Photothrombosis is een snelle, minimaal-invasieve techniek voor het induceren van kleine en goed afgebakende infarct in gebieden die van belang zijn in zeer reproduceerbare wijze. Het is bijzonder geschikt voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire respons onderliggende hersenplasticiteit in transgene muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fototrombotisch Ischemie: Een minimaal invasieve en Reproduceerbaar Fotochemisch corticale laesie Model voor Mouse Stroke Studies
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De fototrombotisch takt model beoogt een ischemische schade binnen een bepaalde corticale gebied door middel van foto-activatie van een eerder ingespoten lichtgevoelige kleurstof induceren. Na belichting wordt de kleurstof geactiveerd en produceert singlet zuurstof schade onderdelen van endotheliale celmembranen, gevolgd bloedplaatjesaggregatie en trombi formatie, die uiteindelijk bepaalt de onderbreking van lokale doorbloeding. Deze aanpak, die aanvankelijk door Rosenblum en El-Sabban voorgesteld in 1977, werd later verbeterd door Watson in 1985 in de hersenen van de rat en stel de basis van het huidige model. Ook de toegenomen beschikbaarheid van transgene muis lijnen verder bijgedragen aan de rente op de photothrombosis model te verhogen. In het kort wordt een fotogevoelige kleurstof (Rose Bengal) intraperitoneaal geïnjecteerd en in de bloedsomloop. Wanneer verlicht door een koude lichtbron, de kleurstof wordt geactiveerd en induceert endotheliale schade met bloedplaatjes activering en trombose, wat resulteert in lokaledoorbloeding onderbreking. De lichtbron kan worden toegepast op de intacte schedel zonder de noodzaak van craniotomie, waardoor targeting van een corticaal gebied van belang in een reproduceerbare en niet-invasieve manier. De muis wordt vervolgens gehecht en toegestaan om wakker te worden. De evaluatie van ischemische schade kan opgezet worden door trifenyl-tetrazoliumchloride of cresyl violet kleuring. Deze techniek levert infarct van kleine en goed afgebakende grenzen, hetgeen zeer voordelig voor nauwkeurige cel karakterisering en functionele studies. Verder is het bijzonder geschikt voor het bestuderen van cellulaire en moleculaire respons onderliggende hersenplasticiteit in transgene muizen.
Inleiding
Aan het begin van de 21e eeuw, ischemische beroerte is een verwoestende aandoening die de tweede oorzaak van langdurige invaliditeit 1 en de tweede oorzaak van sterfte wereldwijd, waarbij beroerte goed voor ongeveer 5,7 miljoen doden in 2004 2 vertegenwoordigt. Ondanks de vele inspanningen die in zijn gebracht, is er nog steeds geen effectieve behandeling beschikbaar functioneel herstel na een beroerte te verbeteren. Diermodellen van beroerte veel gebruikt op het gebied van slagonderzoek als zij toestaan modellering van de pathofysiologie van ischemische schade en testen van de effectiviteit van verschillende neuroprotectieve strategieën in vivo. De meeste van deze modellen gericht op uitgebreide infarcten veroorzaken door het onderbreken (tijdelijk of permanent) van de bloedstroom in de arteria cerebri media, terwijl andere modellen werden ontwikkeld om letsels van kleine omvang studeren in specifieke gebieden, meestal de motor en somatosensorische cortex. Echter kunnen verscheidene factoren bijdragen aan ac genererenepaalde mate van variabiliteit in de experimentele beroerte studies, waaronder de muis gebruikte stam, de leeftijd en het geslacht van de dieren in de studie en vooral de techniek aangenomen om de ischemische schade veroorzaken. Wat dit laatste punt, de duur en de invasiviteit van de operatie (de noodzaak van een craniotomie) en de chirurgische vaardigheid vereist om de exploitant betrouwbaar induceren een ischemische laesie zijn bepalend voor een succesvolle en onpartijdige in vivo studie stroke .
Het concept van photothrombosis werd aanvankelijk door Rosenblum en El-Sabban voorgesteld in 1977 3 en werd bekend door zijn toepassing in hersenen van de rat door Watson et al. in 1985 4, waarin de techniek werd grotendeels verbeterd en stel de basis van het huidige model 3. - 6. De fototrombotisch aanpak heeft tot doel een corticaal infarct veroorzaken via de foto-activatie van een lichtgevoelige kleurstof eerder geleverde in bloed-systeem, which leidt tot plaatselijke vat trombose in de gebieden die zijn blootgesteld aan het licht. Wanneer de circulerende kleurstof verlicht de geschikte golflengte door een koude lichtbron, komt er energie zuurstofmoleculen, die op zijn beurt genereert een grote hoeveelheid zeer reactieve singlet zuurstof producten. Deze zuurstofradicalen induceren endotheelcellen membraan peroxidatie, waardoor bloedplaatjes adhesie en aggregatie, en uiteindelijk de vorming van trombi die lokale cerebrale te onderbreken 7 bepalen.
Photothrombosis is een niet-canonieke ischemische model dat niet afsluiten of breken op een slagader zoals meestal gebeurt in humane beroerte, maar induceert laesies in meer oppervlakkige vaten, waardoor selectieve onderbreking van de bloedstroom in het gebied blootgesteld aan licht. Daarom kan deze benadering geschikt voor cellulaire en moleculaire studies van corticale plasticiteit. Het belangrijkste voordeel van deze techniek ligt in haar eenvoud van uitvoering.Bovendien kan photothrombosis gemakkelijk worden uitgevoerd in ongeveer veertig minuten per dier, met inbegrip van twintig minuten wachten (3 min voor anesthesie; 1 min op de hoofdhuid scheren; 3 tot 5 minuten om het dier te leggen op de stereotaxische apparaat, 2 min naar het schrobben hoofdhuid met antiseptische oplossing, maken een incisie en reinig de schedel; 2 tot 4 min naar het koude licht vezel te plaatsen; 1 min naar het Bengaals oplossing te injecteren; 5 min-wachten voor intraperitoneale diffusie, 15 min van verlichting, en 5 min naar Reinig de wond en hechtdraad het dier). Voorts werd geen enkele chirurgische kennis om deze techniek presteren als de laesie wordt veroorzaakt door eenvoudige verlichting van de intacte schedel. In tegenstelling tot de klassieke arteriële occlusie, deze methode bepaalt selectieve afsluitingen van pial en intraparenchymateuze microvessels binnen het bestraalde gebied en vermindert de variabiliteit onder laesies als er geen onderpand schip wordt overgelaten aan zuurstof in het doelgebied.
Ondanks zijn bijzondere aard, defototrombotisch schade aandelen essentiële mechanismen die zich in de hersenen een beroerte. Net arteria in menselijke beroerte, bloedplaatjesaggregatie en thrombusvorming bepalen onderbreking van de bloedstroom in het bestraalde gebied 7. Ook dit model deelt ook essentieel ontstekingsreacties zoals in midden cerebrale slagader occlusie 8. Vanwege de goed afgebakende grenzen, de bijschaduw zone, die overeenkomt met een gebied van gedeeltelijk behouden metabolisme, zeer beperkte of onbestaande na fototrombotisch laesie. Deze duidelijke grens kan de studie van cellulaire reacties binnen ischemische of intacte corticale gebied te vergemakkelijken. Photothrombosis muismodel is bijzonder geschikt voor slag studies in verschillende transgene dieren. Inderdaad klassieke modellen kunnen niet geschikt om alle spanningen en een lange periode onderzoeken in C57BL / 6 muizenstam meldde een hoge mortaliteit verhouding die vooringenomenheid 9 kan veroorzaken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Pre-operatie
- Weeg Rose Bengal in een 1,5 ml buis en opgelost in steriele zoutoplossing tot aan een uiteindelijke concentratie van 15 mg / ml. Filter steriliseer door een 0,2 urn filter en opslaan in het donker bij kamertemperatuur tot twee maanden.
- Steriliseren alle chirurgische instrumenten in de autoclaaf. De chirurgische gebied moet minder dan een uur worden opgeschoond alvorens de operatie.
- Noteer het lichaamsgewicht van de muis om de dosis van Rose Bengal in te spuiten passen. We geïnjecteerd 10 ul / g dier gewicht in vrouwelijke CD1 muizen 12 weken oud in het huidige protocol. De hoeveelheid van Rose Bengal nodig het gewenste corticale laesie grootte kan gemakkelijk worden bepaald in een afzonderlijke reeks voorlopige experimenten door het testen van verschillende doseringen (gewoonlijk 2 gl / g, 5 gl / g of 10 ul / g lichaamsgewicht). Merk op dat de hoeveelheid van Rose Bengal in te spuiten is sterk afhankelijk van de experimentele omstandigheden, met name het type lichtbrongebruikt en de duur van blootstelling aan licht. In de onderhavige studie, 10 pl / g (150 ug / g) dosis bleek noodzakelijk photothrombosis induceren bij blootstelling aan licht gedurende 15 min, terwijl andere groepen gemeld dat hetzij 50 ug / g 6,8 en 100 ug / g 10 intraperitoneale injectie was voldoende voor het induceren van een fototrombotisch laesie.
2. Anesthesie Procedure
- Verdoven muizen met isofluraan in een transparante inductie kamer (3.5-4% voor inductie, 1,5-2% voor handhaving) in 50% (v / v) oxygen/50% (v / v) distikstofmonoxide gasmengsel. Gasvormige anesthesie maakt een snelle wake-up van de dieren en de mate van verdoving gas kan eenvoudig worden aangepast. Als alternatief kunnen muizen ook verdoofd door een ketamine-xylazine mengsel.
- Bij diepe anesthesie wordt bereikt, verwijdert het verdoofde dier uit de inductie kamer, plaats het in het stereotaxisch frame en onderhouden van anesthesie met behulp van een gezichtsmasker. Pas de isoflurane dosis om een voldoende anesthesie niveau te bereiken. Bewaken de ademhalingsfrequentie tijdens de gehele procedure en zorg ervoor dat het constant (40 - 60 ademhalingen per minuut).
- Gebruik teen knijpt om ervoor te zorgen het dier is diep verdoofd.
- Toepassen oogzalf, om de ogen niet uitdrogen.
- Steek de rectale sonde om de temperatuur tijdens de gehele chirurgische procedures. Stel de bijbehorende feedback-gestuurde verwarming pad voor het behoud van de muis lichaamstemperatuur op 37 ± 0,5 ° C.
3. Chirurgie voor verlichting van het doelgebied
- Scheer de muis hoofdhuid met een elektrisch scheerapparaat.
- Stevig vast het hoofd en steek het oor bars in de externe gehoorgang. Wees voorzichtig niet te beschadigen trommelvliezen.
- Ontsmet de huid op het oppervlak met afwisselend jat van 70% ethanol en betadine behulp van wattenstaafjes.
- Gebruik een scalpel een incisie te maken langs de middellijn van het oog leVel naar de nek. Solliciteer huid retractors de schedel bloot te houden.
- De periostium zachtjes trekken aan de randen van de schedel met een scalpel en laat de schedel oppervlak droog met steriele wattenstaafjes. Identificeer de bregma en lambda. Plaats een glas micropipet op de bregma als referentiepunt, dan verplaatsen naar de coördinaten van uw regio van belang. Het interessegebied gekozen voor dit artikel is ongeveer ronduit gevormd, bij benadering 2 mm lateraal van de bregma en met een oppervlakte van ongeveer 30 mm2, die een groot deel van de sensorimotorische cortex omvat volgens muizenhersenen atlas door Franklin en Paxinos 11.
- Markeer de positie van de rente met referentiepunten en zet een optische vezel in nauw contact met de schedel oppervlak om lichtverstrooiing te voorkomen, maar let niet om druk uit te oefenen op het. Het verlichte oppervlak kan worden beperkt door het toepassen van op de schedel van een masker met een kleine opening of een kapje aan het uiteinde van de optische vezel guide.
4. Bengaals Injection en Activering
- Laad de Bengaals oplossing in een 1 ml spuit en berekenen het bedrag dat wordt geïnjecteerd volgens een dosis van 10 ul / g lichaamsgewicht.
- Overgaan tot een langzame intraperitoneale injectie.
- Laat de kleurstof diffuus en in de bloedsomloop. Na 5 minuten, schakelt het koude licht verlichting. Vermijd verlichting van het dier door een andere bron van licht. We gebruikten glasvezel hulplicht van 150 W intensiteit.
- Na 15 min van verlichting, stop blootstelling aan licht en hechten van de wond. Vijf minuten van de verlichting al produceren infarct en 10 min waarschijnlijk voldoende om een maximaal effect te verkrijgen 12. Om variabiliteit te minimaliseren, we kiezen voor de verlichting gedurende 15 minuten.
5. Hechtdraad
- Verwijder de huid verwijdert en de toepassing steriele zoutoplossing om uitdroging te voorkomen.
- Close-up van de wond met behulp van omgekeerde snijden needle en zijde of nylon hechtdraad.
- Interrupt anesthesietoediening, verwijder voorzichtig de muis uit de stereotaxische apparaat en zet het op een voorverwarmde verwarming pad totdat het volledig wakker, dan terug naar zijn kooi. De lichaamstemperatuur zorgvuldig gehele procedures worden gevolgd om de variabiliteit in de infarct extensie beperken. Afhankelijk van de concentratie en de wijze van toediening, Rose Bengal nog worden gedetecteerd in het bloed gedurende enkele uren na injectie 13. Liever de verwarming deken om de aarde lamp om potentiële secundaire schade (Bengaals absorptiegolflengte is in het groene spectrum) te vermijden.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol is een corticale laesie die is al zichtbaar na dissectie van de cortex met het blote oog (Figuren 1A-1C) produceren. De fototrombotisch laesie ontwikkelt zich in oppervlakkige en diepe corticale lagen waarbij het weefsel voldoende doorzichtig om foto-activatie van de Bengaals toestaan. Meting van de omvang van herseninfarct kan snel worden uitgevoerd door histologische kleuring met trifenyl-tetrazoliumchloride (TTC) in vers weefsel of cresylviolet na fixatie in 4% paraformaldehyde (PFA). Vo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wijzigingen en vervangingen
Vanwege de absorptie piek bij 562 nm, werd een groen licht laser uit een gefilterde xenon booglamp oorspronkelijk gekozen om de lichtgevoelige Bengaals bestralen. Hoewel laser-gemedieerde excitatie werd nog gebruikt recently5, kan het worden vervangen door koud licht lamp die er ook voor zorgen kleurstof excitatie 10,15. Koud licht optische vezels zijn gemakkelijker te manipuleren en minder duur dan laserbronnen. Er moet opgemerkt worden dat lasers algemee...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten verklaard.
Dankbetuigingen
Wij danken Annalisa Buffo voor inzichtelijke suggesties en opmerkingen, en Maurizio Grassano, Marina Boido en Ermira Pajaj voor de schietpartij. Dit werk werd gefinancierd door KP7-MC-214003-2 (Marie Curie Initial Training Network AXREGEN) en de Compagnia di San Paolo, gliarep project.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Oplossingen en chemicaliën | |||
| Rose Bengal | Sigma, Italië | 330000 | |
| Isoflurane Vet | Merial | 103120022 | |
| Betadine | Asta Medica | ||
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Chirurgisch materiaal en apparatuur | |||
| Fluosorber Filter | Havard apparaat | 340415 | |
| 150W fiber optic illuminator | Photonic | PL3000 | |
| Temperatuurregelaar voor Plate TCAT-2DF | Havard apparaat | 727561 | |
| Stereotactisch Instrument | Stoelting | 51950 | |
| Operatiemicroscoop | Takagi | OM8 | |
| Verwarmingskussen | |||
| Zuurstof en stikstofgas | |||
| Chirurgische gereedschappen | World precision instrument | Optische vezel aansluitingen en masker zijn op maat gemaakt |
Referenties
- Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
- Mathers, C. D., Boerma, T., Ma Fat, D. Global and regional causes of death. Br. Med. Bull. 92, 7-32 (2009).
- Rosenblum, W. I., El-Sabban, F. Platelet aggregation in the cerebral microcirculation: effect of aspirin and other agents. Circ. Res. 40, 320-328 (1977).
- Watson, B. D., Dietrich, W. D., Busto, R., Wachtel, M. S., Ginsberg, M. D. Induction of reproducible brain infarction by photochemically initiated thrombosis. Ann. Neurol. 17, 497-504 (1985).
- Bergeron, M. Inducing photochemical cortical lesions in rat brain. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 9, Unit 9 16(2003).
- Lee, J. K., et al. Photochemically induced cerebral ischemia in a mouse model. Surg. Neurol. 67, 620-625 (2007).
- Dietrich, W. D., Watson, B. D., Busto, R., Ginsberg, M. D., Bethea, J. R. Photochemically induced cerebral infarction. I. Early microvascular alterations. Acta Neuropathol. 72, 315-325 (1987).
- Schroeter, M., Jander, S., Stoll, G. Non-invasive induction of focal cerebral ischemia in mice by photothrombosis of cortical microvessels: characterization of inflammatory responses. J. Neurosci. Methods. 117, 43-49 (2002).
- Kitagawa, K., et al. Cerebral ischemia after bilateral carotid artery occlusion and intraluminal suture occlusion in mice: evaluation of the patency of the posterior communicating artery. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18, 570-579 (1998).
- Sigler, A., Goroshkov, A., Murphy, T. H. Hardware and methodology for targeting single brain arterioles for photothrombotic stroke on an upright microscope. J. Neurosci. Methods. 170, 35-44 (2008).
- Franklin, K. B. J. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 1st, Academic Press. New York. (1997).
- Piao, M. S., Lee, J. K., Jang, J. W., Kim, S. H., Kim, H. S. A mouse model of photochemically induced spinal cord injury. J. Korean Neurosurg. Soc. 46, 479-483 (2009).
- Silva, V. M., Corson, N., Elder, A., Oberdorster, G. The rat ear vein model for investigating in vivo thrombogenicity of ultrafine particles (UFP). Toxicol. Sci. 85, 983-989 (2005).
- Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D., Ginsberg, M. D., Green, B. A. Photochemically induced spinal cord injury in the rat. Brain Res. 367, 296-300 (1986).
- Van Reempts, J., Van Deuren, B., Van de Ven, M., Cornelissen, F., Borgers, M. Flunarizine reduces cerebral infarct size after photochemically induced thrombosis in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 18, 1113-1119 (1987).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
- Kleinschnitz, C., et al. Blocking of platelets or intrinsic coagulation pathway-driven thrombosis does not prevent cerebral infarctions induced by photothrombosis. Stroke. 39, 1262-1268 (2008).
- Porritt, M. J., et al. Photothrombosis-induced infarction of the mouse cerebral cortex is not affected by the Nrf2-activator sulforaphane. PLoS One. 7, e41090(2012).
- Baskin, Y. K., Dietrich, W. D., Green, E. J. Two effective behavioral tasks for evaluating sensorimotor dysfunction following traumatic brain injury in mice. J. Neurosci Methods. 129, 87-93 (2003).
- Markgraf, C. G., et al. Comparative histopathologic consequences of photothrombotic occlusion of the distal middle cerebral artery in Sprague-Dawley and Wistar rats. Stroke. 24, 286-292 (1993).
- Wester, P., Watson, B. D., Prado, R., Dietrich, W. D. A photothrombotic 'ring' model of rat stroke-in-evolution displaying putative penumbral inversion. Stroke. 26, 444-450 (1995).
- Hu, X., Wester, P., Brannstrom, T., Watson, B. D., Gu, W. Progressive and reproducible focal cortical ischemia with or without late spontaneous reperfusion generated by a ring-shaped, laser-driven photothrombotic lesion in rats. Brain Res. Brain Res. Protoc. 7, 76-85 (2001).
- Maxwell, K. A., Dyck, R. H. Induction of reproducible focal ischemic lesions in neonatal mice by photothrombosis. Dev. Neurosci. 27, 121-126 (2005).
- Kuroiwa, T., et al. Development of a rat model of photothrombotic ischemia and infarction within the caudoputamen. Stroke. 40, 248-253 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
