Een Caenorhabditis elegans Model Systeem voor Amylopathy Study

Samenvatting

Beschrijven we methoden om aspecten van amylopathies in de worm te bestuderen C. elegans. We laten zien hoe je wormen die humaan Aß construeren ₄₂ In neuronen en hoe ze hun functie in de gedrags-assays te testen. We tonen verder hoe primaire neuronale kweken die worden gebruikt voor farmacologische proeven verkrijgen.

Samenvatting

Amylopathy is een term die abnormale synthese en accumulatie van amyloïde beta (Aß) in weefsels met de tijd beschrijft. AB is een kenmerk van de ziekte van Alzheimer (AD) en is gevonden in Lewy body dementie, inclusion body myositis en cerebrale amyloïde angiopathie ^1-4. Amylopathies geleidelijk ontwikkelen met de tijd. Daarom eenvoudige organismen met een korte levensduur kan helpen om moleculaire aspecten van deze voorwaarden helderen. Hier beschrijven we de experimentele protocollen aan Aß-gemedieerde neurodegeneratie met de worm Caenorhabditis elegans. Zo bouwen we transgene wormen door het injecteren van DNA dat codeert voor humaan Ap ₄₂ in de syncytieel gonaden van volwassen hermafrodieten. Transformante lijnen worden gestabiliseerd door een mutagenese-geïnduceerde integratie. Nematoden zijn leeftijd gesynchroniseerd door het verzamelen en zaaien hun eieren. De functie van neuronen die _Aß42 worden getest opportuun gedrag assays (chemotaxis assays). Primaire neuronale culturen afkomstig van embryo's worden gebruikt om gedrags-gegevens aan te vullen en aan de neuroprotectieve effecten van anti-apoptotische verbindingen te testen.

Inleiding

Amyloid beta (Aß) is een peptide van 36-43 aminozuren dat wordt gevormd na klieving van het amyloïd precursor eiwit (APP) door β en γ secretasen ^1. Het γ secretase verwerkt de C-terminale einde van het Aß peptide en is verantwoordelijk voor de variabele lengte ^5. De meest voorkomende vormen van Aß zijn Aß Aß ₄₀ en _42, welke laatste vaker geassocieerd met pathologische aandoeningen zoals AD ^5. Bij hoge concentraties Aß vorm β-sheets die aggregeren tot amyloid fibrillen vormen ^6. Fibrillen afzettingen zijn de belangrijkste component van seniele plaques omringende neuronen. Zowel plaques en diffundeerbaar, niet-plaque Aß oligomeren, wordt gedacht dat de onderliggende pathogene vormen van Ap vormen.

Laboratoriumonderzoek van neuronale amylopathies wordt gecompliceerd door het feit dat deze voorwaarden vooruitgang tijd. Daarom is important om genetisch handelbaar dier te ontwikkelen modellen-complementair aan muizen-met een korte levensduur. Deze modellen kunnen worden gebruikt om specifieke aspecten van amylopathies-typisch cellulaire en moleculaire-en uit hoofde van hun eenvoud, helpen om de essentie van het probleem vast te leggen toe te lichten. De worm Caenorhabditis elegans falls is deze categorie. Het heeft een korte levensduur, ~ 20 dagen en bovendien fundamentele cellulaire processen zoals regulatie van genexpressie, eiwit mensenhandel, neuronale connectiviteit, synaptogenese, cell signaling, en dood zijn vergelijkbaar met zoogdieren ^7. Unieke eigenschappen van de worm zijn krachtige genetica en het ontbreken van een vatenstelsel, waardoor neuronale beschadiging onafhankelijk van vasculaire schade bestuderen. Anderzijds, het ontbreken van hersenen beperkt het gebruik van C. elegans te bestuderen van vele aspecten van neurodegeneratie. Bovendien kan de reproductie en identificatie van anatomische verdeling van laesies worden uitgevoerd in dit organisme. Andere limietties omvatten de moeilijkheid om zowel verschillen in genexpressie profielen en bijzondere waardevermindering van complex gedrag en geheugenfunctie beoordelen. Hier beschrijven we methoden genereren C. elegans modellen van amylopathies.

Protocol

1. Constructie van Transgene Worms

1. Transformatie.
   1. Bereid injectie pads. Breng een druppel hete, 2% agarose opgelost in water, op een glazen dekglaasje. Plaats snel een tweede dekglaasje op de druppel en zachtjes tikken. Nadat de agarose is gestold, dia dekglaasjes elkaar en bak de dekglaasje-pad in een vacuümoven bij 80 ° CO / N.
   2. Trek pipetten. We maken gebruik van een Sutter P-97 puller naar 1/0.5 mm OD / ID borosilicate capillairen met gloeidraad te trekken. Pipetten zijn gesmeed met gesloten tip die wordt opengebroken in een later stadium.
   3. Bereid injectie mix. Dien de injectie mengsel dat het DNA van belang (20 ng / ul per construct) plus lege plasmide-DNA tot een uiteindelijke concentratie van 150 ng / ul. Centrifugeer de injectie mengsel om eventuele verontreinigingen te verwijderen. Deze stap is cruciaal omdat verontreinigingen te verminderen transformatie-efficiëntie. Breng de bovenste 5 pl (vuil en andere verontreinigingen op de bodem) een nieuwe buis be gebruikt in injectie.
   4. Laad injectie mix door capillariteit. De onderkant van de pipet wordt ondergedompeld in de injectie mix. Typisch 0,5 gl voldoende om 100 wormen injecteren.
   5. Laad injectie pipet. Plaats de pipet op de houder van de micromanipulator en breek hem open door wrijven haar tip tegen de rand van een dekglas aangebracht op een glasplaatje of als alternatief tegen vuil op de agarose pad. Dit is een cruciale stap als te groot tips beschadiging van de worm en de te kleine tips zijn gemakkelijk verstopt. De kwaliteit van de gebroken punt kan worden beoordeeld door de vorm en vooral door de stroomsnelheid. Het debiet kan worden bepaald door de grootte van de luchtbellen die uit de open uiteinde ondergedompeld in een druppel olie halogene 700 in reactie op een injectiedruk.
   6. Overdragen wormen aan injectie pad. Breng een druppel 700 halogene olie op een injectie pad en overdragen meerdere (1 of 2 voor beginners) wormen aan de olie. Gebruik een worm kiezen om de wormen te duwen naar beneden op het pad tot aan dey zich houden aan de agarose. Wormen moet worden afgestemd in rijen met ventrale zijden in dezelfde richting. Vermijd het aanraken van het hoofd worm. Indien na verschillende pogingen de wormen niet te houden aan de pad, te vervangen door een verse pad of verhogen agarose dikte en / of concentratie.
   7. Plaats de pipet in de worm. Door het verplaatsen van het podium, de positie van de worm onder het pipet. Plaats de pipet in de centrale kern van de gonaden omdat het cytoplasma wordt gedeeld door vele kiemcellen kernen. Dit verhoogt de kans op geïnjecteerde DNA leveren vele nakomelingen. De pipet moet bijna parallel aan de worm (~ 15 ° -25 ° hoek) liggen. Duw verticaal de punt van de pipet naar beneden het lichaam van de worm totdat de huid wordt ingedrukt. Dan zachtjes tikken op de manipulator naar tip's inbrengen induceren. Voor het beste resultaat te injecteren beide geslachtsklieren.
   8. Spuit de DNA-oplossing. Oefen druk uit op de pipet totdat de gonaden zwelt. Stop de stroom en trek de worm uit de pipet. Test de naald voor doorstroming en verplaatsnaar de volgende worm en herhaal injectie stappen.
   9. Herstellen van de wormen: Voeg een druppel (~ 10 pi) van herstel buffer op de wormen en incubeer tot de wormen beginnen zwemmen. Voeg een gelijk volume van de M9, wachten tot wormen hervatten zwemmen en meerdere malen te herhalen totdat de oplossing is meestal M9. Individueel wormen overbrengen naar gezaaid platen.
2. Integratie.
   1. Plaats 40 gezonde, weldoorvoede, L4 wormen in een verse plaat
   2. Bestralen met γ-ray met 4000 rad gedurende 40 minuten. Overdragen bestraalde wormen (P0) in verse, OP50 gezaaide platen (4 worms / plaat). Wormen kunnen ook worden bestraald met een dosis van 300 J / m ² UV's.
   3. Overdragen 10-20 F1 transformanten van elke plaat aan individuele platen, het etiket van de platen met de bijbehorende P0 herkomst.
   4. Single uit 2-4 F2 transformanten voor elke F1 om afzonderlijke platen. Controleer de F3 nakomelingen voor 100% transmissie van de transformatie marker. Typisch, 1-3% van de nakomelingen van een bestraald worm WilIk heb een integratie evenement.
   5. Maak voorraden van drie of meer onafhankelijke transformant lijnen.

2. Behavioral Testen

1. Age-synchronisatie.
   1. Groeien wormen in standaard 10 cm NGM platen + OP50 E. coli tot grote populatie van zwangere volwassenen is bereikt (3-5 dagen).
   2. Verzamel de wormen in 50 ml Falcon buizen hangen aan in 1 ml M9 buffer.
   3. Voeg 5 ml M9 buffer en centrifugeer bij 450 xg gedurende 3 minuten. Gooi supernatant. Herhaal dit 3-4x.
   4. Aan het einde van de laatste centrifugatie, verwijder het supernatant en voeg 10 volumes basic hypochloriet oplossing (0,5 M NaOH, 1% hypochloriet vers gemengd) aan de gepelleteerde wormen. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende ~ 10 minuten. De lysis reactie kan worden gevolgd door een daling van de lysis reactie op een dekglaasje en onderzoek van de wormen onder een microscoop. Bij ongeveer 80% van de wormen zijn gebroken de reactie moet worden gestopt.
   5. Stop de lysis reactie door adding hetzelfde volume van steriele ei buffer.
   6. Verzamel de eieren (en karkassen) door centrifugatie bij 450 xg gedurende 5 minuten.
   7. Was de eieren met steriele ei buffer 2-3x.
   8. Incubeer de eieren O / N in M9 buffer en zaad hen op standaard NGM platen.
2. Chemotaxis assay.
   1. Bereid verschillende stukken van agar ruwweg 0.5x0.5x0.5 cm. Wij storten de agar in een 10-cm plaat en we snijden de agar brokken van daar.
   2. Week de agar blok in een oplossing die het gewenste lokstof (bij verzadigende, bijna verzadigende concentraties) gedurende 2 uur. Typische lokstoffen zijn lysine (0,5 M), biotine (0,2 M).
   3. Borg een agar stuk in een 10 cm testplaat waarbij de locatie van een testpunt en een controlestip zijn gemarkeerd (Figuur 1A). Laat equilibratie en de vorming van een gradiënt O / N (Figuur 1B). Bereid 5 platen voor een enkel experiment.
   4. Vóór de proef voeg 10 ul van 20 mM _NaN3 (anesthetic) naar elke plek.
   5. Plaats 20 leeftijd-gesynchroniseerde wormen in het midden van de plaat. Plaats de plaat in de incubator bij 20 ° C.
   6. Na 1 uur, tel de dieren op de test / controle vlekken en het berekenen van de chemotaxis index (CI) als volgt: waar N, _N-test en N _Cnt., geven het totale aantal dieren, het aantal dieren in de test plek en het aantal dieren in de controle ter plaatse.

3. Primaire embryonale cel Cultuur

1. Lyse wormen zoals beschreven in leeftijd-synchronisatie.
2. Stop de reactie door toevoeging lysis hetzelfde volume steriele ei buffer en centrifugeer bij 450 xg gedurende 5 minuten. Zachtjes gooi supernatant voorzichtig om niet gepelleteerde eieren verliezen. Herhaal 2-3x of totdat supernatans helder is.
3. Resuspendeer pellet eieren (en karkassen) In 2 ml steriele ei buffer en voeg 2 ml steriele 60% sucrose in ei-buffer. Meng deze oplossing tot de eieren volledig geresuspendeerd (zo ze de neiging om samen te klonteren onder centrifugeren) met de hand of vortexen.
4. Centrifugeer bij 450 xg gedurende 15 minuten.
5. Overdragen supernatant (met daarin de eieren) voorzichtig naar een steriele buis. Gooi pellet die karkassen en andere bijproducten van de lysis bevat.
6. Resten sucrose door resuspenderen de eieren in ei buffer en centrifugatie bij 450 xg gedurende 5 minuten. Zachtjes te verzamelen en gooi het supernatant. Herhaal 3x.
7. Onder een laminaire kap resuspendeer pellet eieren in steriele ei buffer met 1 U / ml chitinaseactiviteit bij KT om de eierschalen verteren. Na 30 min beginnen om de reactie (onder een omgekeerde celcultuur microscoop) monitoren. Elke batch chitinase heeft een iets andere activiteit. Typisch digestie wordt in 1 uur voltooid.
8. Bij ongeveer 70-80% eierschalen worden verteerd door chitinase add CM-15 (L-15 celkweek medium bevattende 10% foetaal runderserum, 50 U / ml penicilline en 50 ug / ml streptomycine). Distantiëren cellen met behulp van een injectiespuit met een 27 gauge. Filter de celsuspensie met een 5,0 um filter aan intacte embryo's te verwijderen, massa's van cellen en larven.
9. Pellet de gedissocieerde celsuspensie door centrifugatie bij 450 xg gedurende 15 minuten. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in CM-15 celkweekmedium.
10. Plaat gedissocieerde cellen op glas dekglaasjes eerder bekleed met pinda lectine (0,1 mg / ml) opgelost in water. Opmerking: cellen moeten zich houden aan de ondergrond om te differentiëren.
11. Cellen kunnen worden gehandhaafd op kamertemperatuur (16-20 ° C) in lucht gedurende meer dan 2 weken.

Resultaten

Met onze protocollen bestuderen we de effecten van menselijke Aß ₄₂ oligomeer op neuronale functie ^8. Een fragment dat codeert voor humaan Ap ₄₂ en de kunstmatige signaalpeptide coderende sequentie of Fire vector pPD50.52 werd geamplificeerd uit construct PCL12 ⁹ met primers die een Sma 1 restrictie-endonuclease plaats aan de uiteinden ingebracht. Het fragment werd vervolgens in een construct dat een 2481-bp flp-6 promoter sequentie in de Fire vector pPD95.75 tussen d...

Discussie

Hier beschrijven we een gecombineerde aanpak, om cellulaire en moleculaire aspecten van amylopathies behulp C. studeren elegans. De voordelen van deze benadering zijn: 1.) Goedkope C.elegans wordt gehandhaafd normale petrischaal geënt met bacteriën, bij kamertemperatuur. 2) Krachtige genetica. Transgene dieren kunnen worden verkregen maanden en gemak promotorsequenties is om expressie van het gewenste gen in specifieke neuronen rijden. 3) Eenvoudig, goed gekarakteriseerde, zenuwstelsel. C....

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1. NGM
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	S5886	3 g
Bacteriologische agar	AMRESCO	J637	17 g
Bacto-pepton	AMRESCO	J636	2,5 g
Gedestilleerde water			Breng tot 975 ml
Gesteriliseerde door autoclaving, voeg dan de volgende items toe en meng goed
Magnesiumsulfaat	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml van 1 M voorraad
Calciumchloride	Sigma-Aldrich	C5670	1 ml van 1 M voorraad
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C3045	1 ml van 5 mg/ml voorraad (in ethanol)
Kaliumfosfaatbuffer			25 ml van 1M voorraad
2. Kaliumfosfaatbuffer
Kaliumfosfaat monobasisch	Sigma-Aldrich	P5655	108,3 g
Kaliumfosfaat dibasisch	Sigma-Aldrich	P3786	35,6 g
Gedestilleerde water			Breng tot 1 L
Gesteriliseerde door autoclaving
3. M9 buffer
Kaliumfosfaat monobasisch	Sigma-Aldrich	P5655	3 g
Natriumfosfaat dibasisch	Sigma-Aldrich	S5136	6 g
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	S5886	5 g
Magnesiumsulfaat	Sigma-Aldrich	M2643	1 ml van 1 M voorraad
Gedestilleerde water			Breng tot 1 L
Gesteriliseerde door autoclaving
4. Eierbuffer (pH 7,3, 340 mOsm)
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	S5886	118 mM
Kaliumchloride	Sigma-Aldrich	P5405	48 mM
Calciumchloride	Sigma-Aldrich	C5670	2 mM
Magnesiumchloride	Sigma-Aldrich	M4880	2 mM
HEPES	Fisher Scientific	BP310	25 mM
Gedestilleerde water			Breng tot 1 L
Gesteriliseerde door autoclaving
5. CM-15
L-15 kweekmedium	Gibco	11415	450 ml
Fetaal bovien serum	Gibco	10437-028	50 ml
Penicilline	Gibco	15140	50 units/ml
Streptomycine	Gibco	15140	50 g/ml
Pas aan tot 340 mOsm met sucrose, steriele filter vervolgens in geautoclaveerde flessen en bewaar bij 4 °C
6. Andere reagentia
Halocarbon 700 olie	Halocarbon Products	9002-83-9
5 μm Acrodisc Spuitfilter	PALL Co.	4199
Chitinase	Sigma-Aldrich	C6137-5UN
Lectine (pinda)	Sigma-Aldrich	L0881-10MG
Natriumhydroxide	Fisher Scientific	S320
Lysine	Sigma-Aldrich	L5501
Biotine	Sigma-Aldrich	B4639
Natriumhypochlorietoplossing	Sigma-Aldrich	425044
Natriumazid	Sigma-Aldrich	71289
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389