Chronische oculaire hypertensie wordt opgewekt met behulp van laserfotocoagulatie van de trabekelnetwerk in muis ogen. De intraoculaire druk (IOP) wordt verhoogd tot verscheidene maanden na laserbehandeling. De daling van de gezichtsscherpte en contrastgevoeligheid proefdieren worden gecontroleerd met behulp van de optomotor-test.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een laser-induced Mouse Model van chronische oculaire hypertensie aan Visual Gebreken karakteriseren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Glaucoom, vaak geassocieerd met verhoogde intraoculaire druk (IOP), een van de belangrijkste oorzaken van blindheid. We wilden een muismodel van oculaire hypertensie te bootsen menselijke high-drukglaucoom stellen. Hier laser verlichting wordt toegepast op het corneale limbus de waterige uitstroom photocoagulate, induceren geslotenhoekglaucoom. De veranderingen van IOP worden geanalyseerd met een rebound tonometer voor en na de laserbehandeling. Een optomotor gedragstest wordt gebruikt om overeenkomstige wijzigingen in de visuele capaciteit te meten. De vertegenwoordiger resultaat van de ene muis die opgelopen IOP hoogte ontwikkeld na de laser verlichting wordt getoond. Een verminderde gezichtsscherpte en contrastgevoeligheid wordt waargenomen in deze oculaire hypertensie muis. Samen, onze studie introduceert een waardevol modelsysteem om neuronale degeneratie en de onderliggende moleculaire mechanismen te onderzoeken in glaucomateuze muizen.
Protocol
Procedures
C57BL/6J-muizen (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) worden opgewekt aan de Northwestern University's Animal Care Facility. Alle dieren worden gebruikt in overeenstemming met de door de Northwestern University Institutional Animal Care en gebruik Comite en gelijkvormig aan de richtlijnen inzake het gebruik van dieren in Neuroscience Research van de NIH goedgekeurde protocollen.
1. Laserfotocoagulatie
De procedure van laserfotocoagulatie is gewijzigd ten opzichte van eerder gepubliceerde protocollen 5-7.
- Verdoven een 40-60 dagen oude muis door een intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg / kg, Butler Schein diergezondheid, OH) en xylazine (10 mg / kg, Lloyd Inc van Iowa, Shenandoah, IA).
- Verwijden de pupil van het rechteroog van het proefdier door plaatselijke behandeling met een of twee druppels 1% atropine sulfaat-oplossing (Alcon Labs, Inc, Fort Worth, TX).
- Na mydriasis, plat de eennterior kamer om laser inductie verbeteren 6. Plaats een glazen micropipet met scherpe tip (World precisie-instrumenten Inc, Sarasota, FL) in de voorste ruimte onder de spleetlamp (SL-3E, Topcon, Oakland, NJ) om uit te lekken uit de vloeistof in de voorste oogkamer.
- Beperken de muis in een plastic kegel houder (Braintree Sci Inc, MA) en vastgebonden op een zelfgemaakt platform (zie figuur 1A). Houd de muis met weerhouder en onthult het rechteroog van de muis om de lichtbron achter de spleetlamp. Lijn de rechter oog van de verdoofde muis onder de spleetlamp.
- Terwijl u de muis restrainer met beide handen, gelden de laser verlichting aan de hoornvlies limbus met een Argon laser (Ultima 2000SE, Coherent, Santa Clara, CA). Lever ongeveer 80-100 laserspots (514 nm, 100 mW, 50 msec puls en 200 urn spot) loodrecht rond de omtrek van het trabeculaire netwerk. De C57BL / 6 muizen hebben gepigmenteerde iris die als een barrière voor elke p fungeertotential verdwaalde energie 7.
- Instill topische 0.5% moxifloxacine (Alcon Labs, Inc, Fort Worth, TX) op het oculaire oppervlak om de laser-behandelde stippellijn 0,5% proparacaïne (Bausch & Lomb, Rochester, NY) om pijn te verlichten desinfecteren.
- Houd het dier op een verwarmingselement (Sunbeam Products Inc, Boca Raton, FL) voor herstel voor ongeveer een uur totdat het volledig wakker.
- Het linkeroog onbehandeld te dienen als controle.
2. IOP Metingen
- Plaats de wakkere muis in een buis te laden in de kunststof conus houder en dan beperken zij op het platform (zie Figuur 2A).
- Laat 5-10 minuten zodat de muis krijgt aangepast aan de houder plaats. Benader de rebound tonometer (TonoLab, Koloniale Medical Supply, Franconia, NH) om de muis oog totdat de sonde tip is 2-3 mm afstand van het oppervlak van het hoornvlies 14.
- Druk op de knop meting te laten de sonde raken het midden oppervlakvan het hoornvlies voorzichtig. Drie opeenvolgende sets van zes metingen van IOP van hetzelfde oog worden verkregen en gemiddeld de IOP van het oog. De onbehandelde controle oog wordt altijd eerst gemeten om een nulmeting voor de laser-behandelde oog dat de volgende keer wordt gemeten krijgen.
3. Optomotor Test
Gezichtsscherpte en contrastgevoeligheid getest 14,15. De twee ogen van individuele muizen worden afzonderlijk onderzocht door het omkeren van de richting drijven raster, dat wil zeggen een klok drifting raster gebruikt om de visuele functie van het linkeroog en linksom drijven raster voor het rechteroog 16 identificeren. Elke test duurt ongeveer 15 minuten en wordt herhaald door twee waarnemers onafhankelijk van elkaar.
- Plaats de muis en laat de muis om vrij te bewegen op een verhoogd platform omringd door vier computerschermen (figuur 3A-B).
- Het opzetten van de monitoren, zodat ze elkaar horizontaal drijven sinusvormigeroosters als visuele stimuli met een gemiddelde lichtsterkte van 39 cd / m 2. De bewegingsrichting van het rooster moeten afwisselen achtereenvolgens tussen de klok mee en tegen de klok in.
- Analyseer de bewegingen van het dier. De bewegingen van het dier in-concert met de drijvende roosters worden beschouwd als "positief" binnen 15 seconden na de visuele stimulus is en vervolgens geleidelijk verhoogd. De hoogste respons uitlokken visuele stimulus wordt gedefinieerd als gezichtsscherpte het dier 17.
- Onderzoekt de contrastgevoeligheid op drie vooraf geselecteerde ruimtelijke frequenties: 0.075, 0.16 en 0.3 cycli per graad (CPD). Het contrast drempel voor elk oog wordt gedefinieerd als de laagste contrast die visuele responsen uitlokt bij de vooraf vastgestelde frequentie. De contrastgevoeligheid is het omgekeerde van de drempel van 17.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Zoals beschreven in de procedures wordt laserbelichting gericht op het trabeculaire maaswerk van het limbale gebied van de waterige uitstroom photocoagulate, induceren geslotenhoekglaucoom (figuur 1). De meeste gelaserde ogen vertoonden geen significante fysieke schade, pigment onthechting of infectie, in overeenstemming met eerdere bevindingen 6. Bij een kleine groep muizen (minder dan 5% van alle gelaserde dieren) vertoonden lichamelijke tekenen van ernstige schade, zoals leeggelopen oog ba...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Wij rapporteren boven die aanhoudende oculaire hypertensie kan worden geïnduceerd door laser verlichting in de muis ogen. Vergeleken met de zoutoplossing model 18 en de ader cautery model 11 beide vereisen uitgebreide microchirurgische vaardigheden, de laser verlichting is relatief eenvoudig en gemakkelijk uit te voeren. Meestal kunnen we de laser verlichting voeren voor 4-6 muizen in 2-3 uur. De kritische stappen naar duurzame IOP hoogte te bereiken, zijn de voorste kamer afvlakken voordat laser e...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
De auteurs zijn full-time medewerkers van de Northwestern University.
De auteurs kregen GEEN financiering die werd verstrekt door bedrijven die reagentia en instrumenten die in dit artikel te produceren.
Dankbetuigingen
De werkzaamheden die in dit document is ondersteund door de Dr Douglas H. Johnson Award voor Glaucoom Research van de American Health Assistance Foundation (XL), de William & Mary Greve Special Scholar Award van het Onderzoek ter voorkoming van Blindheid (XL), de Illinois Vereniging ter Voorkoming van Blindheid (HC) en NIH-subsidie R01EY019034 (XL).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagens | |||
| moxifloxacin | Alcon Labs, Inc. | NDC 0065-4013-03 | 0,5 %, alleen op recept |
| Proparacaine Hydrochloride | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | 0,5 %, alleen op recept |
| Ophthalmic Solution USP | Bausch Lomb | NDC 24208-730-06 | 0,5 %, alleen op recept |
| ketamine | Butler Schein Animal Health | NDC 11695-0550-1 | 100 mg / kg |
| xylazine | LLOYD Inc. of Iowa | NADA 139-236 | 10 mg / kg |
| atropine sulfate solution | Alcon Labs, Inc. | NDC 61314-303-02 | 1 %, alleen op recept |
| Uitrusting | |||
| Slit Lamp, TOPCON | Visual Systems Inc | SL-3E | aangedreven door PS-30A |
| OptoMotry 1.8.0 virtueel | CerebralMechanics Inc. | ||
| opto-kinetisch testsysteem | CerebralMechanics Inc. | ||
| Tonometer, TonoLab, voor muizen | Colonial Medical Supply | ||
| Verwarmingskussen | Sunbeam Products Inc | 722-810 | |
| Argon laser | Coherent Inc | Ultima 2000SE | |
| DECAPICONE Plastic kegelhouder | Braintree Sci Inc. | MDC-200 | voor muis |
Referenties
- Gupta, N., Yucel, Y. H. Glaucoma as a neurodegenerative disease. Curr. Opin. Ophthalmol. 18, 110-114 (2007).
- Quigley, H. A. Neuronal death in glaucoma. Prog. Retin. Eye Res. 18, 39-57 (1999).
- McKinnon, S. J., Schlamp, C. L., Nickells, R. W. Mouse models of retinal ganglion cell death and glaucoma. Experimental Eye Research. 88, 816-824 (2009).
- Pang, I. H., Clark, A. F. Rodent models for glaucoma retinopathy and optic neuropathy. J. Glaucoma. 16, 483-505 (2007).
- Levkovitch-Verbin, H., et al. Translimbal laser photocoagulation to the trabecular meshwork as a model of glaucoma in rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 43, 402-410 (2002).
- Aihara, M., Lindsey, J. D., Weinreb, R. N. Experimental mouse ocular hypertension: establishment of the model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 44, 4314-4320 (2003).
- Grozdanic, S. D. Laser-induced mouse model of chronic ocular hypertension. Investigative ophthalmology & visual science. 44, 4337-4346 (2003).
- Sappington, R. M., Carlson, B. J., Crish, S. D., Calkins, D. J. The microbead occlusion model: a paradigm for induced ocular hypertension in rats and mice. Investigative ophthalmology & visual science. 51, 207-216 (2010).
- Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Experimental Eye Research. 92, 512-520 (2011).
- Kalesnykas, G., et al. Retinal ganglion cell morphology after optic nerve crush and experimental glaucoma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53, 3847-3857 (2012).
- Shareef, S. R., Garcia-Valenzuela, E., Salierno, A., Walsh, J., Sharma, S. C. Chronic ocular hypertension following episcleral venous occlusion in rats. Experimental Eye Research. 61, 379-382 (1995).
- Chiu, K., Chang, R., So, K. F. Laser-induced chronic ocular hypertension model on SD rats. J. Vis. Exp. (10), e549(2007).
- Fu, C. T., Sretavan, D. Laser-induced ocular hypertension in albino CD-1 mice. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51, 980-990 (2010).
- Rangarajan, K. V. Detection of visual deficits in aging DBA/2J mice by two behavioral assays. Curr. Eye Res. 36, 481-491 (2011).
- Wang, L., et al. Direction-specific disruption of subcortical visual behavior and receptive fields in mice lacking the beta2 subunit of nicotinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 29, 12909-12918 (2009).
- Douglas, R. M., et al. Independent visual threshold measurements in the two eyes of freely moving rats and mice using a virtual-reality optokinetic system. Visual Neuroscience. 22, 677-684 (2005).
- Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 4611-4616 (2004).
- Morrison, J. C., et al. A rat model of chronic pressure-induced optic nerve damage. Experimental Eye Research. 64, 85-96 (1997).
- Cone, F. E., et al. The effects of anesthesia, mouse strain and age on intraocular pressure and an improved murine model of experimental glaucoma. Experimental Eye Research. 99, 27-35 (2012).
- Liu, X., et al. Brain-derived neurotrophic factor and TrkB modulate visual experience-dependent refinement of neuronal pathways in retina. J. Neurosci. 27, 7256-7267 (2007).
- Liu, X., et al. Regulation of neonatal development of retinal ganglion cell dendrites by neurotrophin-3 overexpression. The Journal of Comparative Neurology. 514, 449-458 (2009).
- Sun, W., Li, N., He, S. Large-scale morphological survey of mouse retinal ganglion cells. The Journal of Comparative Neurology. 451, 115-126 (2002).
- Feng, L., et al. Sustained Ocular Hypertension Induces Dendritic Degeneration of Mouse Retinal Ganglion Cells that Depends on Cell-type and Location. Investigative Ophthalmology & Visual Science. , (2013).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
