Bepaling van Microbiële extracellulaire enzymactiviteit in Waters, bodem en sedimenten behulp High Throughput Microplaat Testen

Samenvatting

Microplaat procedures beschreven voor de colorimetrische of fluorometrische analyse van extracellulaire enzymactiviteit. Deze procedures zorgen voor de snelle bepaling van een dergelijke activiteit in grote aantallen milieu-monsters er binnen afzienbare tijd frame.

Samenvatting

Een groot deel van de cycli van nutriënten en koolstof verwerking in natuurlijke omgevingen gebeurt door de activiteit van extracellulaire enzymen vrij door micro-organismen. Zo kan het meten van de activiteit van deze extracellulaire enzymen inzicht te geven in de tarieven van de ecosysteem-niveau processen, zoals afbraak van organisch materiaal en stikstof en fosfor mineralisatie. Testen van extracellulaire enzymactiviteit in milieu monsters gewoonlijk uit het blootstellen van de monsters naar kunstmatige colorimetrische of fluorometrische substraten en het bijhouden van de snelheid van substraathydrolyse. Hier beschrijven we microplaat-methoden, voor deze procedures die de analyse van grote aantallen monsters binnen een kort tijdsbestek mogelijk te maken. Monsters worden reageren met kunstmatige substraten in 96 putjes microplaten of diepe microplaat blokken en enzymactiviteit wordt vervolgens bepaald door absorptie of fluorescentie van het verkregen eindproduct met een typische microplaat lezer of fluorometer. Dergelijke hoge throughput procedures niet alleen vergelijkingen tussen ruimtelijk verschillende plaatsen of ecosystemen vergemakkelijken, maar ook de kosten van dergelijke tests aanzienlijk beperken door algemene reagensvolumes nodig per monster.

Inleiding

Micro-organismen zoals bacteriën en schimmels verkrijgen voedingsstoffen en koolstof uit complexe organische verbindingen door de productie van extracellulaire enzymen. Deze enzymen hydrolyseren typisch polymeren in kleinere subeenheden die in de cel kan worden genomen. Daarom op een ecologisch vlak, deze microbiële extracellulaire enzymen verantwoordelijk voor veel van de voedingsstoffen mineralisatie en afbraak organische materie die voorkomt in de natuur. Enzymen zoals cellobiohydrolase (CBH) en β-glucosidase zijn belangrijk voor degradatie van cellulose en werken samen om de hydrolyse van cellulose tot glucose ^1,2, die bruikbaar koolstofsubstraat voor ....

Protocol

Colorimetrische analyse van extracellulaire enzymactiviteit in bodems en sedimenten

1. Voorbereiding van de ondergrond en Buffer oplossingen voor Colorimetric Analyses enzymactiviteit

1. Bereid 50 mM acetaatbuffer (pH 5,0-5,5) door mengen van 50 ml 0,1 M azijnzuur (2,87 ml ijsazijn op in 500 ml water), 150 ml 0,1 M natriumacetaat en 200 ml gedestilleerd _H2O Breng de pH op 5,0-5,5 met 0,1 M azijnzuur indien nodig.
2. Bereid een oplossing van 1 M natriumhydroxide (NaOH) in gedestilleerd _H2O
3. Bereid p-NP verbonden substraatoplossingen in 50 mM acetaatbuffer. Voor het analyseren fosfatase be....

Resultaten

Bodems en waterbodems hebben meestal aanzienlijke niveaus van extracellulaire enzymactiviteit als gevolg van de bijgevoegde microbiële gemeenschappen (biofilms) groeien op het oppervlak van deeltjes. Figuur 3 toont hoe deze activiteit is afhankelijk van de grootte van de deeltjes verkregen bij het ​​oppervlak sediment van een derde orderstroom in het noorden van Mississippi, USA. Een eerdere studie heeft aangetoond dat de bacteriële gemeenschappen sedimentpartikels van deze stroom kan worden gescheiden .......

Discussie

Het bepalen van de activiteit van een verscheidenheid van extracellulaire microbiële enzymen in bodems en sedimenten kunnen bruikbare inzichten tarieven voedingsstoffen mineralisatie en organisch materiaal verwerking ¹⁷ verschaffen. Echter, kan de bodem variëren in hun vochtgehalte, dus is het belangrijk om te standaardiseren op drooggewicht. Dit vereist een extra droogstap (gewoonlijk twee dagen) dan alleen het meten van enzymactiviteit. Aldus, in tegenstelling tot assays enzymactiviteit in watermonsters die.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
REAGENTS EN MATERIALEN
Glaziale azijnzuur			Verschillende leveranciers
Natriumacetaat			Verschillende leveranciers
Natriumhydroxide			Verschillende leveranciers
p-Nitrofenol	Fisher	BP612-1	Alternatieven beschikbaar
p-Nitrofenyl (pNP)-fosfaat	Sigma	N3234	pNP-substraat
pNP-β-glucopyranoside	Sigma	N7006	pNP-substraat
pNP-β-N-acetylglucosami-nide	Sigma	N9376	pNP-substraat
Duidelijke 96-well microplates	Fisher	12-563-301	Alternatieven beschikbaar
96-well deep well-blokken	Costar	3958	Alternatieven beschikbaar
Aluminium weegschalen			Verschillende leveranciers
Steriele 15 ml centrifugeerbuisjes			Verschillende leveranciers
Steriele 50 ml centrifugeerbuisjes			Verschillende leveranciers
4-Methylumbelliferoon	Sigma	M1381
4-Methylumbelliferyl (MUB)-fosfaat	Sigma	M8883	MUB-substraat
4-MUB-glucopyranoside	Sigma	M3633	MUB-substraat
4-MUB-N-acetylglucosami-nide	Sigma	M2133	MUB-substraat
Natriumbicarbonaat			Verschillende leveranciers
Zwarte 96-well microplate	Costar	3792
Pipetreservoir			Verschillende leveranciers
APPARATUUR
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Centrifuge rotor	Eppendorf	A-4-81	Voor microplates/deep-well blokken
Microplate reader	BioTek	Synergy HT	Alternatieven beschikbaar
Microplate fluorometer	BioTek	FLx 800	Alternatieven beschikbaar
8-kanaals pipettor			Verschillende leveranciers