Een eenvoudige en efficiënte methode om de Nucleaire Factor Activering Detect in menselijke neutrofielen door flowcytometrie

Summary

Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in het bloed. Neutrofielen bezitten transcriptioneel gereguleerd functies zoals de productie van pro-inflammatoire cytokines en remming van apoptose. Deze functies kunnen worden bestudeerd met de methode die hier gepresenteerd, die detectie en kwantificering van nucleaire factoren maakt het mogelijk door middel van flowcytometrie in geïsoleerde kernen

Abstract

Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in perifeer bloed. Deze cellen zijn de eerste om te verschijnen op plaatsen van ontsteking en infectie, zo wordend de eerste lijn van verdediging tegen binnendringende micro-organismen. Neutrofielen over belangrijke antimicrobiële functies zoals fagocytose, afgifte van lytische enzymen en de productie van reactieve zuurstof species. Naast deze belangrijke afweerfuncties, neutrofielen andere taken in reactie op infectie, zoals de productie van pro-inflammatoire cytokines en remming van apoptose. Cytokines werven andere leukocyten waarmee de infectie, en remming van apoptose kan de neutrofielen langer leven op de plaats van infectie. Deze functies worden geregeld op het niveau van transcriptie. Omdat neutrofielen kortstondige cellen, kan de studie van transcriptioneel gereguleerd responsen in deze cellen niet worden uitgevoerd met conventionele methoden reportergen aangezien er geen effidoende technieken voor neutrofiel transfectie. Hier geven we een eenvoudige en efficiënte methode die detectie en kwantificering van nucleaire factoren in geïsoleerde en immunolabeled kernen door flowcytometrie mogelijk. We beschrijven technieken pure neutrofielen uit humaan perifeer bloed te isoleren, stimuleren deze cellen met anti-receptor antilichamen, isoleren en immunolabel kernen en analyseren kernen door flowcytometrie. De werkwijze is met succes gebruikt om NF-kB en Elk-1 nucleaire factoren detecteren kernen van neutrofielen en andere celtypes. Aldus is deze methode is een optie voor het analyseren activering van transcriptiefactoren in geïsoleerde kernen van verschillende celtypen.

Introduction

Neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in perifeer bloed ^1. Tijdens ontsteking en infectie neutrofielen de eerste cellen te verschijnen op de aangetaste plaats waar zij als eerste verdedigingslijn ^2. Neutrofielen bezitten verscheidene antimicrobiële mechanismen ³ met fagocytose, productie van zuurstofradicalen, afgifte van lytische enzymen door degranulatie en productie van pro-inflammatoire cytokines ^4,5. Neutrofielen zijn kortstondige cellen die snel krijgen geactiveerd door middel van signalering van verschillende receptoren op het celoppervlak. Hoewel neutrofielen werden beschouwd terminale cellen vanwege hun korte levensduur en omdat ze apoptose ondergaan tenzij geactiveerd tijdens het ontstekingsproces ⁶ is nu duidelijk dat zij ook hun fenotype wijzigen door het niveau van transcriptie van bepaalde genen. De productie van cytokines ⁵ en de remming van apoptose ^7,8 zijn twee iELANGRIJKE activatie-afhankelijke cel functies geregeld op het niveau van transcriptie in neutrofielen. Nucleaire factor kB (NF-kB) participeert in de transcriptionele controle van cytokineproductie ⁴ en in de regulatie van cel overleving en apoptose ^9-11 in verschillende celtypes.

De signaalwegen die leiden tot activatie nuclear factor meestal bestudeerd door reportergen assays of door elektroforetische mobiliteit shift assays (EMSA). Omdat neutrofielen kortstondige cellen, kan de studie van transcriptioneel gereguleerd responsen in deze cellen niet worden uitgevoerd met reportergen assays, omdat er geen efficiënte technieken voor neutrofiel transfectie. EMSA assays zijn gebruikt in neutrofielen nucleaire factor activatie ^12,13 ontdekken, maar deze methode is ingewikkeld en duur omdat het het gebruik van radioactief materiaal. Nucleofectie is een andere techniek die gebruikt successfully aan monocyten ¹⁴ transfecteren. Dus, althans in theorie zouden nucleaire factor activering gedetecteerd in neutrofielen door transfectie (ondanks laag rendement). Dit zou echter techniek duurder, tijdrovend en waarschijnlijk minder kwantitatieve. Microscopische analyse van immuun-cellen kunnen ook worden gebruikt om nucleaire factoren detecteren in de kern. Inderdaad hebben we ontdekt NF-kB translocatie naar de kern zo ^15. Helaas is deze techniek ook tijdrovend, minder kwantitatieve, en onder voorbehoud van vooringenomenheid van de waarnemer.

Hier geven we een eenvoudige en efficiënte methode die detectie en kwantificering van nucleaire factoren in geïsoleerde en immunolabeled kernen door flowcytometrie mogelijk. We beschrijven technieken voor neutrofielen uit humaan perifeer bloed te isoleren, stimuleren deze cellen via integrines of Fc-receptoren met anti-receptor antilichamen, isoleren en immunolabel kernen en analyseren kernen door flowcytometrie (Figure 1). De werkwijze is met succes gebruikt om NF-kB ¹⁵ en Elk-1 ¹⁶ nucleaire factoren in neutrofielen kernen detecteren. De gevoeligheid van deze methode kan de aanwezigheid van kleine wijzigingen in de nucleaire factor niveaus in de kern. Deze methode kan ook worden gebruikt om het niveau van transcriptiefactoren in kernen van andere celtypen analyseren.

Protocol

1. Isolatie van neutrofielen (PMN) uit humaan bloed

1. Gebruik ongeveer 20 ml menselijk bloed met heparine (10 U / ml) als antistollingsmiddel. Bloed werd verzameld van volwassen gezonde vrijwilligers door venopuncture. Alle experimenten werden uitgevoerd onder goedkeuring van de bio-ethiek Comite aan het Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM.
2. Doe 2 ml van 6% dextran T500 in PBS in een 15 ml conische centrifugebuis 10 ml bloed. Meng door de buis twee of drie keer en laat het gedurende 45 minuten om voor bezinking.
3. In een nieuwe 15 ml conische centrifugebuis gezet 5 ml Ficoll-Paque.
4. Neem de leukocyt-rijke plasma dat gevormd boven gesedimenteerd erytrocyten en voorzichtig pipetteren bovenop de Ficoll-Paque vormen van een tweede laag. Zorg ervoor dat er twee fasen.
5. Centrifugeer bij 516 xg gedurende 20 min bij 4 ° C. Na centrifugatie bij de interfase van plasma en Ficoll-Paque er een laag van mononucleaire cellen. Neutrophils zijn aan de onderkant van de buis.
6. Elimineer de supernatant, breken de celpellet door op de buis tegen een rek en resuspendeer de cellen door het toevoegen van 10 ml koud (4 ° C) PBS. Opmerking: Het mengen van de cellen en neer te pipetteren wordt niet aanbevolen omdat dit te schadelijk voor de cellen.
7. Breng de celsuspensie in een 50 ml conische centrifugebuis en centrifugeer bij 290 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
8. Breken de cel pellet voor en voeg 10 ml koude (4 ° C) hypotone oplossing (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4) tot erytrocyten te lyseren. Meng door werveling van de buis voorzichtig met de hand gedurende precies een minuut.
9. Voeg 10 ml koude (4 ° C) hypertone oplossing (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4), mix en tel de cellen met een hemocytometer (gewoonlijk> 95% zijn PMN).
   Opmerking: Bewaar de buis met de celsuspensie op ijs, terwijl het tellen van de cellen.
10. Centrifugeer als hiervoor Resuspendeer PMN bij 107 cellen / ml in koud (4 ° C) PBS. Blijf op ijs.
    Opmerking: Neutrofielen levensvatbaar blijven en functionele bij 4 ° C gedurende ongeveer 6 tot 8 uur.

2. Activeren van PMN

1. Doe 100 pl PMN suspensie (1 x 10 ⁷ cellen / ml) in een 1,5 ml Eppendorf buis.
   Opmerking: Voorbeeld van buizen moeten worden gedaan ten minste in duplo. Gebruikelijke negatieve controles behelzen een eerste antilichaam alleen, en secundaire antilichaam alleen.
2. Voeg de overeenkomstige anti-integrine of anti-Fc receptor monoklonaal antilichaam (mAb) bij 10 ug / ml en geïncubeerd op ijs gedurende 15 minuten.
3. PMN wassen door toevoeging van 1 ml koude (4 ° C) PBS, centrifugeren bij 1743 xg (4.500 rpm) in een microcentrifuge, en afzuigen van het supernatant.
4. Breken de celpellet door op de bodem van de buis tegen een rack, voeg 1 ml koude PBS en was twee keer in de vorige stap.
   Opmerking: Deze wast verwijder ongebonden antilichaam.
5. Resuspendeer PMN in dezelfde (initial) volume van warm (37 ° C) PBS die 60 ug / ml F (ab ') 2 geiten anti-muis IgG.
   Opmerking: De secundaire anti-muis IgG antilichaam zal binden aan de eerste anti-receptor antilichaam en verknoping van de receptor veroorzaken.
6. Incubeer bij 37 ° C gedurende 1 tot 20 min, afhankelijk van de nucleaire factor van belang. Voor NF-KB gewoonlijk 15 min, en Elk-1 meestal 5 min.
   Opmerking: de cellen te incuberen bij 37 ° C induceert receptor crosslinking, die niet plaatsvinden bij 4 ° C.
7. Voeg 1 ml koude PBS en centrifugeer 3 min bij 1743 xg in microcentrifuge.
8. Verwijder supernatant
9. Freeze PMN onmiddellijk in dry-ice/ethanol bad en er hen gedurende 10 minuten te houden.

3. Isolatie en fixatie van Kernen

1. Hersuspendeer pellet bevroren PMN in 100 pi koude (4 ° C) hypotonische buffer (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM _MgCl2 en 1 mM vers toegevoegde _{DL-dithiothreitol} [DTT]; PH = 7,9). Het wordt aanbevolen om de buizen te nemen uit het bad dry-ice/ethanol een voor een, en het reinigen van de bodem van de buis vegen voordat u de hypotonische buffer.
2. Plaats op ijs, en controleer of kernen integriteit door kleuring een hoeveelheid van de kernen suspensie met trypan blauw. Kernen kijken rond en blauw. Intact PMN niet vies, en celresten verschijnt als blauwe deeltjes met een onregelmatige vorm.
   Opmerking: Als kernen suspensie veel intacte cellen of vuil, is het beter om de voorbereiding verwijderen en de procedure met een ander monster herhalen.
3. Centrifugeer kernen op 775 xg (3.000 rpm) in microcentrifuge gedurende 10 min in een koude kamer. Op dit punt kernen zijn zeer kwetsbaar en extra zorg moeten worden genomen in het houden van de monsters koud en niet centrifugeren bij overmatige krachten.
4. Verwijder de bovenstaande vloeistof door heel voorzichtig pipetteren.
5. Voeg 100 ul koude 4% paraformaldehyde in PBS om kernen te lossen.
   Opmerking: De pellet is zeer los eend toevoegen van de buffer voldoende is om de kernen te resuspenderen. En neer te pipetteren moet worden vermeden.
6. Incubeer op ijs gedurende 20 minuten.
7. Immunolabel kernen voor flowcytometrie of houden gedurende 24 uur bij 4 ° C.

4. Kernen immunokleuring voor flowcytometrie-analyse

1. Centrifugeer bij 1743 xg kernen (4.500 rpm) in microcentrifuge gedurende 1 minuut en verwijder supernatant door zeer zacht pipetteren.
2. Voeg 100 pl koude (4 ° C) 0,1% Triton X-100, 4% paraformaldehyde in PBS om kernen permeabiliseren. Incubeer in ijs gedurende 10 minuten.
3. Centrifugeer gepermeabiliseerd kernen op 1.743 xg in microcentrifuge en verwijder voorzichtig het supernatant. Op dit punt kernen pellets niet goed hechten aan de bodem van de buis. Het wordt aanbevolen om opnieuw gecentrifugeerd indien de pellet losraken.
4. Resuspendeer kernen in 500 ul koude 4% foetaal bovine serum (FBS) in PBS om niet-specifieke bindingsplaatsen te blokkeren, en incubeer op ijs gedurende 20 minuten. Centrifugeerkernen op 1.743 xg gedurende 3 min in microcentrifuge en verwijder voorzichtig het supernatant.
5. Resuspendeer kernen in 100 ul koude PBS met 4% FBS en 2,5 ug / ml van mAb tegen de nucleaire factor van belang. Incubeer op ijs gedurende 20 minuten.
   Opmerking: De gebruikelijke negatieve controles dienen anti-nucleaire factor antilichaam alleen, en FITC-gelabeld secundair antilichaam alleen.
6. Was tweemaal met 500 pi koude PBS met 4% FBS en centrifugeren bij 1743 xg gedurende 3 minuten.
7. Verwijder het supernatant zorgvuldig, resuspendeer kernen in 100 ul koude PBS met 4% FBS en 10 ug / ml van de overeenkomstige FITC-gelabeld secundair antilichaam en incubeer op ijs gedurende 20 minuten.
8. Was tweemaal kernen met 500 pi koude PBS met 4% FBS als in de vorige stap.
9. Resuspendeer kernen in 400 ul koude 4% paraformaldehyde in PBS.
   Opmerking: Kernen worden in paraformaldehyde om de monster worden bewaard enkele dagen zonder besmettingproblemen die kunnen optreden in de aanwezigheid van serum.
10. Analyseren onmiddellijk door flowcytometrie of slaan in het donker bij 4 ° C gedurende drie dagen.

5. Flowcytometrie-analyse

1. Analyseren immunolabeled kernen in een flowcytometer dergelijke FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) of soortgelijke inrichting.
2. Pas overname instellingen: FSC op log-schaal 10-1, SSC bij log-schaal op 196, en poort kernen in een dot-plot.
3. Acquire tienduizend kernen per monster.
4. Analyseer fluorescentie van FITC-gekleurde kernen door middel van de FL-1-kanaal (506 nm) ingesteld op log-schaal op 400.

Results

De zuiveringswerkwijze beschreven meestal biedt gestimuleerde neutrofielen (PMN) met een zuiverheid van meer dan 95% (Figuur 1A). Geïsoleerde PMN kan dan worden gestimuleerd door verknoping bijzonder receptoren met specifieke monoklonale antilichamen. We hebben gestimuleerd PMN door Fc receptoren en integrinen (Figuur 1B). Zodra gestimuleerd worden PMN gelyseerd en kernen die met hoge opbrengsten. Kernen worden vervolgens immunolabeled voor een bepaalde nucleaire factor, zoals de nuclea...

Discussion

De zuiveringswerkwijze hier beschreven kan de isolatie van gestimuleerde neutrofielen (PMN) met zuiverheid van meer dan 95% (bepaald door microscopische waarneming), in een korte tijd. Soms neutrofielen kunnen worden verontreinigd door erytrocyten indien deze niet volledig gelyseerd. Dit heeft meestal geen invloed de techniek, aangezien erytrocyten en PMN kan gemakkelijk worden onderscheiden als afzonderlijke celpopulaties door flowcytometrie. Geïsoleerde PMN kan dan worden gestimuleerd door verknoping bijzonder recepto...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS
Heparin	PiSA (Mexico)
Dextran T500	Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark)	T1-Dextran T500
Ficoll-Paque	Pharmacia	17-0320-01
Sodium chloride	Sigma	S7653
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S9638
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S9390
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A2153	Cohn Fraction V
HEPES	Sigma	H3375
Potassium chloride	Sigma	P9541
Magnesium chloride anhydrous	Sigma	M8266
DL-dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9163
Trypan Blue (0.4 % solution)	Sigma	T8154
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Triton X-100	Sigma	X100
Fetal bovine serum (FBS)	GIBCO	10437-028
Monoclonal antibody IV.3	Medarex (Annandale, NJ)	025-1	Human-specific anti-FcRII (CD32)
Monoclonal antibody 3G8	Medarex (Annandale, NJ)	028-2	Human-specific anti-FcRIII (CD16)
Monoclonal antibody TS2/16	Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA)	Donated by Dr. Martin Hemler	Human-specific anti-β1 integrin (CD29)
Monoclonal antibody IB4	University of California, San Francisco	Donated by Dr. Eric J. Brown	Human-specific anti-β2 integrin (CD18)
F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55468
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG	Cappel (Aurora, OH)	55522
FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG	Cappel (Aurora, OH)	55665
Anti-NF-κB p50	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-114	Rabbit polyclonal antibody
Anti-NF-κB p65	Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)	sc-109	Rabbit polyclonal antibody
EQUIPMENT
15-ml centrifuge tube	Corning	430791
50-ml centrifuge tube	Corning	430291
Centrifuge, Sorvall Tabletop	Dupont Instruments	RT 6000D
pH-meter	Corning	340
Pipetman pipette P-20	Gilson	F123600
Pipetman pipette P-200	Gilson	F123601
Pipetman pipette P-1000	Gilson	F123602
Hemocytometer	Fisher Scientific	0267110
Microscope	Nikon	Eclipse E600
Inverted microscope	Nikon	TMS
Water Bath Incubator	Fisher Scientific	2IS-M
Microcentrifuge	Eppendorf	5414C
Microcentrifuge	Eppendorf	5418
Flow Cytometer	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ)	FACScalibur