Adenovirale genoverdracht in naïeve CD4 T-cellen met transgene expressie van de Coxsackie adenovirus receptor kan de moleculaire analyse van regulatoire T celdifferentiatie In vitro.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Adenovirale transductie van Naïeve CD4 T-cellen aan Treg Differentiatie Studie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Regulatoire T-cellen (Tregs) zijn essentieel voor immunotolerantie aan zichzelf en aan bepaalde vreemde antigenen. Tregs kunnen vanuit naïeve CD4 T-cellen in vitro met TCR-en co-stimulering in de aanwezigheid van TGFp en IL-2. Dit draagt enorm potentieel voor toekomstige therapie echter de moleculen en signaalwegen control differentiatie grotendeels onbekend.
Primaire T-cellen kunnen worden gemanipuleerd door ectopische genexpressie, maar gemeenschappelijke methoden niet aan de belangrijkste naïeve toestand van de T-cel te richten voor primaire antigen herkenning. Hier bieden we een protocol om buitenbaarmoederlijke genen tot expressie in naïeve CD4 T-cellen in vitro voor het induceren van Treg differentiatie. Het geldt transductie met de replicatie-deficiënte adenovirus en legt de opwekking en productie. Het adenovirus kan nemen grote inserts (tot 7 kb) en kan worden uitgerust met de initiatiefnemers te hoog en voorbijgaande OVEREXP bereikenression in T-cellen. Het transduceert effectief naïeve muis T-cellen als ze drukken een transgeen Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Belangrijk na infectie de T cellen blijven naïeve (CD44 laag, CD62L hoog) en rustend (CD25 -, CD69 -) en kan worden geactiveerd en gedifferentieerd tot Tregs Soortgelijke niet-geïnfecteerde cellen. Zo, deze methode maakt manipulatie van CD4 T-cel differentiatie vanaf het allereerste begin. Het zorgt ervoor dat ectopische genexpressie is al op zijn plaats wanneer vroege signalering gebeurtenissen van de eerste TCR stimulatie induceert cellulaire veranderingen die uiteindelijk leiden naar Treg differentiatie.
Inleiding
Tregs zijn cruciaal om immuun tolerantie te handhaven en overschrijding immuunreacties temperen. Tregs onderdrukken omstander T-cel activatie. Bijgevolg ablatie van Tregs leidt tot fatale auto-immuniteit en zelfvernietiging gedreven door geactiveerde T-cellen 1. Tregs in de thymus ontwikkelen in negatieve selectie van CD4-positieve enkelvoudige precursors, maar ze kunnen ook differentiëren in de periferie van naïeve CD4 T-cellen bij lage dosis antigeen stimulatie met suboptimale costimulatie 1,2. Thymus Tregs lijken weefsel auto-immuniteit onderdrukken tegen zelf-antigenen, terwijl perifere Tregs zijn betrokken bij het verstrekken van tolerantie....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Klonen van een gen van belang in een Entry Vector
- Kloon het gen van belang in een invoer vector. PCR amplificatie van het gen, gevolgd door blunt-end ligatie in een topoisomerase-gekoppelde vector (bijv. pENTR / D-TOPO) of restrictie-enzym-gemedieerde klonering kan worden gebruikt voor deze procedure.
2. Het overbrengen van het gen van belang in de pCAGAdDu Destination Vector
- Overdracht van het gen van interesse van de binnenkomst vector in de bestemming vector door LR recombinatie (bijvoorbeeld Gateway LR Clonase II Enzym Mix). Dit zal de adenovirale expressievector (afbeelding 1).....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Virus Production
Voor het genereren van hoge virus titers, de timing van HEK293A celoogst in primaire virusproductie of virusreplicatie cruciaal. Representatieve fluorescente en fasecontrastbeelden met visuele tekenen van virusproductie zijn weergegeven in figuur 3. De CPE werden waargenomen 10 dagen na transfectie van HEK293A cellen met een controle pCAGAdDu vector zonder insert. CPE worden gekenmerkt door de verschijning van gebieden met vergrote en round-up cellen die beginn.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Virusproductie en titratie
Voor optimale transfectie resultaten, de kwaliteit en de hoeveelheid gelineariseerde vector uiterst belangrijk. We hadden geen negatieve effecten hebben op de primaire productie lysaat observeren vanuit een aanvankelijke sterke groei van de cultuur sinds de infectie zal snel overgaan zodra efficiënte virus productie plaatsvindt. Echter, virusproductie door HEK293A cellen worden beïnvloed door lange inserts die de doeltreffendheid verminderen. Sommige open reading fram.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag Lirui Du bedanken voor het construeren van de pCAGAdDU vector en Oliver Gorka voor bepaling van de fixatie protocol.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| pENTR/D-TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K240020 | |
| Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | 11791020 | |
| PacI | New England Biolabs | R057S | |
| jetPEI | Polyplus-transfectie | 101-10N | |
| HEK293A-cellijn | Invitrogen | R705-07 | |
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| 6-well platen | BD Falcon | 353046 | |
| 14 cm weefselkweekschaal | Nunc | 168381 | |
| BALB/cJ-Tg(DO11.10)10Dlo Tg(CARΔ1)1Jdgr | Taconic Farms | Model Nr. 4285 | |
| Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II | Miltenyi Biotech | 130-094-131 | |
| DMEM | Invitrogen | 41966-052 | |
| FBS | PAN Biotech | 1502-P110704 | |
| PenStrep | Invitrogen | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | |
| NaPyruvate | Lonza | BE13-115E | |
| NEAA 100x | Lonza | BE13-114E | |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | |
| HEPES-bufferoplossing (1 M) | Invitrogen | 15630-056 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M-7522 | |
| MEM Essential vitaminmixture (100x) | Lonza | 13-607C | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 voor Celexpansie en Activering | Invitrogen | 114-56D | |
| Recombinant Human TGF-beta 1 | R&D Systems | 240B | |
| Proleukin S (18 x 106IE) | Novartis | ||
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit | Invitrogen | L-23105 | |
| Mouse BD Fc BlockT | BD Pharmingen | 553141 | |
| Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE | eBioscience | 12-5773-82 | |
| Mmu-miR-155 TaqMan MicroRNA Assay | Roche Applied Biosystems | 4427975 | |
| LightCycler 480 Probes Master | Roche Applied Biosystems | 04902343001 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Roche Applied Biosystems | 4366596 |
Referenties
- Lahl, K., Loddenkemper, C., et al. Selective depletion of Foxp3+ regulatory T cells induces a scurfy-like disease. The Journal of Experimental Medicine. 204 (1), 57-63 (2007).
- Kretschmer, K., Apostolou, I., Hawiger, D., Khazaie, K., Nussenzweig, M. C., von Boehmer, H.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
