Versnelde Type 1 diabetes inductie in muizen door adoptieve overdracht van diabetogenische CD4 + T cellen

Samenvatting

Wij een reproduceerbare werkwijze voor type 1 diabetes (T1D) bij de muis binnen twee weken adoptieve overdracht van eilandjescellen antigeen-specifieke primaire CD4 + T-cellen.

Samenvatting

De nonobese diabetische (NOD) muis ontwikkelt spontaan auto-immune diabetes na 12 weken oud en is de meest uitgebreid bestudeerde diermodel voor menselijke type 1 diabetes (T1D). Celoverdracht studies in bestraalde ontvanger muizen hebben aangetoond dat T-cellen zijn cruciaal bij T1D pathogenese in dit model. We beschrijven hier een eenvoudige methode om snel induceren T1D door adoptieve overdracht van gezuiverde primaire CD4 + T-cellen van pre-diabetische NOD muizen transgeen voor het eilandje T cel receptor (TCR) BDC2.5 in NOD.scid ontvangende muizen. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat isolatie en adoptieve overdracht van diabetogene T-cellen kan worden voltooid binnen dezelfde dag, wordt bestraling van de ontvangers niet vereist, en een hoge incidentie van type 1 wordt opgewekt binnen 2 weken na de T-cel-overdracht. Aldus kan studies pathogenese en therapeutische interventies bij T1D plaatsvinden bij een hogere snelheid dan bij werkwijzen die berusten op heterogene T cel populaties of klonenafgeleid van diabetische NOD muizen.

Inleiding

De NOD muis ontwikkelt auto-immune diabetes spontaan en is op grote schaal gebruikt als diermodel voor menselijke T1D ^1,2. Pathogenese van type 1 in NOD muizen gekenmerkt door infiltratie, beginnend op 3-4 weken oud, van de pancreatische eilandjes van Langerhans door dendritische cellen en macrofagen, gevolgd door T-en B-cellen. Deze fase van niet-destructieve peri-insulitis leidt tot een langzame, progressieve vernietiging van insuline-producerende pancreatische β cellen, resulterend manifeste diabetes wordt 4-6 maanden ^3. Overdracht van splenocyten ^{4,5, 6,7} of CD4 + CD8 + T-cellen van ^8,9 diabetische NOD muizen is aangetoond dat diabetes bemiddelen in immuungecompromitteerde NOD muizen, wat aangeeft dat eilandje-reactieve T-cellen spelen een centrale rol in T1D pathogenese. Afhankelijk van de experimentele omstandigheden, diabetes ontwikkeld in ontvangende muizen langzaam gedurende een aantal weken in deze studies. Ook verschillende T cel klonen, verkregen door tijdrovende en durekweken van diabetogene T-cellen, is gemeld diabetes mediëren enkele weken na overdracht ontvangende muizen ^7,10. Met de beschikbaarheid van transgene muizen die TCR afgeleid van CD4-of CD8-diabetogenic beperkte T-celklonen, verschillende laboratoria hebben aangetoond dat vervolgens milt T-cellen van dergelijke muizen konden diabetes dragen aan ontvangers ^11-13. Specifiek, BDC2.5 NOD muizen transgeen voor BDC2.5 TCR, die specifiek is voor chromogranine A, een eiwit in pancreatische bètacellen ^14-16. Overdracht van in vitro-geactiveerde of niet-geactiveerde geheel of gefractioneerde miltcellen van openlijk diabetes of prediabetes BDC2.5 muizen overgebracht diabetes te neonatale of immunodeficiënte NOD muizen op verschillende efficiëntie ^11,17-19.

We beschrijven een eenvoudige methode die gezuiverd transgene CD4 + T-cellen maakt gebruik van pre-diabetische BDC2.5 muizen te induceren T1D in de ontvangende muizen op een hoog rendement en consistentie. Grote aantallen naïeve eilandje antigeen-specifieke CD4 + T-cellen geïsoleerd uit deze muizen door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) voor CD4 + CD62L + T cellen die het transgene TCR Vβ4 keten. Gezuiverd transgene T-cellen worden vervolgens overgedragen zonder activering in NOD.scid muizen, die functioneel T en B cellen missen en zijn insulitis-en diabetes-vrij ^20. De ontvangende muizen worden gecontroleerd op verhoogde concentraties van urine glucose aangegeven T1D die snel ontwikkelt zich binnen twee weken na T celoverdracht.

In tegenstelling tot andere methoden overdragen diabetogenic T-cellen met heterogene specificiteiten ons protocol gebruikt FACS-gesorteerd CD4 + T-cellen die bijna uitsluitend de expressie diabetogenic BDC2.5 TCR. Door hun homogeniteit, slechts kleine aantallen overgedragen T-cellen (~ 1x10 ⁶ cellen / muis) nodig voor een snelle ontwikkeling T1D binnen 2 weken 100% incidentie. Een ander voordeel van ons protocol is dat DOORSTRALI GSIn van ontvangende muizen is niet nodig omdat voor een aantal andere methoden. Een mogelijke beperking van deze methode is dat het niet het onderzoek naar de bijdrage van zowel CD4 en CD8 T-cel subsets of specifieke CD8 T-cellen in diabetes mogelijk.

De beschreven protocol handig voor het bestuderen T1D snelle ontwikkeling, gemedieerd door naïeve, mono-specifiek CD4 + T-cellen, alsook therapeutische strategieën voor interventie in homing van eilandjescellen antigeenspecifieke Th cellen het doelwitorgaan worden.

Protocol

1. Isolatie van T-cellen uit milt en lymfeklieren van BDC2.5 Muizen

1. Gebruik 6-weken oude pre-diabetische vrouwelijke BDC2.5 muizen als donoren van diabetogene CD4 + T-cellen. Muizen dienen diabetes-vrij bepaald door urine glucose meting (zie hieronder).
2. Euthanaseren elke muis met behulp van CO ₂ stikken en verwijder de milt, oksel en brachialis lymfeklieren onder steriele omstandigheden. Om de milt te verwijderen, genieten van de vacht met 70% ethanol, vervolgens gesneden en de huid trekken. De milt is zichtbaar als een donkerrode orgaan aan de linkerzijde van de muis zijn. Voeg een 1-inch incisie in het peritoneum met de kleine schaar en zachtjes greep de milt in het centrum met een paar kleine pincet. Knip voorzichtig het bindweefsel en vastzittend vet zo veel mogelijk en verwijder de milt.
3. Verzamel de milt en lymfeklieren in 10 ml Dulbecco's-gemodificeerd Eagle's Medium (DMEM) in een 15 ml conische buis op ijs.
4. Bereid een enkele celsuspensie met behulp van the einde van een steriele 10 ml spuit zuiger om voorzichtig op de lymfoïde organen bij 70 micrometer cel zeven (een milt per zeef en 4-6 lymfeklieren per zeef) in dezelfde 50 ml conische buis.

Tijdens het spoelen elke zeef met 1 ml DMEM maals voor terugwinning van cellen van de zeef te maximaliseren.

5. Breng de verzamelde cellen van de 50 ml conische buis in een 15 ml conische buis en centrifugeer bij 300-400 xg gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur.
6. Om rode bloedcellen te lyseren, gooi het supernatant, resuspendeer de cellen in 5 ml ammonium-chloride-Kalium (ACK) buffer (pH 7,2), en incubeer de ACK-celsuspensie bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
7. Voeg 10 ml DMEM aan de ACK-celsuspensie en centrifugeer de buis als hierboven. Was eenmaal de cel pellet in 10 ml DMEM.

2. Fluorescentie-geactiveerde celsortering van diabetogenische CD4 + T-cellen uit muizen BDC2.5

1. Resuspendeer cellen in 5 ml FACS sbevattende buffer en tel het aantal levensvatbare cellen (met een fasecontrastmicroscoop en een hemocytometer) door trypan blauwe kleurstof uitsluiting.
2. Middels FACS buffer, passen de celsuspensie volume tot 5 x 10 ⁷ cellen / ml. Verwijder ~ 1 x 10 ⁶ cellen per kleuring controle (1 geen vlek, 3 enkele vlekken). Stain het monster voor niet-transgene geactiveerde CD4 + T-cellen met anti-CD4 (APC), anti-TCR Vβ4 (FITC) en anti-CD62L (PE) monoklonale antilichamen (mAb) in een 15 ml buis. Voer cel kleuring met het mAb concentraties voorgesteld door de fabrikant voor 20-30 min bij 4 ° C in het donker.
3. Was het monster en enkele vlek controles met FACS buffer bij> 3x de kleuringsreactie volume. Centrifugeer de buis bij 300-400 xg, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in FACS buffer (1-2 x 10 ⁷ cellen / ml voor het sorteren monster en 300 pl voor enkele vlek controles) en op te slaan op ijs tot de volgende stap.
4. Passeren de cel monster door een 35 um celzeefdop tube naar cel klonten te verwijderen. Sorteer de monsters voor CD4 + TCR Vβ4 + CD62L + cellen op een cel sorter met een getrainde operator. Verzamel de gesorteerde cellen in 3 ml DMEM in een 15 ml buis. Toestaan ​​2,5-3 uur, inclusief voorbereiden, 1,5 x 10 ⁸ cellen (het aantal cellen verkregen van ongeveer 3 donormuizen) sorteren op een soort van 2 x 10 ⁴ totaal events / sec. Verwacht ~ 2,5 x 10 ⁶ non-transgene geactiveerde CD4 + T-cellen per muis na celsortering.
5. Noteer het absolute aantal gesorteerde cellen aan het eind van het soort en centrifugeer ze gedurende 7 minuten bij 300-400 x g. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen (2 x 10 ⁶ cellen / ml) in steriele fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) (Mg ^{2 +} / ^{Ca2 +} vrij) voor adoptieve T celoverdracht.

3. Adoptieve overdracht van diabetogene CD4 + T-cellen uit BDC2.5 Muizen

1. Met behulp van een 1 ml spuit en een 18-1 ½ gauge naald, voorzichtig resuspendeer de FACS-gezuiverde CD4 +T-cellen en laadt de 1 ml spuit. Ter voorbereiding voor injectie, vervang dan de 18-1 ½ gauge naald met een 27 ½ gauge naald.
2. Expose 6-8 weken oude vrouwelijke NOD.scid ontvangende muizen een warmtelamp totdat ze vertonen poetsgedrag.
3. Beperken ontvangende muizen in weerhouder en veeg de staart met 70% (v / v) ethanol op de injectieplaats te desinfecteren.
4. Injecteer 1-2 x 10 ⁶ FACS gesorteerde cellen / muis (in maximaal 500 ul PBS) in een van de laterale staart aderen.

Forceer de zuiger. Als de naald op de juiste wijze in de ader, zal de injectie plaatsvinden met bijna geen weerstand.

4. Monitoring Ontvanger muizen voor Hyperglykemie en T1D

1. Beginnend vijf dagen na T celoverdracht worden NOD.scid ontvangende muizen dagelijks bekeken op verhoogde urine glucose met reagens strips (Bayer Diastix) volgens de instructies van de fabrikant. Muizen met twee opeenvolgende urine glucosewaarden> 250 mg / dl worden beschouwd diabetes.

Resultaten

Onze resultaten tonen aan de isolatie van transgene BDC2.5 cellen die CD62L, wat essentieel is voor T-cellen naar huis om secundaire lymfoïde organen, zoals lymfklieren. Onze bevindingen tonen verder de krachtige mogelijkheden van deze monospecifieke T-cel populatie snel overbrengen en efficiënt T1D tot NOD.scid ontvangende muizen.

Isolatie van diabetogenic CD4 + T-cellen uit muizen BDC2.5 wordt getoond in figuur 2. Ongeveer 5 x 10 ⁷ cellen uit gepoold milt en lym...

Discussie

T1D kan worden geïnduceerd in ontvangende muizen met verschillende efficiëntie van adoptieve overdracht van gehele miltcellen of T-cel subsets van diabetische NOD muizen of muizen die transgeen zijn voor TCR afgeleid van diabetogenic T-celklonen. Wij rapporteren hier een reproduceerbare werkwijze voor het induceren T1D in ontvangende muizen binnen twee weken bij 100% incidentie van overdracht FACS-gezuiverde CD62L + BDC2.5 transgene CD4 + T cellen in NOD.scid-muizen.

Specifieke voordelen van...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BDC 2.5 TCR transgenic NOD mice (NOD.Cg-Tg(TcrαBDC 2.5, TcrβBDC 2.5)	JAX	004460
NOD.SCID mice (NOD.CB17-Prkdcscid/J)	JAX	001303
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Themo Scientific	SH30022.01
Bayer Diastix	Fisher Scientific	AM2803
15 ml conische buizen	Falcon	352095
50 ml conische buizen	Falcon	352070
Steriele chirurgische pincetten
Steriele kleine schaar
Steriele grote schaar
70 μm celstrainers	Fisher Scientific	22363548
35 μm celstrainer kapbuizen	BD Biosciences	352235
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) buffer			0.15 M NH4Cl, 1 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2 in dH2O
BD FACSFlowTM omhulsel vloeistof	BD Biosciences	342003
FACS kleuring buffer			PBS, 0.2 mM EDTA, 0.5% BSA/FCS, filter gesteriliseerd
Phasecontrastmicroscoop
Trypan blauw
Hemocytometers
Anti-CD4 (APC) mAb	Biolegend	1005616	clone RM4-5
Anti-TCR Vβ4 (FITC) mAb	BD Biosciences	553365	clone KT4
Anti-CD62L (PE) mAb	BD Biosciences	553151	clone MEL-14
Celsorteerder	BD Biosciences		bijv. BD FACSAria III
Warmtelamp
Muis vasthoudapparaat
1 ml spuiten	Becton Dickinson	309602
18-1½ gauge naalden (sterieel)	Becton Dickinson	305196
27½ gauge naalden (sterieel)	Becton Dickinson	305109