In dit artikel presenteren we een methode om tumor bloedvaten analyseren in vivo met behulp van dynamische contrast-verbeterde fluorescentie videomicroscopie. Twee kwantitatieve parameters werden overgenomen: functionele capillaire dichtheid als gevolg van de doorbloeding van de tumor, en de index lekkage als gevolg van de lekkage van de endotheliale wand.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vivo beeldvorming van tumorale angiogenese met behulp van fluorescentie confocale videomicroscopie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fibered confocale fluorescentie in vivo beeldvorming met een optische vezelbundel gebruikt hetzelfde principe als fluorescerende confocale microscopie. Het kan fluorescente wekken in situ elementen via optische vezels en noteer aantal geëmitteerde fotonen, via dezelfde optische vezels. De lichtbron is een laser die de spannende licht stuurt door middel van een element binnen de vezel bundel en als het scant over het monster, herschept een afbeelding pixel voor pixel. Aangezien deze scan is zeer snel, door het te combineren met speciale software voor beeldverwerking, kunnen de beelden in real-time met een frequentie van 12 beelden / sec worden verkregen.
We ontwikkelden een techniek om kwantitatief karakteriseren capillaire morfologie en functie, met behulp van een confocale fluorescentie videomicroscopie apparaat. De eerste stap in ons experiment was 5 seconden films op te nemen in de vier kwadranten van de tumor om het capillaire netwerk visualiseren. Alle films werden verwerkt met behulp van software (ImageCell, Mauna Kea Technology, Parijs Frankrijk) dat een geautomatiseerde segmentatie van schepen rond een gekozen diameter (10 micrometer in ons geval) uitvoert. Zo kunnen we de functionele capillaire dichtheid ", die de verhouding tussen het totale schip stippellijn de totale oppervlakte van het beeld kwantificeren. Deze parameter is een surrogaat marker voor microvasculaire dichtheid, meestal gemeten met behulp van pathologie gereedschap.
De tweede stap was om films van de tumor opnemen over 20 min om lekkage van de macromoleculaire contrastmiddel te kwantificeren door de capillaire wand in het interstitium. Door het meten van de verhouding van de signaalintensiteit in het interstitium boven in de vaten, een "index lekkage werd verkregen, als een surrogaat marker voor capillaire permeabiliteit.
Inleiding
Angiogenese is een complex proces 1 dat de vorming van nieuwe bloedvaten uit reeds bestaande schepen gaat. Pathologische veranderingen in weefsel microcirculatie, samengesteld arteriolen, capillairen, venulen en zijn betrokken bij een groot aantal ziekten zoals kanker, ontsteking, of diabetes. Het is daarom essentieel om methoden om microvessel structuur en functie kwantitatief beoordelen. Imaging maakt de studie van microvaatjes in een niet-of micro-invasieve wijze in real-time en in vivo, en herhaalde metingen in de tijd in hetzelfde dier 2.
Momenteel wordt de dynamische contrast-versterkte (DCE) beeldvorming 3 vaak gebruikt om weefsel microcirculatie te beoordelen. Dynamisch contrast-versterkte beeldvorming is een techniek die volgt na verloop van tijd de biologische verdeling van een tracer intraveneus geïnjecteerd. Van deze overname, kan kwantitatieve parameters worden gehaald als gevolg van weefsel vascularisatie. DCE beeldvormingis meestal gebruikt met CT, MRI en echografie. Echter, deze technieken geen direct bekijken van de microvaatjes, aangezien hun resolutie, anders dan bij het gebruik van specifieke experimentele apparatuur blijft meestal macroscopische.
In dit artikel stellen we voor om de tumorvaatstelsel studeren aan de microscopische schaal en in vivo met behulp van dynamische contrast-versterkte optische beeldvorming, met fibered confocale videomicroscopie. We gebruikten een macromoleculaire contrastmiddel (FITC-dextran) die uitsluitend in vaten of lekkage blijft door de endotheliale barrière in het interstitium, volgens het molecuulgewicht en de eigenschappen van het endotheel van het onderzochte weefsel 4. Hierdoor kon de studie van beide microvessel structuur, door de juiste afbakening van schepen, en capillaire permeabiliteit, door lekken en zich ophopen in het interstitium.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Voorbereiding van het contrastmiddel
- Voor FITC-dextran 70 kDa, de geïnjecteerde dosis is 500 mg / kg (10 mg FITC-dextran verdund in 0,1 ml zoutoplossing muis gewicht van 20 g).
- De agent moet niet te lang worden blootgesteld aan licht. Om bleken te voorkomen, is het raadzaam om de buis met aluminiumfolie bedekken.
2. Anesthesie
- Muizen werden verdoofd met een intraperitoneale injectie van een mengsel van 01:04 van xylazine (Rompun 2%, Bayer, Puteaux, Frankrijk) en ketamine (500 ketamine, Virbac, Carros, Frankrijk), respectievelijk 66 mg / kg en 264 mg / kg voor 20 g muis.
3. Voorbereiding van het Orgaan van Interest
- We geschoren de muizen ter plaatse van belang (bijvoorbeeld via een subcutane tumor). Dierlijk haar is vaak auto-tl bij wit. Wanneer zwart, absorbeert licht.
- De huid tegenover het orgel af te beelden werd ingesneden. Het is belangrijk om te wachten totdat het bloeddeg is gestopt vóór het injecteren van het contrastmiddel, anders zal lekken in het bloed en vervuilen het beeld.
4. Acquisitie
- Het contrastmiddel werd geïnjecteerd, zowel via de halsader of de staartveine. Er is weinig of geen achtergrondsignaal in het orgaan waargenomen in de afwezigheid van een fluorescerend contrastmiddel.
- De sonde werd geplaatst voor het orgaan af te beelden. In onze studie was de tumor.
- De laser werd ingeschakeld om de tumor te verlichten en zie de fluorescentie in de haarvaten.
- De tumor werd handmatig onderzocht door het bewegen van de sonde in een zeer langzame beweging tijdens de opname aan het capillaire netwerk te visualiseren. Het is belangrijk om een vaste hand houden en deze techniek vereist weinig ervaring. In onze studie, de eerste stap mag kwantificering van functionele capillaire dichtheid.
- De tweede stap was de dynamische acquisitie in de tijd. Voor dit onderzoek gebruiken we een 70 kDa FITC-dextran. Er is geen interstitiële lekkage in de meeste normale organen, maar er is in tumoren. Om beelden van dezelfde locatie in de tijd (zoals in ons geval) verkrijgen, is het belangrijk om een systeem om de sonde op het gebied van belang te handhaven. Dit werd gedaan met behulp van een handgemaakte ondersteuning van de sonde te houden en door een beetje ultrasone gel op de punt van de sonde. Voor de opname is tijd om de sonde in contact gebracht met de tumor te stabiliseren. Zodra de positie werd beveiligd, was er slechts een minimale beweging veroorzaakt door de muis ademhaling. De laser werd ingeschakeld om 3 beelden elke 30 seconden gedurende 20 minuten opnemen op de aanwezigheid van capillaire lekkage te detecteren. Het werd uitgeschakeld tussen elke opname om contrastmiddel bleken te verminderen.
- In ons experiment, werden muizen gedood aan het einde van de procedure voor histologische analyse van tumoren.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van de verzamelde gegevens, kunnen we kwantitatief analyseren verschillende parameters die de microcirculatie.
Wij in vivo de perifere vasculaire netwerk van een colontumor geïmplanteerd in BALB-c-muizen met een fibered confocale fluorescentie videomicroscopie systeem (Cellvizio, Maunakea Technology, Parijs, Frankrijk 2), na injectie van een macromoleculaire fluorescerende contrastmiddel fluoresceïne-isothiocyanaat-dextran ( FITC-dextran) met een molecuulgewich...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De studie van de tumor microcirculatie is essentieel in het begrijpen van de pathofysiologie van tumorgroei, de verspreiding en de respons op de therapie 1 geworden. Optische beeldvorming is een van de technieken die kunnen worden gebruikt om de capillairen observeren met een fluorescerend contrastmiddel en morfologische (functionele capillaire dichtheid) en functionele (index lekkage) kwantificeert.
De fluorescentie microscopie we in deze studie heeft zowel voordelen en beperking...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
We hebben niets te onthullen.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Insulin spuit Myjector 1ml 29G | Terumo Europe | BS-05M2913 | |
| Fluoresceïne isothiocyanate-dextran 70 kDa | Sigma-Aldrich | 01619HH | 100 mg/mL verdund in zoutoplossing |
| Gevezelde confocale videomicroscopie | Cellvizio - MaunaKea Technologies | ||
| Kalibratie- en reinigingsset voor LEICAFCM1000 | Leica Microsystems | LSU-488 | Bewaar bij 4 °C |
| Probe ProFlexTM Z | MaunaKea Technologies | ||
| Mozaïeksoftware | MaunaKea Technologies | ||
| Vaatdetectiesoftware | MaunaKea Technologies |
Referenties
- Folkman, J. Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr Mol Med. 3 (7), 643-651 (2003).
- Laemmel, E., Genet, M., Le Goualher, G., Perchant, A., Le Gargasson, J. F., Vicaut, E. Fibered confocal fluorescence microscopy (Cell-viZio) facilitates extended imaging in the field of microcirculation. A comparison with intravital microscopy. J Vasc Res. 41 (5), 400-411 (2004).
- Charnley, N., Donaldson, S., Price, P. Imaging angiogenesis. Methods Mol Biol. 467, 25-51 (2009).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Taillieu, F., Cuenod, C., Siauve, N., Clement, O. Dynamic contrast enhanced optical imaging of capillary leakage. Technol Cancer Res Treat. 10 (1), 49-57 (2011).
- Kurose, I., Kubes, P., Wolf, R., Anderson, D. C., Paulson, J., Miyasaka, M., Granger, D. N. Inhibition of nitric oxide production. Mechanisms of vascular albumin leakage. Circ Res. 73 (1), 164-171 (1993).
- Faye, N. F. L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular capillary leakage is involved in the onset of anaphylactic hypotension. Anesthesiology. , (2012).
- Faye, N., Fournier, L., Balvay, D., Thiam, R., Orliaguet, G., Clement, O., Dewachter, P. Macromolecular Capillary Leakage Is Involved in the Onset of Anaphylactic Hypotension. Anesthesiology. 117 (5), 1072-1079 (2012).
- Tozer, G. M., Kanthou, C., Baguley, B. C. Disrupting tumour blood vessels. Nat Rev Cancer. 5 (6), 423-435 (2005).
- Ntziachristos, V., Schellenberger, E. A., Ripoll, J., Yessayan, D., Graves, E., Bogdanov, A., Josephson, L., Weissleder, R. Visualization of antitumor treatment by means of fluorescence molecular tomography with an annexin V-Cy5.5 conjugate. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (33), 12294-12299 (2004).
- Cuccia, D. J., Bevilacqua, F., Durkin, A. J., Merritt, S., Tromberg, B. J., Gulsen, G., Yu, H., Wang, J., Nalcioglu, O. In vivo quantification of optical contrast agent dynamics in rat tumors by use of diffuse optical spectroscopy with magnetic resonance imaging coregistration. Appl Opt. 42 (16), 2940-2950 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
