Infrarood zenuwstimulatie is voorgesteld als een alternatief voor elektrische stimulatie in een reeks zenuw types, waaronder die gepaard gaan met het gehoorsysteem. Dit protocol beschrijft een patch clamp methode voor het bestuderen van het mechanisme van infrarood zenuwstimulatie in een kweek van primaire auditieve neuronen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Whole Cell Patch Clamp voor Onderzoek naar de mechanismen van Infrarood Neural Stimulatie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Aangetoond is de laatste jaren dat gepulste, infrarood laserlicht kan worden gebruikt om elektrische reacties uitlokken in neuraal weefsel, onafhankelijk van de verdere modificatie van het doelweefsel. Infrarood zenuwstimulatie gerapporteerd in een verscheidenheid van perifere sensorische en neuraal weefsel in vivo, met weergegeven in stimulatie van neuronen in de gehoorzenuw bijzonder belang. Echter, terwijl de INS is aangetoond dat het werken in deze instellingen, het mechanisme (of mechanismen) waardoor infrarood licht veroorzaakt neurale excitatie is op dit moment niet goed begrepen. Het protocol hier gepresenteerde beschrijft een hele cel patch clamp methode ontwikkeld om het onderzoek van de infrarode neurale stimulatie in gekweekte primaire auditieve neuronen vergemakkelijken. Door grondig karakteriseren van de respons van deze cellen infrarode laser belichting in vitro onder gecontroleerde omstandigheden, kan het mogelijk zijn om een beter begrip van de fundamentele Physica krijgenl en biochemische processen die ten grondslag liggen infrarode neurale stimulatie.
Inleiding
De velden van de neurofysiologie en de medische bionica sterk afhankelijk van technieken die regelbare stimulatie van elektrische reacties in zenuwweefsel kunnen. Terwijl elektrische stimulatie blijft de gouden standaard zenuwopwekplaatsen, lijdt aan een aantal nadelen, zoals de aanwezigheid van stimulatie artefacten bij het opnemen neurale respons, en een gebrek aan stimulatie specificiteit door de verspreiding van stroom in omringende weefsel 1.
De laatste twee decennia hebben de ontwikkeling van optisch gemedieerde stimulatie technieken 2 gezien. Een aantal van deze technieken vereisen aanpassing van het doelwee....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Cultuur van Spiral ganglionneuronen
- Steriliseren kleine ronde (bv. 10 mm diameter) dekglaasjes en gebogen pincet in een autoclaaf. Breng de gesteriliseerde dekglaasjes in afzonderlijke putjes van een steriele 4-ring 35 mm petrischaaltje of 4-well plaat, met behulp van de gesteriliseerde tang. Breng 150 pi van poly-L-ornithine (500 ug / ml) en muis laminine (0,01 mg / ml) op het bovenoppervlak van het dekglaasje en in een incubator (37 ° C) gedurende 48 uur. Zorg ervoor dat de dekglaasjes niet wegdrijven van de bodem van de put.
- Bereid 50 ml steriel Neurobasal media (NBM) voor elke neurale cultuur: 47,5 ml Neurobasal A, 0,5 ml N2<....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Ganglion spirale neuronen reageren op laser belichting met herhaalbare golfvormen in het voltage-clamp en stroom-clamp opname configuraties. Figuur 3a toont typische veranderingen in stroom over een celmembraan in respons op een 2,5 msec, 0,8 mJ laserpuls (gemiddelde reactietijd van 6 laserpulsen herhaald met intervallen van 1 seconde) met de membraanpotentiaal gehouden op -70 mV, -60 mV en -50 mV. Net naar binnen stromen worden consequent opgeroepen als reactie op laserpulsen, terug te keren naar de in.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Met behulp van de in deze paper protocollen is het mogelijk om uit te pakken en cultuur spiraal ganglion neuronen en laser-opgewekte elektrische activiteit te onderzoeken door hele cellen patch clamp experimenten uitvoeren. Bij gebruik in vitro, de patch clamp techniek geeft een mate van controle over de experimentele parameters die niet haalbaar in vivo. Laserstimulatie parameters zoals golflengte, pulsenergie, pulslengte, pulsvorm, en pulsherhalingsfrequentie sequenties kunnen worden onderzocht in ee.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de Australische Raad voor Onderzoek onder Linkage Project subsidie LP120100264.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Celcultuurmaterialen en apparatuur | |||
| Glascoverslips | Lomb Scientific | CSC 10 1 GP | |
| 4-ring celcultuurschaal | VWR International | 82050-542 | |
| Poly-L-ornithine oplossing | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Laminine | Invitrogen | 23017-015 | |
| Gebogen pincetten | WPI | 14101 | Dumont #5 pincetten (45° hoektip) |
| CO2 Incubator | ThermoScientific | Heracell 150i | |
| Tabel 1. Celcultuurmaterialen en apparatuur. | |||
| Neurobasal media | |||
| Neurobasal A | Gibco | 10888-022 | |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | |
| B27 serum-vrij supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| Penicilline-Streptomycine | Invitrogen | 15140-148 | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030-149 | |
| Intracellulaire oplossing | |||
| Kaliumchloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Kalium D-gluconaat | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Na2ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| Kaliumhydroxide | LabServ | BSPPL738.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Extracellulaire oplossing | |||
| Natriumchloride | Sigma-Aldrich | 310166 | |
| Kaliumchloride | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| Calciumchloride | Sigma-Aldrich | 383147 | |
| Magnesiumchloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Natriumhydroxide | LabServ | BSPSL740.500 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S8501 | |
| Tabel 2. Oplossingen voor celcultuur en patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellulaire oplossing. c) Extracellulaire oplossing. | |||
| Staande microscoop | Zeiss | AxioExaminerD1 | Uitgerust met Dodt contrast |
| Water-immersie objectief | Zeiss | W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75 | |
| Platform en X-Y trap | ThorLabs | Burleigh Gibraltar | |
| Opnamekamer | Warner Instruments | RC-26G | |
| Vibratie-isolatie tafel | TMC | Micro-g 63-532 | |
| CCD Camera | Diagnostic Instruments | RT1200 | |
| Camera software | Diagnostic Instruments | SPOT Basic | |
| Inline oplossingsverwarmer | Warner | SH-27B | |
| Temperatuurregelaar | Warner | TC-324B | |
| Patch clamp versterker | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Patch clamp data acquisitie systeem | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-325 | |
| Micropipet glas | Sutter Instruments | GBF100-58-15 | Borosilicaatglas met filament |
| Micropipet Puller | Sutter Instruments | P2000 | |
| Opname Software | AxoGraph | Lab pack en elektrofysiologie tools | |
| Aspiratiefles | Sigma-Aldrich | CLS12201L | 1 L Pyrex aspiratiefles, met uitlaat voor slang |
| PE Slang | Harvard | PolyE #340 | |
| Masterflex peristaltiek pomp | Cole-Parmer | HV-07554-85 | |
| Tabel 3.Patch clamp apparatuur. | |||
| 1,870 nm laserdiode | Optotech | ||
| 200/220 μm diameter multimode optische glasvezel patch kabel (FC/PC) | AFW Technologies | MM1-FC2-200/220-5-C-0.22 | Lichtaflevering optische glasvezel, silica kern en coating, 0.22 NA |
| Optische glasvezel door connector (FC/PC) | Thorlabs | ADAFC2 | |
| Optische glasvezel splijtgereedschap | EREM | FO1 | |
| Optische glasvezel strip gereedschap (0.25 - 0.6 mm) | Siemens | Voor het verwijderen van de optische glasvezelmantel | |
| Optische glasvezel strip gereedschap (0.6 - 1.0 mm) | Siemens | Voor het verwijderen van de buitenste coating van de patch kabel | |
| Signaalgenerator | Elke signaalgenerator die de nodige pulsvormen kan produceren en in staat is om extern te worden getriggerd | ||
| Optische glasvezel positioner | Op maat gemaakte positioner. Kan worden vervangen door standaard micropositioner gebruikt voor patch clamp experimenten | ||
| Optische glasvezel klemvinger | Newport | FPH-DJ | |
| Laser vermogensmeter en detectorkop | Coherent | FieldMate (vermogensmeter) met LM-3 (detectorkop) | |
| Tabel 4. Laserapparatuur. |
Referenties
- Wells, J., Kao, C., Jansen, E. D., Konrad, P., Mahadevan-Jansen, A. Application of infrared light for in vivo neural stimulation. Journal of Biomedical Optics. 10, 064003(2005).
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical rad....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
