Bepaling van Microbiële extracellulaire enzymactiviteit in Waters, bodem en sedimenten behulp High Throughput Microplaat Testen

Samenvatting

Microplaat procedures beschreven voor de colorimetrische of fluorometrische analyse van extracellulaire enzymactiviteit. Deze procedures zorgen voor de snelle bepaling van een dergelijke activiteit in grote aantallen milieu-monsters er binnen afzienbare tijd frame.

Samenvatting

Een groot deel van de cycli van nutriënten en koolstof verwerking in natuurlijke omgevingen gebeurt door de activiteit van extracellulaire enzymen vrij door micro-organismen. Zo kan het meten van de activiteit van deze extracellulaire enzymen inzicht te geven in de tarieven van de ecosysteem-niveau processen, zoals afbraak van organisch materiaal en stikstof en fosfor mineralisatie. Testen van extracellulaire enzymactiviteit in milieu monsters gewoonlijk uit het blootstellen van de monsters naar kunstmatige colorimetrische of fluorometrische substraten en het bijhouden van de snelheid van substraathydrolyse. Hier beschrijven we microplaat-methoden, voor deze procedures die de analyse van grote aantallen monsters binnen een kort tijdsbestek mogelijk te maken. Monsters worden reageren met kunstmatige substraten in 96 putjes microplaten of diepe microplaat blokken en enzymactiviteit wordt vervolgens bepaald door absorptie of fluorescentie van het verkregen eindproduct met een typische microplaat lezer of fluorometer. Dergelijke hoge throughput procedures niet alleen vergelijkingen tussen ruimtelijk verschillende plaatsen of ecosystemen vergemakkelijken, maar ook de kosten van dergelijke tests aanzienlijk beperken door algemene reagensvolumes nodig per monster.

Inleiding

Micro-organismen zoals bacteriën en schimmels verkrijgen voedingsstoffen en koolstof uit complexe organische verbindingen door de productie van extracellulaire enzymen. Deze enzymen hydrolyseren typisch polymeren in kleinere subeenheden die in de cel kan worden genomen. Daarom op een ecologisch vlak, deze microbiële extracellulaire enzymen verantwoordelijk voor veel van de voedingsstoffen mineralisatie en afbraak organische materie die voorkomt in de natuur. Enzymen zoals cellobiohydrolase (CBH) en β-glucosidase zijn belangrijk voor degradatie van cellulose en werken samen om de hydrolyse van cellulose tot glucose ^1,2, die bruikbaar koolstofsubstraat voor opname en microbiële assimilatie zorgt katalyseren. Het enzym fosfatase releases oplosbare anorganische fosfaatgroepen van organofosfaten, wezen mineralisatie van fosfaat en beschikbaar te maken voor gebruik door de meeste organismen ^3. Andere enzymen, zoals N-acetylglucosaminidase (NAGase) zijn important in chitine degradatie en kan zowel koolstof en stikstof beschikbaar voor microbiële overname ⁴ maken.

Een van de procedures voor de bepaling van microbiële extracellulaire enzymactiviteit in de natuur is het gebruik van kunstmatige p-nitrofenyl (p NP) verbonden substraten, een benadering die oorspronkelijk werd ontwikkeld bodem fosfataseactiviteit ⁵ detecteren. Deze benadering berust op de detectie van een gekleurd eindproduct, p-nitrofenol, dat vrijkomt wanneer de kunstmatig substraat wordt gehydrolyseerd door het geschikte enzym. De p-nitrofenol kan vervolgens colorimetrisch gekwantificeerd door het meten van de absorptie bij ongeveer 400-410 nm. Deze methode is vervolgens toegepast op andere enzymen zoals NAGase ⁶ detecteren, en is gebruikt in verschillende onderzoeken naar microbiële extracellulaire enzymactiviteit in bodems en sedimenten ^7-9.

Een alternatieve benadering die originall wasy ontwikkeld om extracellulaire glucosidasewerkzaamheid beoordelen in het aquatisch milieu ^10,11 maakt gebruik van 4-methylumbelliferon (MUB) gekoppeld substraten. Het eindproduct uitgebracht (4-methylumbelliferon) is sterk fluorescerende en kan worden gedetecteerd met behulp van een fluorometer met een excitatie / emissie instelling rond 360/460 nm. Diverse MUB-gekoppelde kunstmatige substraten zijn, waardoor de fluorometrische meting van de activiteit van ten minste evenveel enzymen (bijv. β-glucosidase, cellobiohydrolase, NAGase, fosfatase) zoals kan worden bepaald met de p NP-substraat colorimetrische werkwijze. Andere microbiële extracellulaire enzymen, zoals eiwit-afbrekende leucine aminopeptidase kan fluorometrisch worden getest met 7-amino-4-methylcumarine (COU) verbonden substraten. Zowel MUB-en COU-gekoppelde substraten zijn gebruikt om enzymactiviteit te bepalen in verschillende terrestrische en aquatische monsters ^12,13.

Hoewel eerdere studies hebben descrIBED fluorometrische of colorimetrische microplaat benaderingen van extracellulaire enzymactiviteit ¹⁴ te bepalen, er is behoefte aan een duidelijke presentatie van hoe dergelijke tests uit te voeren. Hier laten we procedures voor de high throughput microplaat voor de analyse van extracellulaire enzymactiviteit in bodems en sedimenten met de colorimetrische p-NP verbonden substraten benadering en in natuurlijk water via de fluorescente MUB verbonden substraten techniek. Wij richten ons op de meting van de activiteiten van β-glucosidase, NAGase en fosfatase als deze enzymen respectievelijk kunnen worden gekoppeld aan koolstof, stikstof en fosfor fietsen. Echter, de hier beschreven procedures voor bepaling van andere extracellulaire enzymen met verschillende artificiële substraten.

Protocol

Colorimetrische analyse van extracellulaire enzymactiviteit in bodems en sedimenten

1. Voorbereiding van de ondergrond en Buffer oplossingen voor Colorimetric Analyses enzymactiviteit

1. Bereid 50 mM acetaatbuffer (pH 5,0-5,5) door mengen van 50 ml 0,1 M azijnzuur (2,87 ml ijsazijn op in 500 ml water), 150 ml 0,1 M natriumacetaat en 200 ml gedestilleerd _H2O Breng de pH op 5,0-5,5 met 0,1 M azijnzuur indien nodig.
2. Bereid een oplossing van 1 M natriumhydroxide (NaOH) in gedestilleerd _H2O
3. Bereid p-NP verbonden substraatoplossingen in 50 mM acetaatbuffer. Voor het analyseren fosfatase bereiden 5 mM p NP-fosfaat in 50 mM acetaatbuffer, om assay β-glucosidase bereiden 5 mM p NP-β-glucopyranoside, om assay NAGase bereiden 2 mM pNP-β-N-acetylglucosaminide. Bereid alle substraatoplossingen in steriele 15 ml of 50 ml centrifugebuizen. Oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende 2-3 weken.

2. Bepaling van een standaard te converteren Absorbance p NP Concentratie

1. Bereid standaardoplossingen van p-nitrofenol in 50 mM acetaatbuffer. Concentraties te variëren ,025-1 mM.
2. Overdracht drie replicaten van 100 pi van elke concentratie namelijk 96-well microplaat. Voeg 10 gl 1 M NaOH en 190 gl gedestilleerd _H2O aan elk putje.
3. Record absorptie bij 410 nm met behulp van een microplaat lezer.
4. Vermenigvuldig concentraties in de standaard curve van 0,3 tot umol p NP per 300 ul reactie volume krijgen. Maak een bocht van de absorptie tegen de umol p NP. De helling van de kromme dient als omzettingsfactor (C) die absorptie hebben betrekking op pmol p NP elke enzymreactie.

3. Het uitvoeren van de Enzyme Assay

1. Voor bodem, stelt een suspensie van elk monster worden bepaald in een steriele 15 ml centrifugebuis op concentratie van ongeveer 1 g / ml ^-1 met 50 mM acetaatbuffer. Voor sedimenten, voeg genoeg acetaat buffer aan de suspensie gemakkelijk pipettable maken. Het juiste volume suspensie nodig zullen variëren afhankelijk van het aantal enzymen getest, maar ten minste 5 ml aanbevolen. Vortex elk slurry totdat alle groepjes van bodem of sediment hebben verspreid en noteer het uiteindelijke volume.
2. Opnieuw vortex elk suspensie onmiddellijk pipet 150 pi in elk van zes putjes op 96-well deepwell blok (figuur 1). Het is belangrijk vortex grondig en regelmatig om vuildeeltjes in suspensie te houden. Laat minstens twee putjes per blok leeg te dienen als een substraat controle. Opmerking: clip eind pipetuiteinden met een schaar voorafgaand aan pipetteren als bodem slurries neiging om tips verstoppen. Bereid een 96-wells blok voor elk enzym te worden getest.
3. Verdeel ongeveer 5 ml acetaatbuffer een pipet reservoir en gebruik een 8-kanaals pipet 150 ul van de buffer aan de last twee putjes van elk monster (deze zullen monsterbuffer controles) en de twee substraat controleputjes (figuur 1)
4. Giet ongeveer 10 ml van de geschikte p NP-substraatoplossing in een pipet reservoir en gebruik een 8-kanaals pipet 150 pi van de substraatoplossing aan de eerste vier putjes van elk monster en de twee substraat controleputjes (figuur 1). Noteer de tijd de reactie begint zodra de substraatoplossing toegevoegd.
5. Incubeer de platen bij kamertemperatuur (22 ° C) gedurende 0,5-4 uur. Exact incubatietijd is afhankelijk activiteit in monsters en het enzym worden bepaald. Voor de meeste bodems en sedimenten, fosfatase en β-glucosidase vereisen incubatie tijden van 0,5-1,5 uur, terwijl NAGase en andere enzymen vereisen incubatie tijd van> 2 uur.
6. Terwijl assays zijn incubatie bereiden duidelijke 96-putjes te absorptie lezen. Bereid een microplaat voor elke deepwell blok (dwz voor iedere enzyme getest). Pipet 10 ul 1 M NaOH en 190 pi gedestilleerd water in elk putje van de microtiterplaat. Opmerking: NaOH vertraagt ​​de enzymatische reactie en verhoogt de pH die de kleur van de p NP vrijkomt tijdens de reactie verhoogt.
7. Na incubatie gecentrifugeerd 96 putjes blocks 2,000-5,000 g gedurende 5 min aan bodemdeeltjes pellet.
8. Gebruik een multichannel pipet 100 pi trekken uit elk putje, let daarbij goed op de korrel te vermijden, en overbrengen naar de bijbehorende goed op voorbereid duidelijke 96-putsmicroplaat.
9. Zet de microplaatlezer en het opzetten van de nodige software. Record absorptie bij 410 nm. Indien de absorptie van een bepaalde put boven de lineaire detectiegrens van de plaatlezer, die goed verdund 1:01 met water en opnieuw meten. Als absorptie nog te hoog is, moet de test worden herhaald met een kortere incubatietijd.

4. Bepaling van de droge massa van de monsters

1. Pipetteer 1 ml van elk sampl e slurrie in een vooraf gewogen aluminium pan.
2. Droog in een 75 ° C droogoven voor 48 uur en weeg. Trek het gewicht van de pan van deze waarde naar het drooggewicht van grond of sediment te vinden in 1 ml van de suspensie. Vermenigvuldigen met een factor 0,15 tot het drooggewicht van het monster te bepalen in de 150 pi aan elk putje toegevoegd in de enzymbepaling.

5. Berekening van de enzymactiviteit per drooggewicht van grond of sediment

1. Bereken eindextinctie van elk monster door het aftrekken van de steekproef controle absorptie van het monster test absorptie. Als substraat controles hebben hoge absorptie (ongeveer> 0.060) aftrekken dan zijn die ook.
2. Bereken enzymactiviteit in mmol hr ^-1 g droge massa ^-1 uit de vergelijking:

Enzymactiviteit = Final absorptie / (C x incubatietijd x monster drogestofgehalte)

Fluorescerende Analyse van extracellulaire enzymactiviteit in natuurlijke wateren

TLE "> 1. Voorbereiding van de ondergrond, Standard, en Buffer oplossingen voor Fluorometrische Analyses enzymactiviteit

1. Bereid 200 uM oplossingen MUB-gekoppelde substraten (bijv. 4-MUB-β-glucopyranoside, 4-MUB-fosfaat, 4-MUB-N-acetyl-β-D-glucosaminide) door oplossen van het substraat in geschikte steriele (geautoclaveerd) gedestilleerd H ₂ O in steriele 15 ml of 50 ml centrifuge buizen. Wikkel buizen in aluminiumfolie om het licht uit te sluiten en op te slaan in de koelkast voor gebruik. Ondergronden moet stabiel zijn gedurende tenminste 1 week indien opgeslagen op deze manier.
2. Bereid een MUB standaard door een voorraadoplossing van 100 uM 4-methylumbelliferon in steriel gedestilleerd _H2O In de koelkast bewaren in oranje of folie verpakte fles. Onmiddellijk vóór gebruik verdunnen 100 uM voorraadoplossing van 1/10 in steriel _H2O een werkoplossing van 10 pM voor enzym assays maken.
3. Bereid een voorraad oplossing van 100 mM bicarbonaat buffer door het oplossen van 8,4 g NaHCO _{3 in 1 LH 2 O en autoclaaf. Verdun deze stamoplossing 1/20 in steriele H 2 O als nodig is om een werkende oplossing van 5 mm voor enzymanalyses maken.}

2. Het organiseren van watermonsters op een 96-Well Black Microplaat

1. Dient een microplaat voor elk enzym overeenkomstig de in figuur 2 voorbeeld. Merk op dat het toestaan ​​voor een adequate replicatie, normen en controles, deze procedure kan de activiteit van een enkel enzym assay voor maximaal negen watermonsters op een 96-wells zwarte microtiterplaat.
2. Verdeel ongeveer 5 ml van het eerste monster in een reservoir pipet en gebruik een 8-kanaals pipet om pl pipette200 in alle putjes in kolom 1 van de microplaat (s). Gooi gebruikte pipet tips en herhalen als nodig is voor elk watermonster kolommen 1-9 te vullen.

3. Het opzetten van Sample, Standaard, Quench en Ondergrond Controls

1. Opgezet controles om rekening te houden met monsters, standaards, substraat en afschrikken dezelfde zwarte microplaat de monsters (Figuur 2).
2. Steekproef controles bevatten monster water en bicarbonaat buffer, en worden niet gebruikt in de activiteit berekeningen maar zal aantonen lezen van coherentie in de loop van het experiment. De demping controles bestaan ​​van het monster water en een standaard bedrag van de tl-tag en worden gebruikt om de diffractie van de fluorescentie in de steekproef van het water te meten. Substraat en standaard controles zijn samengesteld uit of-substraat verbonden of de standaard tl-tag, respectievelijk, en bicarbonaat buffer.
3. Verdeel ongeveer 5 ml 5 mM bicarbonaatbuffer in een schone pipet reservoir. Pipetteer 50 ul buffer aan putjes microplaat 1 tot 9 in rijen D en E vormen twee repliceren putjes van monster controles per monster. Verandering pipetuiteinden vervolgens overbrengen 200 ul van bicarbonaat putjes 10 tot en met 12 in Rijen A en H.
4. Verminder omgevingslicht door het dimmen of uitschakelen van lights als de tl-standaard is lichtgevoelig.
5. Verdeel ongeveer 5 ml 10 uM 4-methylumbelliferon in een schone pipet reservoir. Pipetteer 50 ul in microtiterplaat putjes 1 tot en met 12 in rij H, en in putten 1 tot en met 9 in Rijen G en F tot drie herhalingen van afschrik controles per monster en de algemene standaard controles vormen. Ofwel plaats de microplaat in het donker of bedekken met een ondoorzichtige deksel aan het licht degradatie van MUB verminderen.
6. Zet de fluorometer en de set-up van alle benodigde software klaar om te lezen voordat u de ondergrond te zijn. Opmerking: sommige fluormeter bollen kan een warm-up tijd van 3 min of meer nodig.
7. Verdeel ongeveer 5 ml van de geschikte MUB-gekoppelde substraat (bijv. 4-MUB-fosfaat) in een schone pipet reservoir. Gebruik een 12-kanaals pipet 50 ul pipet in microtiterplaat putjes 1 tot 12 in rij A en in putten 1 tot 9 in rijen B en C drie replica testen voor elk monster en drie controles substraat vormen. Immediately verder naar stap 4.1, opname fluorescentie.

4. Opnemen Fluorescentie

1. Lees de initiële fluorescentie onmiddellijk na substraat naast de microplaat. Na het lezen van fluorescentie, incubeer de microplaat bij kamertemperatuur (22 ° C), hetzij in het donker of bedekt met een opake deksel lichtdegradatie van MUB verminderen.
2. De incubatietijd nodig om de maximale potentiële enzymactiviteit in een watermonster maatregel zal afhangen van de enzymconcentratie in het monster. Aangezien dit niet bekend voordat de test is voltooid, wordt de microplaat moeten worden gelezen op verschillende tijdstippen stappen. Typisch lezen met intervallen van 10-15 min in de loop van 1 uur is aanvaardbaar voor vele enzymen, hoewel monsters met zeer hoge activiteit voor bepaalde enzymen piek bereikt voor 10 minuten.
3. Lees verder fluorescentie in de microplaat op de door u tussenpozen gedurende minstens 1 uur. Zorg ervoor dat houden de microplaat bedekt of in het donker tussen lezens.

5. Berekening van de enzymactiviteit per volume water

1. Voor elk monster op elk tijdsinterval berekenen: betekenen eerste steekproef fluorescentie (putten D en E), de gemiddelde uiteindelijke steekproef fluorescentie (putten AC), de gemiddelde standaard fluorescentie (putten H10-11), en de gemiddelde demping controle fluorescentie (wells FG).
2. Voor elk tijdsinterval berekenen enzymactiviteit in nmol h ^{-1 -1} ml van de vergelijking:

Enzymactiviteit = (gemiddelde monster fluorescentie - bedoel eerste steekproef fluorescentie) / ((gemiddelde standaard fluorescentie / 0,5 mol) x (gemiddelde controle fluorescentie doven / gemiddelde standaard fluorescentie) x (0,2 ml) x (tijd in hr))

3. Onderzoek de activiteit worden berekend voor ieder keer stap. Bepaal laatste potentiële activiteit vanaf het moment stap met de hoogste activiteit. Als activiteit waarden blijven stijgen dan later stappen tijd kan nodig zijn, als activiteit waarden vallen throughout het verloop van de run, ren dan weer met kortere tijd stappen. Final activiteit is in nmol substraat verbruikt hr ^-1 ml ^-1, maar kan worden opgeschaald om uit te drukken als umol hr ^-1 L ^-1.

Resultaten

Bodems en waterbodems hebben meestal aanzienlijke niveaus van extracellulaire enzymactiviteit als gevolg van de bijgevoegde microbiële gemeenschappen (biofilms) groeien op het oppervlak van deeltjes. Figuur 3 toont hoe deze activiteit is afhankelijk van de grootte van de deeltjes verkregen bij het ​​oppervlak sediment van een derde orderstroom in het noorden van Mississippi, USA. Een eerdere studie heeft aangetoond dat de bacteriële gemeenschappen sedimentpartikels van deze stroom kan worden gescheiden ...

Discussie

Het bepalen van de activiteit van een verscheidenheid van extracellulaire microbiële enzymen in bodems en sedimenten kunnen bruikbare inzichten tarieven voedingsstoffen mineralisatie en organisch materiaal verwerking ¹⁷ verschaffen. Echter, kan de bodem variëren in hun vochtgehalte, dus is het belangrijk om te standaardiseren op drooggewicht. Dit vereist een extra droogstap (gewoonlijk twee dagen) dan alleen het meten van enzymactiviteit. Aldus, in tegenstelling tot assays enzymactiviteit in watermonsters die...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
REAGENTS EN MATERIALEN
Glaziale azijnzuur			Verschillende leveranciers
Natriumacetaat			Verschillende leveranciers
Natriumhydroxide			Verschillende leveranciers
p-Nitrofenol	Fisher	BP612-1	Alternatieven beschikbaar
p-Nitrofenyl (pNP)-fosfaat	Sigma	N3234	pNP-substraat
pNP-β-glucopyranoside	Sigma	N7006	pNP-substraat
pNP-β-N-acetylglucosami-nide	Sigma	N9376	pNP-substraat
Duidelijke 96-well microplates	Fisher	12-563-301	Alternatieven beschikbaar
96-well deep well-blokken	Costar	3958	Alternatieven beschikbaar
Aluminium weegschalen			Verschillende leveranciers
Steriele 15 ml centrifugeerbuisjes			Verschillende leveranciers
Steriele 50 ml centrifugeerbuisjes			Verschillende leveranciers
4-Methylumbelliferoon	Sigma	M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-fosfaat	Sigma	M8883	MUB-substraat
4-MUB-glucopyranoside	Sigma	M3633	MUB-substraat
4-MUB-N-acetylglucosami-nide	Sigma	M2133	MUB-substraat
Natriumbicarbonaat			Verschillende leveranciers
Zwarte 96-well microplate	Costar	3792
Pipetreservoir			Verschillende leveranciers
APPARATUUR
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge rotor	Eppendorf	A-4-81	Voor microplates/deep-well blokken
Microplate reader	BioTek	Synergy HT	Alternatieven beschikbaar
Microplate fluorometer	BioTek	FLx 800	Alternatieven beschikbaar
8-kanaals pipettor			Verschillende leveranciers