Meten Intracellulaire Ca 2 + Veranderingen in Human Sperm behulp Vier Technieken: Conventionele fluorometrie, Gestopt Flow fluorometrie, flowcytometrie en Single cell imaging

Summary

Intracellulaire Ca ^{2 +} Dynamieken zijn erg belangrijk in spermafysiologie en Ca ^{2 +}-Gevoelige fluorescente kleurstoffen vormen een veelzijdige tool om ze te bestuderen. Bevolking experimenten (fluorometrie en stopte doorstroming fluorometrie) en single cell experimenten (flowcytometrie en single cell imaging) worden gebruikt voor het volgen tijdruimtelijke [Ca ^{2 +}] Veranderingen in de menselijke zaadcellen.

Abstract

Spermatozoa zijn mannelijke voortplantingscellen speciaal ontworpen om te bereiken, herkennen en fuseren met het ei. Om deze taken uit te voeren, moet zaadcellen bereid zijn een voortdurend veranderende omgeving geconfronteerd en diverse fysieke barrières te overwinnen. Omdat het in wezen transcriptioneel en translationeel stille, deze beweeglijke cellen vertrouwen diep op diverse signalerende mechanismen om zich te oriënteren en zwemmen in een gerichte manier, en te kampen met uitdagende omgevingsomstandigheden tijdens hun reis naar de eicel te vinden. Vooral Ca ^{2 +-gemedieerde} signalering is cruciaal voor meerdere sperma functies: activering van motiliteit, capacitation (een complex proces dat sperma de acrosoomreactie bereidt) en acrosoomreactie (exocytotische een gebeurtenis die sperma-ei fusie maakt). Het gebruik van fluorescente kleurstoffen intracellulaire fluctuaties van deze ionen volgen is opmerkelijk belang vanwege hun gemak van toepassing, gevoeligheid en veelzijdigheid van deteel. Met behulp van een enkele dye-loading protocol gebruiken we vier verschillende fluorometrische technieken om toezicht te houden sperma Ca ^{2 +} dynamiek. Elke techniek geeft duidelijke informatie die het mogelijk maakt ruimtelijke en / of temporele resolutie, het genereren van data zowel op enkele cel en cel-populatie niveau.

Introduction

Ca ^{2 +} is een universele tweede boodschapper van signaaltransductie in eukaryote cellen. Intracellulaire Ca ^{2 +} (Ca ^{2 +} _i) neemt deel aan de regulatie van vele fundamentele fysiologische processen zowel prikkelbaar en niet-exciteerbare cellen. Het belang en de universaliteit van Ca ^{2 +} als tweede boodschapper tijdens signaaltransductie gebeurtenissen wordt afgeleid uit zijn tijdruimtelijke veelzijdigheid in de overdracht van informatie binnen de cel. Terwijl ^{Ca2 +} kan niet worden gesynthetiseerd of afgebroken in de cel, de intracellulaire concentratie ^{([Ca2 +]} _i) blijven ....

Protocol

In dit artikel beschrijven we het gebruik van de vier hiervoor genoemde technieken voor het meten van [Ca ^{2 +]} _i veranderingen in menselijke zaadcellen. We gebruikten progesteron een ^{Ca2 +} respons teweegbrengen, zoals vaststaat dat deze steroïden veroorzaakt een voorbijgaande [Ca ^{2 +]} _i toename spermatozoa. Vooral in menselijk sperma, progesteron activeert direct een ^{Ca2 +-kanaal} (namelijk CatSper) uitsluitend uitgedrukt in de plasmamembraan van zaadcellen ^10,11. We maten ook resting [Ca ^{2 +]} _i vóór en na capacitation aangezien het ook algemeen aanvaard dat een toename ....

Results

Figuur 1. Schematische weergave van het experimentele protocol voor sperma monstervoorbereiding door de opzwem-methode. De belangrijkste stappen voor het scheiden van beweeglijk sperma of de aanpassing van de concentratie geïllustreerd. De laatste incubatie stap wordt alleen uitgevoerd wanneer capacitation vereist.

.......

Discussion

Intracellulaire signalering is essentieel voor de meeste cellulaire activiteiten, Ca ^{2 +} is een alomtegenwoordige boodschapper die zoogdiercellen begeleidt gedurende hun gehele levensduur, van het begin bij de bevruchting, tot het einde van hun levenscyclus. In reactie op verschillende stimuli, [Ca ^{2 +]} i toeneemt, oscilleert en neemt spatio-temporele codering, worden bijgevolg diverse processen geactiveerd, gemoduleerd of beëindigd door Ca ^{2 +-gecodeerde} berichten. Intracellulaire Ca

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ham's F-10	Sigma-Aldrich	N-6013
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A-7906
Calcium Chloride Dihydrate approx. 99%	Sigma-Aldrich	C-3881
Makler Counting Chamber	SEFI Medical Insruments LTD	SEF-MAKL
Fluo-3 AM	Invitrogen	F-1242	20 vials/50 μg each
Ionomycin	Alomone	I-700
Progesterone	Sigma-Aldrich	P0130
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S-9888	Reagents for human sperm medium (HSM)
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P-3911	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium bicarbonate	JT Baker	3506	Reagents for human sperm medium (HSM)
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M-2670	Reagents for human sperm medium (HSM)
Calcium chloride anhydrous	Sigma-Aldrich	C-1016	Reagents for human sperm medium (HSM)
HEPES	Sigma-Aldrich	H-3125	Reagents for human sperm medium (HSM)
D-Glucose	JT Baker	1906-01	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium pyruvate	Sigma-Aldrich	P-2256	Reagents for human sperm medium (HSM)
Sodium L-lactate (aprox. 99%)	Sigma-Aldrich	L- 7022	Reagents for human sperm medium (HSM)
Propidium Iodide	Invitrogen	L-7011	Component B
Triton X-100 (t-Octylphenoxypolyethoxyethanol)	Sigma- Aldrich	X-100	2.4 mM solution in water
Round coverslip	VWR	48380 080	25 mm diameter
Poly-L-lysine solution	Sigma-Aldrich	P8920
Manganese chloride	Sigma-Aldrich	M-3634
Attofluor; Cell Chamber, for microscopy	Life technologies	A-7816
Dimethyl Sulphoxide	Sigma-Aldrich	D2650	5x5 ml