Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

Samenvatting

Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.

Samenvatting

Om de gebeurtenissen een hartontwikkeling onderzoeken en de moleculaire mechanismen die leiden tot myocardiale ziektes bij mensen te bepalen, is het noodzakelijk eerst functionele humane hartspiercellen (CM) genereren. Het gebruik van deze cellen in drug discovery en toxicologische studies ook zeer gunstig, waardoor nieuwe farmacologische moleculen voor de behandeling van cardiale stoornissen preklinisch gevalideerd op cellen van menselijke oorsprong. Van de mogelijke bronnen van CM, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen behoren tot de meest veelbelovende, aangezien ze direct kunnen worden afgeleid uit gemakkelijk toegankelijk weefsel van de patiënt en bezit een intrinsieke vermogen om aanleiding te geven tot alle celtypes van het lichaam ^1. Er zijn verschillende methoden voorgesteld voor de differentiatie van iPS cellen in CM's, variërend van de klassieke embryoid instanties (EBS) aggregatie aanpak van chemisch gedefinieerde protocollen ^2,3. In dit artikel wordt een EBS-gebaseerd protocol stellen we en laten zien hoe deze methodiekd kan worden gebruikt om efficiënt genereren functionele CM-achtige cellen uit voedingsvrije iPS cellen.

Inleiding

Historisch gezien, heeft het onderzoek naar de genetische en moleculaire mechanismen achter de menselijke ontwikkeling en de ziekte is gebaseerd op het genereren van genetisch gemodificeerde diermodellen. Echter, een groot aantal menselijke fenotypes niet succesvol gerepliceerd in muizen, vooral als gevolg van de biologische verschillen tussen de twee soorten. Anderzijds, toegang tot menselijke weefsels kan worden beperkt en vaak geen voldoende materiaal te verkrijgen voor diepgaande experimentele studies. Het gebied van de cardiovasculaire biologie lijdt aan beide beperkingen: de fysiologie van het menselijk hart significant verschilt van die van de muis, en een aanzienlijke hoeveelheid van hartweefsel is alleen post mortem of tijdens hartchirurgie. Vinden van een optimale bron voor de differentiatie van functionele humane CM's heeft dan ook een centraal thema in de cardiovasculaire biologie geworden, en veel moeite is gedaan om dit probleem aan te pakken. Diverse soorten cellen zijn voorgesteld, including skeletmyoblasten, lokale hartstamcellen, beenmerg mononucleaire cellen endotheliale stamcellen en mesenchymale stamcellen. Echter, gegevens verkregen met behulp van deze cellen niet consistent ⁴ geweest.

De winning van menselijke embryonale stamcellen (ESC) eerste ⁵ en de baanbrekende ontdekking van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen door Yamanaka en Thomson ^6,7 leek later oplossingen: deze cellen hebben het vermogen om onbeperkt groeien en het potentieel te bieden stijgen alle mobiele derivaten van de drie kiemlagen, zoals de CMS. Het gebruik van iPS cellen heeft verdere voordelen: afgeleid is van autologe volwassen cellen, zij dragen het genoom van de persoon of patiënt waarvan ze zijn afgeleid. Ze laten dan ook de ontwikkeling van in vitro modellen die het onderzoek van menselijke genetische ziekten en mechanismen van de ontwikkeling te bevorderen. Op grond van dit karakteristieke, kan iPS cellen ook overcome problemen met betrekking tot afstoting en ethische kwesties ^8. Daarom, hoewel SER nog altijd de gouden standaard op het gebied biologie van stamcellen, onderzoekers wereldwijd nu verplaatsen naar iPS celtechnologie.

iPS cellen worden nu gebruikt om menselijke ziekten te modelleren in vitro voor verschillende aandoeningen, waaronder aangeboren cardiovasculaire aandoeningen ^9,10. Onlangs, heeft de toepassing van de iPS-cel ziekte modellering uitgevoerd voor monogene cardiale aandoeningen (dwz lange QT-syndroom, catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie) en pathologieën waarin hartafwijkingen zijn onderdeel van een complex fenotype (dwz Leopard en Timothy syndromen, gedilateerde cardiomyopathie). Deze rapporten bevestigden dat patiënt-specifieke iPS cellen die worden onderscheiden in CM's weer te geven soortgelijke fenotypische en functionele kenmerken als de ziekte in vivo.

Ernog vele uitdagingen voor de werkzaamheid van het induceren van de iPS cellen in het hart lijn verbeteren. Spontane generatie van CM's uit menselijke SER via aggregaatvorming genaamd embryoid instanties (EBS) hebben bewezen succesvol ^17. Sinds deze ontdekking, hebben vele werkwijzen voorgesteld. Veel groepen hebben sterk verbeterde de efficiëntie van de differentiatie protocol en zijn verhuisd naar chemisch gedefinieerde en dierlijk bijproduct-vrije cultuur reagentia (zie Mummery, C., et al.., Circulation Research (2012) voor een uitgebreid overzicht van alle bestaande methoden ³ ).

Toch is de klassieke methode op basis van EB aggregatie vertegenwoordigt nog steeds de meest gebruikte voor het uitvoeren van functionele studies en onderzoeken ziektemechanismen. De voorgestelde protocol is gebaseerd op de aggregatie van iPS cellen in EBS en cultuur in de aanwezigheid van serum en ascorbinezuur, dat is aangetoond dat het cardiaal differentiatieproces verbeteren en positively invloed hebben op de rijping van deze cellen ^18,19. In dit artikel gaan we door middel van deze methode in detail en zal laten zien hoe je feeder-vrije iPS cellijnen gebruiken voor het genereren van patiënt-specifieke iPS-afgeleide CM's.

Protocol

1. Feeder-free Onderhoud en passage van de Mens iPS Cell Lines

1. Bereid de Matrigel-gecoate gerechten. Dooi een flacon van menselijke ESC-gekwalificeerde Matrix op ijs gedurende een uur en verdun het in 25 ml DMEM-F12 medium. Voeg 1 ml voor elke 35 mm plaat (of equivalente hoeveelheden per oppervlakte als andere gerechten worden gebruikt), om alles op ijs en ervoor te zorgen dat alle platen en buizen zijn voorgekoeld. Afdekplaten met aluminiumfolie.

Opmerking: Matrigel voorraad concentraties verschillen per de partij. Verdunningsinstructies worden aangegeven op het informatieblad.

2. Houd platen op ijs 's nachts en te verwijderen uit het ijs de volgende dag. Platen kunnen in de koelkast worden bewaard tot een week vóór het gebruik.
3. Bereid de mTESR1 compleet medium (of ontdooien een flesje Nutristem medium) en H-ESM (human ESC medium) volgens de onderstaande tabel.

   H-ESM	Eindconc	FOR 500 ml
   Knockout Serum Vervanging (KSR)	20%	100 ml
   GlutaMAX 100X	2 mM	5 ml
   MEM niet-essentiële aminozuren	0,1 mM	5 ml
   Penicilline-streptomycine	100 U / ml - 0,1 mg / ml	5 ml
   2-mercaptoethanol	0,1 mM	900 pl
   B27 Supplement - zonder Vitamina	1%	10 ml
   N2 Supplement	1%	5 ml
   Knockout DMEM	-	370 ml

   
   De drager kan bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken bewaard. Om volledige groeimedium te bereiden, wordt basisch FGF toegevoegd net goederenvervoerdere voeden bij een eindconcentratie van 20 ng / ml.

Opmerking: de volledige H-ESM onder de voorwaarde dat de muis embryonale fibroblasten kunnen in plaats van mTESR1 of Nutristem worden gebruikt voor iPS cellen.

4. Plaats beklede platen in een incubator bij 37 ° C gedurende 30 min tot 2 uur voorafgaand aan passage.
5. De cellen worden gepasseerd ongeveer elke 5 dagen, zelfs als ze niet samenvloeiing bereikt. Kolonies niet moet aanraken.
6. Vervang groeimedium met 1 ml van dispase (1 mg / ml, los van een 10 mg / ml voorraad in PBS).
7. Verwijder differentiëren gebieden met getrokken glas pasteurpipetten. Gebieden die moeten worden verwijderd omvatten kraterachtige of cysteuze structuren in het centrum van de kolonies, en gedeelten waar de cellen worden gescheiden van kolonies en afgeplat en lijken te migreren naar buiten.
8. Incubeer bij 37 ° C onder een kap cultuur tot kolonie grenzen helderder en beginnen los (gewoonlijk ongeveer 5-7 minuten). Discard dispase. Wassen met 1 ml H-ESM en gooi.
9. In 1 ml H-ESM, gebruik dan een cel lifter (spatel-achtige scraper) te oogsten kolonies en verzamelen in een 15 ml Eppendorf buis. Spoelen met 1 ml H-ESM en toe te voegen aan de buis. Draaien bij 1000 RCF gedurende 4 min en verwijder het supernatant.
10. Resuspendeer pellet in 1 ml voorverwarmde groeimedium (ofwel mTESR1 of Nutristem). Vermijd opbreken klonten te veel - pipet op en neer op minder dan 6-8x. Bepalen hoeveel cellen moeten verzilverd worden en verwijder onnodige cellen (meestal 1:04 of 1:05 verdunning), bijv. voor 2 platen bij 1:05, verwijder 600 ui, voeg dan 1,6 ml vers medium.
11. Verwijder Matrigel uit platen. Plaats cellen druppelsgewijs verdelen gelijkmatig over de plaat. Vermijd het schudden van de buis overdreven, omdat dit zal leiden tot cellen te verplaatsen naar het midden.
12. Wassen buis met 1 ml medium en verdeel tussen de platen. Eindvolume in elke plaat moet 1,5 -2 ml zijn.
13. Veranderen medium elke dag, behalve de dag na de passage. Hoewel hetideaal om het medium elke dag verandert, kan dit soms worden veranderd met een frequentie van eenmaal per twee dagen, indien niet meer dan 2-3 dagen zijn verstreken sinds de laatste passage zonder dat pluripotency of differentiatie potentieel.
14. Als de cellijn moeten worden bevroren, opnieuw te schorten in plaats van 1-2 ml mFreSR bevriezing medium met behulp van een ml pipet 2 en plaats 1 ml / cryovial. Plaats flacons in een cryobox bij -80 ° C en transfer naar vloeibare stikstof in 3-4 dagen.

Opmerking: Handmatig microdissection van iPS cellen moeten onder een stereomicroscoop worden uitgevoerd. Een in vitro fertilisatie (IVF) werkplek (bv. door IVF Werkstation KSystem) geïntegreerd met een stereomicroscoop staat manipulatie van de cellen in steriele omstandigheden, terwijl ze op een verwarmd oppervlak gehouden. Als dit niet beschikbaar is, kan een stereomicroscoop worden verplaatst onder een normale laminaire stroming kap.

2. Embryoid Bodies Samenvoeging en Cardiac Induction

1. Bereid EBM-medium 20 volgens de onderstaande tabel.

   EBM-20	Eindconc	FOR 500 ml
   Fetal Bovine Serum (oorsprong Zuid-Amerika)	20%	100 ml
   MEM niet-essentiële aminozuren	0,1 mM	5 ml
   Penicilline - streptomycine	100U/ml - 0,1 mg / ml	5 ml
   GlutaMAX 100X	0,1 mM	5 ml
   2-mercaptoethanol	50um	450 pl
   DMEM/F12	-	385 ml

   
   Gebruik van FBS Zuid Amerika oorsprong is kritiek voor het bepalen van de differentiatie efficiency: dienst andere typen sera kunnen beïnvloedenhet differentiatieproces. Om volledige EBM-20, add ascorbinezuur (AA) te bereiden op een eindconcentratie van 50 ug / ml. Volledige groeimedium bij 4 ° C gedurende maximaal een week opgeslagen.
2. Harvest iPS kolonies zoals hierboven beschreven (stap 1.6 tot 1.9).
3. Resuspendeer zachtjes in 1 ml EBM-20 met een ml pipet 2. Vermijd opbreken klonten te veel - pipet op en neer niet meer dan 2-3x, controleren van de grootte van de kolonies onder de stereomicroscoop. Plaat op ultra-low bevestigingsplaten in 1:1 verhouding (bijv. voor een 35 mm schaal, gebruik 1 putje van een 6-wells plaat). Spoel buis met 1 ml EBM-20 en voeg toe aan plaat.

Opmerking: De grootte van de kolonies invloed op het differentiatieproces, controle efficiency en timing van cardiale inductie. Aggregatie van homogeen formaat EBS is aangetoond dat het wordt waargenomen tijdens differentiatie verminderen.

4. Op dag 3, wijzigen EBM-20 keer met een microscoop te vermijden removal van EBS. Houd de pipet dicht tegen elkaar van de plaat, en verwijder medium.
5. Op dag 7, switch EBS platen bekleed met 0,1% gelatine en tevoren voor 30 min bij 37 ° C. Eventueel kan gelatine worden verwijderd en de platen liet onder een celkweek kap O / N. Voeg 35-40 EBS per 35 mm schaal.
6. Controleer EBS voor het verslaan van gebieden en verandering EBM-20 twee keer per week. Markeer ze verslagen gebieden aan de bovenkant van de schaal deksel voor lokalisatie zij onder de stereomicroscoop vergemakkelijken. Aanbestedende gebieden moeten verschijnen na ongeveer 10-20 dagen.
7. Bij gebieden met spontane contractie verschijnen, schakelt medium tot EBM-2 (bereiden als EBM-20, met 2% FBS plaats) en isoleer ze, zoals hieronder beschreven in paragraaf 3.
8. Doorgaan naar andere gebieden te controleren voor het verslaan en verandering medium twee keer per week totdat verslaan gebieden zijn nodig voor verdere experimenten.

Opmerking: Efficiëntie van het differentiatieproces sterk afhankelijkverscheidene factoren, de meest kritische waarvan de specifieke cellijnen en de serum-gebruikt om cardiale differentiatie induceren. Om het hoogste rendement te verkrijgen, testen cellijnen voor cardiomyogene potentieel en diverse serumcharges.

3. Beating Gebieden Isolatie en Cultuur

1. Coat 12-well platen (4 cm ² oppervlakte) of de platen plaats met 5 ug / cm ² fibronectine, verdund in PBS om voldoende volume het gehele oppervlak volledig te bedekken (300 ul totaal per putje in 12-well platen) te maken. Ontdekt in celkweek kap te houden en laten drogen. Platen kunnen worden verpakt en opgeslagen bij 4 ° CO / N.
2. Verwijder slaan gebied met een glazen Pasteur pipet getrokken en scalpel, indien nodig. Transfer naar fibronectine gecoate platen met een ml pipet 1.
3. Voeg 1 ml EBM-2.
4. Oversteken van de plaat naar de gebieden waar de cellen werden verwijderd aangeven en veranderen het medium. Platen kunnen voor maximaal worden bewaard tot 1 maand, als andere gebieden b mag beginnenlater op het eten.

Opmerking: Als er kleinere verslagen klontjes nodig en pipetteer de geëxplanteerde gebied en neer meerdere malen onder de stereomicroscoop, totdat deze breekt in kleinere stukken. Dit zal resulteren in clusters van enkele beating cellen (zie film 3).

5. Verander medium twee keer per week tot klaar voor de analyses.

Opmerking: cardiomyocyten verkregen van de protocol bezitten foetale-achtige morfologische en functionele eigenschappen rijping tot een volwassen-achtig fenotype kan worden verkregen door verhogen van de tijd in kweek verder opsplitsen deze cellen.

4. Single Beating Cellen Isolatie en Analyse

1. Coat 2-kamer dia's (4 cm ² oppervlakte) of andere geschikte steunen met 5 ug / cm ² fibronectine verdund in PBS voldoende om de hele cultuur oppervlak bedekken. Als een glazen drager wordt gebruikt, jas met laminine en fibronectine (5 ug / cm ^{2 elk).}
2. Verwijder slaan met een Pasteur pipet / scalpel van de platen uit hoofdstuk 3.
3. Met behulp van een pipet 1 ml, overdracht cellen om een ​​15 ml buis die 500 pi collagenase II (480 U / ml in PBS met Ca en Mg) en incubeer 15 minuten bij 37 ° C, na het schudden van de buis tijdens de incubatie.
4. Pipet op en neer met een 200 ul pipet. Eventuele klonten blijven, over te dragen aan verse collagenase II en herhaal stap 4.3.
5. Herhaal stap 4.4 tot er geen grote klonten worden gelaten.
6. Inactiveren collagenase met 3 ml EBM-2 (geen AA). De buis kan dan onder de motorkap in een verwarmde rack worden gelaten tot andere tubes zijn klaar. Centrifugeer bij 1000 RCF gedurende 4 minuten.
7. Resuspendeer pellet in 1 ml 0,25% trypsine / EDTA (verdund van een 0,5% stock in 1X PBS) en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Combineer fracties van ontsluitingen van dezelfde oorspronkelijke monster.
8. Inactiveren trypsine met 4 ml EBM-2 (geen AA). Passeren cellen door middel van een 18G naald op een 2,5 ml spuit niet meer than 7x. Centrifugeer bij 1000 RCF gedurende 4 minuten.
9. Resuspendeer cel pellet in 1 ml EBM-2 per putje en plaat. Cellen kunnen worden gebruikt voor functionele en morfologische analyses 2-3 dagen na het uitplaten.

Resultaten

In onze studies gegenereerd we CM's uit verschillende iPS cellijnen. Deze lijnen werden aanvankelijk geproduceerd op een MEF feeder-laag, maar werden onmiddellijk geplaatst op Matrigel het gebruik van een bepaald medium (ofwel mTESR1 of Nutristem). Verschillende assays werden gebruikt voor het onderhoud van de morfologische eigenschappen, de expressie van markers kenmerkend pluripotente cellen (OCT-4, SSEA4 en TRA1-60) en de stabiliteit van het genoom (figuur 1) te controleren.

Discussie

Pluripotente stamcellen hebben het potentieel om spontaan differentiëren in CM, zij het met lage efficiëntie en hoge variabiliteit tussen lijnen. De ontwikkeling van nieuwe methoden inductie is daarom gericht op de verbetering van de werkwijze en bewegen naar meer gedefinieerde protocollen. De meeste van deze nieuwe differentiatie methoden zijn zeer complex en vereist uitgebreide kweekomstandigheden, fijne controle van timing en concentratie van reagentia, en behandeling met dure cytokines en groeifactoren. Ook verschil...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Media en reagentia
Human ESC-qualified Matrix	BD Biosciences	354277	Ontdooi de 5 ml fles bij 4 °C op ijs O/N, verdeel in voorgekoelde cryo-buisjes op ijs, volgens de verdunningsinstructies op het datablad en bewaar bij -20 °C .
Fibronectine, uit menselijk plasma, 0,1% oplossing	Sigma	F0896-2MG	Werkconcentratie: 5 μg/cm2
Lamine	Sigma	L2020-1MG	Werkconcentratie: 5 μg/cm2
PBS (geen Mg en Ca), 10X	Lonza	BE17-515F
PBS (met Mg en Ca), 10X	Bio Sera	XC-S2067/500
Dispase II, neutrale protease, graad II	Roche	4942078001	Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 bij -20 °C, werkoplossing: 1 mg/ml in PBS (geen Mg/Ca)
Trypsine/EDTA, 0,5%	Sigma	T3924
Collageenase type 2	Worthington	4176	Verdun tot 480 U/ml (bijv. 1,6 mg/ml) in PBS met Mg en Ca
DMEM-F12	Life Technologies	21331-020
Knockout DMEM	Life Technologies	10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR)	Life Technologies	10828-028	Ontdooi bij 4 °C, verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C
F–taal Runderserum (origineel Zuid-Amerika)	Invitrogen	10270-106	Batches moeten worden getest op hun cardiogene potentieel. Ontdooi bij 4 °C, hitte-inactiveer bij 56 °C gedurende 30 min, verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C
PenStrep, penicilline-Streptomycine, 100X	Life Technologies	15140-122
GlutaMAX, 100X	Life Technologies	35050-038
MEM NEAA, 100X	Invitrogen	11140-135
N2-supplement, 100X	Life Technologies	17502-048
B27-supplement, 50X	Life Technologies	12587-010
2-mercapto–thanol	Invitrogen	31350-010
Gelatine, uit porcine huid	Sigma	G1890-100G	Maak stock bij 1% in water, bewaar bij -20 °C. Verdun tot 0,1% in PBS en bewaar bij 4 °C
mTeSR1	Stem Cell Technologies	5850	Combineer Supplement 5X met het basismedium, verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C. Houd compleet medium niet langer dan 1 week bij 4 °C
Nutristem hESC XF	Stemgent van Biological Industries	05-100-1A	Ontdooi bij 4 °C O/N, verdeel in aliquots en bewaar bij -20 °C tot gebruik. Aliquots mogen maximaal een week bij 4 °C worden bewaard.
mFreSR	Stem Cell Technologies	5853
Ascorbinezuur	Sigma	A4544-25G	Bereid stocks op bij 10 mg/ml in water. Bewaar aliquots bij -20 °C in het donker. Voeg toe aan EBM bij de uiteindelijke concentratie (500X)
Kunststof
35 mm kweekschalen	Becton Dickinson	353001
Celkrabber	Corning Incorporated	3008
12-wells platen	Becton Dickinson	353043
Permanox 2-wells kamerschalen	Thermo Fisher Scientific	177437
Glazen 2-wells kamerschalen	Thermo Fisher Scientific	177380
6-wells platen, ultra-lage adhesieve oppervlakte	Corning Incorporated	3471
18G naald	Becton Dickinson	304622
Glazen pasteurpipetten, 230 mm	VWR International	612-1702
2,5 ml spuit	Becton Dickinson	300188
Apparatuur
IVF-werkstation	KSystem, door Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscoop	Nikon