan worden gebruikt in elk van de volgende technieken.

3. Techniek # 1. Conventionele fluorometrie (Gemiddeld Informatie van een groot Cel Bevolking)

Uitrusting: Voor onze sperma bevolking [Ca ^{2 +]} _i metingen gebruiken we een SLM Aminco spectrofluorometer geëxploiteerd door Olis software (Bogart, GA, USA) met magneetroerder controle (SIM Aminco), en gekoppeld aan een blauwe LED (Luxeon Star LXHL- LB3C, uit LUMILEDS) en een 465-505 nm banddoorlaatfilter (Chroma Technology Corp) voor TL-03:00 excitatie. De LED wordt geregeld door een op maat gemaakte voeding (700 mA). Emissie licht wordt gemeten door de emissie golflengte (λ _Em) tot 525 nm op monochromator de spectrofluorometer's.

1. Plaats 570 pl van HSM en 30 ul van sperma celsuspensie (eerder geladen met Fluo-3 AM en geresuspendeerd in HSM tot 1x10 ⁸ cellen / ml te verkrijgen) in een vlakke bodem glazen buis (ID 8 x 50 mm). Plaats een magnetische roerstaaf in de buis en steek de buis in het lezen van kamer van de spectrofluorometer (voorverwarmd tot 37 ° C), roer het monster gedurende al de acquisitie tijd.
2. Start de experiment met software van de apparatuur (Olis software in dit geval) en verder met fluorescentie waarden bij een frequentie van 0,5 Hz verwerven gedurende 300 sec. Breng de gewenste test verbindingen door injectie van het juiste volume van een stockoplossing (algemeen 100X meer geconcentreerd dan de gewenste uiteindelijke concentratie) met behulp van een Hamilton micro-injectiespuit als volgt:
   1. Verwerven basale fluorescentie gedurende 30 sec.
   2. Voeg 4 uM progesteron (Pg).
   3. Bij 100 sec commentaar 20 uM ionomycine (als een positieve controle, de maximale fluorescentie waarde te verkrijgen).
3. Voer een negatieve controle door het herhalen van de stappen 3.1 tot en met 3.2.3, maar het toevoegen ipv Pg alleen het oplosmiddel dat gebruikt wordt om het op te lossen (HSM met 0,01% watervrij DMSO).
4. Exporteren ruwe fluorescentie-intensiteit waarden naar Microsoft Excel en normaliseren ze met behulp van de volgende vergelijking: (F/F0) - 1. Waarbij F de fluorescentie-intensiteit gemeten op elk tijdstip (t) en F0 de gemiddelde basale fluorescentie die tijdens de eerste 30 sec. Plot de totale reeks (F/F0) - 1 waarden versus de tijd (Figuur 2A). Meet het verschil tussen de fluorescentie-intensiteit waarden vóór en na de toevoeging van de testverbindingen (AF), plot ze op een staafdiagram en de data volgens de toepasselijke statistische analyse methoden (figuur 2B) verwerken.

4. Techniek # 2. Gestopt Flow fluorometrie (Informatie met hoge tijdsresolutie van een groot Cel Bevolking)

Uitrusting: Intracellulaire [Ca ^{2 +]} wijzigingen gemeten hoge temporele resolutie met een SFM-20 gestopte stroming mixer gekoppeld met een MOS-200 snelle kinetiek optisch systeem, zowel BioLogic wetenschappelijke instrumenten (Grenoble, Frankrijk). Alle gegevens worden geanalyseerd met Bio-Kine32 software van hetzelfde bedrijf.

1. Stel de juiste condities in de apparatuur, de lichtbron moet worden ingeschakeld ten minste 15 minuten vóór het begin van het experiment; passen excitatie en emissie filters, de photomultiplier passen aan een spanning binnen het bereik dat is vastgesteld door de gestopte-flow fabrikant, en stel de badtemperatuur bij 37 ° C.
2. Vul een van spuiten van het instrument met 1 ml van Fluo-3:00 geladen spermacellen (1x10 ⁷ cellen / ml) en de tweede spuit met 1 ml van de te testen verbinding of HSM (negatieve controle),10 uM ionomycine (positieve controle) of 10 uM Pg opgelost in HSM. Opmerking: In deze stap is het cruciaal om blaasvorming te voorkomen tijdens het tekenen van de vloeistoffen in de spuiten.
3. Til beide instrument zuigers tot ze de punt van de spuit plunjers raken.
4. Stel het debiet aan de minimale waarde die een meetbare respons zal verstrekken om celbeschadiging te minimaliseren. Het debiet we gebruiken in de SFM-20 systeem is 1 ml / sec ^13.
5. De frequentie (in dit geval 10 msec) en de totale bemonsteringstijd (hier 50 sec).
6. Trigger het mengen van reagentia. OPMERKING: Terwijl de ene trigger tegelijk handmatig kan worden gemaakt, kan een reeks van automatische achtereenvolgende triggers voorgeprogrammeerd worden ook.
7. Het trace van rauwe fluorescentie (willekeurige eenheden) versus de tijd wordt weergegeven op het computerscherm.
8. Het mengen van de reagentia per se een spoor dat geen rechte lijn genereren. Dus, om de werkelijke [Ca vinden2 +] verandering afgeleid van een stimulus, de controle patroon dat is verkregen door het mengen van cellen met medium (negatieve controle) worden afgetrokken van elk van de experimentele sporen. Analyseren van gegevens zoals vereist; sommige kinetiek parameters kunnen ook worden verkregen met de Bio-Kine32 acquisitie software. Ruwe sporen zonder aftrek worden getoond in Aanvullende figuur 1 voor vergelijking.
9. Aan het reagens te veranderen in de teststof spuit, reinig deze grondig met gedestilleerd water. Vul dan de spuit om zijn maximale volume met gedestilleerd water, plaats het in het corresponderende zuiger van de gestopte-flow fluorometer en duw het water door het interne mechanisme (het spoelwater moet worden gericht aan de afvalcontainer). Herhaal deze stap nog twee keer.
10. Herhaal de stappen 4,2-4,9, het vullen van de tweede spuit met de volgende gewenste test-verbinding.
11. Aan het einde van het experiment, spoel de gehele uitrusting met gedestilleerd water, volledig aftappen van het water uit deinterne slangen.

5. Techniek # 3. Flowcytometrie (Single Cell Informatie verkregen uit een groot aantal cellen)

Uitrusting: Deze techniek maakt de gelijktijdige meting van verschillende parameters in een ogenblik in de tijd, maar in tegenstelling tot de voorgaande technieken is het niet verandert meten tijd, plaats het de parameterwaarden op het moment van de meting. Daarom, in plaats van het toevoegen Pg de respons activeren, in dit geval hebben gemeten intracellulaire ^{Ca2 +} niveaus in spermacellen voor en na inductie capacitation. We gebruikten een FACSCanto Cytometer (Becton Dickinson) en de gegevens werden geanalyseerd met FlowJo software (Tree Star 9.3.3).

1. Bereid de experimentele monsters in buizen cytometer door het plaatsen van 500 ui celsuspensie (4x10 ⁶ cellen / ml) per buis onder elke conditie te testen (in casu tien voorwaarden, zie tabel 1). Verzamel fluorescentie gegevens from 10.000 gebeurtenissen per monster.
2. Voor het opzetten van een experiment met de apparatuur software om:
   1. Maak een nieuwe: folder, experiment, monster en aantal buizen.
   2. Selecteer de juiste cytometer instellingen voor TL-03:00 (gebruik FITC-fluoresceïneisothiocyanaat-filter) en PI (gebruik PI-propidiumjodide-filter).
3. Voer de ongekleurde controle buizen 1 en 2 in de cytometer. Verzamel FSC en SSC-gegevens te controleren die drempel instellingen geschikt zijn en aan de bijbehorende poort creëren om puin te onderscheiden van cellen.
4. Op schadevergoeding controls maken, voert u de volgende controle monsters, het verzamelen van auto en maximale fluorescentie data (PI en FITC kanalen) (NB: deze taak wordt meestal uitgevoerd door technici van de apparatuur):
   - Ongekleurde cellen (buizen 1 en 2).
   - Cellen geladen met Fluo-3 AM (2 uM) (buizen 3 en 4).
   - Dode cellen (spermatozoa gesuspendeerd in 0,1% Triton X-100 in HSM gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur)gekleurd met PI (1,2 uM PI, dus 0,25 pi 2,4 mM PI wordt toegevoegd aan 500 ui spermasuspensie) gedurende 30 min bij 37 ° C, beschermd tegen licht (tubes 5 en 6).
   • Bekijk geregistreerde gegevens en selecteer de poort voor de gewenste populatie.
   • Stel de poort en selecteer "Apply" om alle Compensatie Controls.
   • Selecteer experiment> compensatie setup> berekenen compensatie.
   • Hernoem de compensatie setup en koppeling & slaan.
5. Voer alle experimentele buizen (in casu tubes 7-10). Op het einde, exporteren alle gegevens om de beschikbare software voor analyse (zie stap 5.6).
6. Analyseer de resultaten van elk experiment met behulp van de apparatuur software in de handel verkrijgbare software of FlowJo Cytobank free software ( http://www.cytobank.org/ ).

6. Techniek # 4. Single Cell Imaging (Single Cell Informatie met hoge ruimtelijke resolutie)

Uitrusting:. Custom-built Imaging set-up Onze beeldvorming set-up is samengesteld uit een omgekeerde Nikon Diaphot 300 microscoop voorzien van een temperatuurregelaar (Medical System Corp, Greenvale, NY), een Nikon PlanApo 60X (1,4 NA olie-immersie) doelstelling. Fluorescentie verlichting wordt geleverd door een Luxeon V Star Lambertiaanse Cyan LED part # LXHL-LE5C (Lumileds Lighting LLC, San Jose, CA) bevestigd aan een custom-built stroboscopische schakelkast. De LED werd in een FlashCube40 assemblage met dichroïsche spiegel M40-DC400 (Rapp Opto Electronic, Hamburg, Duitsland) (: excitatie 450-490 nm, dichroïsche spiegel 505 nm en emissie 520-560 nm bandbreedte) gemonteerd. LED-uitgang werd gesynchroniseerd met de belichting Out signaal van een Cool Snap CCD-camera via de regelkast op een enkele flits van 2 msec duur per individuele belichting te produceren. De belichtingstijd camera werd ingesteld gelijk aan het flash duration (2 msec). Beelden worden verzameld elke 250 msec (of kan worden aangepast aande gewenste temporele resolutie) met behulp van IQ-software (Andor Bioimaging, Wilmington, NC).

1. Bereid ronde dekglaasjes (diameter = 25 mm) door een 5-ul druppel poly-L-lysine-oplossing (0,01% w / v) in het midden. Laat het staan ​​voor ten minste 1 uur (het kan drogen). Met behulp van een spuitfles afspoelen behandeld met water voor gebruik. Deze procedure zal zaadcellen te houden aan de cover slip uit hun hoofd, terwijl hun flagellum kan nog steeds bewegen.
2. Bereid de testen door op te lossen in HSM volgens tabel 2 verbindingen. Verbindingen worden achtereenvolgens toegevoegd in dezelfde opname kamer, door steeds hetzelfde volume toe, en de concentratie van de stockoplossing met inachtneming van de verdunning passen zal hebben wanneer gemengd met het volume reeds in de kamer (zoals aangegeven in Tabel 2). Houd alle testoplossingen in een bad bij 37 ° C totdat ze worden gebruikt.
3. Monteer het deksel slip in de recOrding kamer en plaats 10 ul van Fluo-03:00-geladen cellen (1 x 10 ⁷ cellen / ml) in het centrum. Behandel de cellen met 200 ul voorverwarmde HSM.
4. Plaats de ruimte op het podium van de microscoop voorverwarmd tot 37 ° C, bekijk de cellen (met behulp van fase-contrast) en een gebied selecteren voor de beeldvorming. Het is belangrijk om een gebied waar celdichtheid dient (zie figuur 5A) selecteren teveel cellen te maken analyse bemoeilijkt door overlappende signalen OPMERKING: De cellen moeten stevig aan het dekglas van het hoofd worden bevestigd maar vertonen flagellaire beweging, hetgeen bevestigt. levensvatbaarheid.
5. Acquire fluorescentie beelden in live-modus om de scherpstelling en de helderheid aan te passen.
6. Start het experiment door het activeren van de tijdreeksen afbeelding acquisitie software (IQ in dit geval). Normaal gesproken vier beelden worden per seconde verworven met verlichting van 2 msec per beeld.
7. Gebruik een micropipet zorgvuldig te voegen (druppelsgewijs) de test-verbinding (Pg in dit geval), blijven image verwerving vereist en voeren twee stappenreeksprogramma toevoegingen in dezelfde kamer: (1) 20 uM ionomycine maximale fluorescentie te verkrijgen en (2) 5 mM _MnCl2 minimum fluorescentie te verkrijgen. Alternatief kunnen verbindingen worden toegevoegd met behulp van een perfusie kamer die de voordelen van het inschakelen stimulus verwijderd en het vermogen gelijkmatig wassen van de cellen met de verbinding biedt. Tegelijkertijd, heeft het de nadelen van die grotere hoeveelheden oplossing en maken temperatuurcontrole problematisch.
8. Herhaal acquisitie in een nieuwe kamer met elke gewenste test-verbinding.
9. Voer beeldanalyse online met behulp van de apparatuur van de software, of offline met behulp van IQ software of Afbeelding J freeware. Teken de regio van belang (ROI) rond elke cel (of een deel van de cel) en een cel-vrij gebied (voor automatische achtergrond aftrekken door de software) te selecteren ook. Een time-fluorescentie-intensiteit serie wordt dan verkregen voor elke ROI en deze gegevens may naar Microsoft Excel worden geëxporteerd voor verdere analyse. We normaliseren fluorescentie intensiteit waarden met de volgende vergelijking: (F/F0) - 1. Waarbij F de fluorescentie-intensiteit gemeten op elk tijdstip (t) en F0 is de gemiddelde fluorescentie die tijdens de eerste 30 sec. Plot de totale reeks (F/F0) - 1 tegen de tijd (figuur 5B). Waarden kunnen worden genormaliseerd met de fluorescentiewaarde verkregen na toevoeging ionomycine als 100%.
10. Image Analysis kunnen ook worden uitgevoerd met Image J vrije software.

Techniek # 1. Conventionele fluorometrie

Progesteron is een van de bekende AR inductoren en, zoals verwacht, het doet veroorzaken een tijdelijke [Ca ^{2 +]} _i toename menselijk sperma (figuur 2). Toevoeging van een calciumionofoor (ionomycine) veroorzaakt de maximum [Ca ^{2 +]} _i te verhogen, dat niet terug naar basale niveaus.

Techniek # 2. Sgetopte Flow fluorometrie

De progesteron-geïnduceerde [Ca ^{2 +]} _i toename werd gemeten zoals eerder (conventioneel fluorometrie), maar dan met meer temporele resolutie, in dit geval de frequentie van overname bedroeg 0,1 Hz. Zoals getoond in figuur 3, zowel progesteron (voorbijgaand, rode lijn) en ionomycine (aanhoudende, blauwe lijn) veroorzaakte een snelle [Ca ^{2 +]} _i te verhogen. Het ontbreken van een vertraging in de progesteron-geïnduceerde [Ca ^{2 +]} i stijging is consistent met eerdere rapporten suggereren dat progesteron activeert de Ca ^{2 +-kanaal} CatSper, zonder tussentijdse signalering ^10,14 direct.

Techniek # 3. Flowcytometrie

[Ca ^{2 +]} _i werd gemeten in capacitated en niet-capacitated humaan sperma. Zoals eerder in muis ^15, bovine sperma ¹⁶ en menselijk sperma ^17, we ook waargenomen verhoogde [Ca ^{2 +]} _i in capacitated vergelijking met niet-capacitated humaan sperma. Baldi et al.. (1991) ¹⁷ rapporteerden hogere basale [Ca ^{2 +]} i in capacitated dan bij niet-capacitated humaan sperma met conventionele fluorometrie. In dit werk hebben we gebruik gemaakt van flowcytometrie om [Ca ^{2 +]} _i te meten vóór en na in vitro capacitation. Flowcytometrie kunnen wij zien dat de verdeling van fluorescentie waarden capacitated sperma (figuur 4D, blauw spoor) wordt verschoven naar hogere waarden in vergelijking met niet-capacitated sperma (figuur 4D, rood trace). De fluorescentie waarden voor elke cel kan worden waargenomen in de tweedimensionale puntdiagrammen figuur 4G, belangrijker, het signaal als gevolg van dode cellen (ongeveer 15%) worden verwijderd (figuur 4G, bovenste kwadranten).

Techniek # 4. Single Cell Imaging

De progesteron-inducerend [Ca ^{2 +]} _i verandering werd gemeten in enkele zaadcellen. Progesteron Bovendien veroorzaakt een toename in [Ca ^{2 +]} _i zowel het sperma hoofd en in de flagellum. Zoals waargenomen in de bevolking experimenten, single cell analyse bleek een voorbijgaande en een aanhoudende stijging van progesteron en ionomycine, respectievelijk.

Results

Figuur 1. Schematische weergave van het experimentele protocol voor sperma monstervoorbereiding door de opzwem-methode. De belangrijkste stappen voor het scheiden van beweeglijk sperma of de aanpassing van de concentratie geïllustreerd. De laatste incubatie stap wordt alleen uitgevoerd wanneer capacitation vereist.

...

Discussion

Intracellulaire signalering is essentieel voor de meeste cellulaire activiteiten, Ca ^{2 +} is een alomtegenwoordige boodschapper die zoogdiercellen begeleidt gedurende hun gehele levensduur, van het begin bij de bevruchting, tot het einde van hun levenscyclus. In reactie op verschillende stimuli, [Ca ^{2 +]} i toeneemt, oscilleert en neemt spatio-temporele codering, worden bijgevolg diverse processen geactiveerd, gemoduleerd of beëindigd door Ca ^{2 +-gecodeerde} berichten. Intracellulaire Ca

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ham's F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-7906
Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Counting Chamber	SEFI Medical Instruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 vials/50 μg elk
Ionomycin	Alomone	I-700
Progesterone	Sigma-Aldrich	P0130
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)
Sodium bicarbonate	JT Baker	3506	Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M-2670	Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)
Calcium chloride anhydrous	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)
Sodium L-lactate (aprox. 99%)	Sigma-Aldrich	L- 7022	Reagentia voor menselijk sperma-medium (HSM)
Propidium Iodide	Invitrogen	L-7011	Component B
Triton X-100 (t-Octylfenoxypolyethoxyethanol)	Sigma- Aldrich	X-100	2,4 mM oplossing in water
Round coverslip	VWR	48380 080	25 mm diameter
Poly-L-lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Cell Chamber, voor microscopie	Life technologies	A-7816
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650	5x5 ml