Protocollen voor het beoordelen van radiofrequentie Interacties met gouden nanodeeltjes en Biological Systems voor niet-invasieve Hyperthermie Cancer Therapy

Samenvatting

We beschrijven protocollen gebruikt om de interacties van 13,56 MHz radiofrequentie (RF) onderzoeken elektrische velden met gouden nanodeeltjes colloïden in zowel niet-biologische en biologische systemen (in vitro / vivo). Deze interacties worden onderzocht voor toepassing bij kankertherapie.

Samenvatting

Kankertherapieën die minder toxisch en invasief dan hun bestaande tegenhangers zijn zeer gewenst. Het gebruik van elektrische RF-velden die diep in het lichaam, waardoor minimale toxiciteit, worden momenteel bestudeerd als een levensvatbare middel van niet-invasieve kankertherapie. Het is voorzien dat de interacties van RF-energie met geïnternaliseerde nanodeeltjes (NP) warmte die vervolgens kunnen leiden tot oververhitting (hyperthermie) van de cel kan bevrijden, uiteindelijk eindigt in cel necrose.

In het geval van niet-biologische systemen presenteren we gedetailleerde protocollen betreffende kwantificeren van de warmte vrijgemaakt door hooggeconcentreerde NP colloïden. Voor biologische systemen, in het geval van in vitro experimenten, beschrijven we de technieken en de voorwaarden die moeten worden nageleefd om kankercellen effectief bloot aan RF-energie zonder bulk media verwarming artefacten aanzienlijk verduistert de gegevens. Tot slot geven we een gedetailleerde methodologie fof in vivo muismodellen met buitenbaarmoederlijke lever kanker tumoren.

Inleiding

De absorptie van RF-energie op biologisch weefsel (vanwege de inherente elektrische permittiviteit) resulteert in verhoogde temperaturen weefsel als functie van de tijd, die uiteindelijk leidt tot celdood door hyperthermie. Er wordt verondersteld dat kanker hyperthermie kan worden geoptimaliseerd door het gebruik van gerichte nanomaterialen die internalisering in de kankercel en fungeren als RF-thermische sensoren, waardoor de aangrenzende gezonde, normale cellen intact. Verschillende rapporten hebben al aangetoond dat een verscheidenheid aan NP's zo effectief RF warmtebronnen die helpen bij kanker necrose ^1-4 kan handelen.

In deze groet, goud NP (AuNPs) ^3-5, koolstof nanobuisjes ¹ en quantum dots ^{6, 7} hebben spannende kenmerken vertoonde bij toepassing in zowel in vitro als in vivo RF experimenten. Hoewel de precieze aard van het verwarmingsmechanisme van deze NP bij blootstelling aan een RF-veld wordt nog steeds gediscussieerd, een reeksfundamentele experimenten met AuNPs heeft grote betekenis gelegd op zowel NP grootte en aggregatie toestanden. Er werd aangetoond dat alleen AuNPs met een diameter <10 nm verwarmt wanneer blootgesteld aan een RF-veld ^8. Ook wordt deze verwarming mechanisme aanzienlijk verzwakt wanneer de AuNPs worden samengeteld. Deze aggregatie toestand werd ook bevestigd in in vitro modellen die belang gelegd op het optimaliseren AUNP colloïdale stabiliteit binnen endolysomal intracellulaire compartimenten voor effectieve RF-therapie ^4. Echter, de technieken en experimentele principes gebruikt om deze gegevens te verzamelen en evalueren problematisch, vooral bij valideren RF warmteprofielen van NP colloïden.

Verscheidene rapporten hebben aangetoond dat jouleopwarming van de achtergrond ionische suspensie die de NP gesuspendeerd in de belangrijkste bron van RF warmteproductie en niet de NP zelf ^9-12 kunnen zijn. Hoewel onze recent artikel ⁸ heeft gevalideerd thij gebruik van RF-interacties in het opwekken van warmte uit AuNPs van een diameter kleiner dan 10 nm, willen we deze protocollen beschrijven meer in detail in dit artikel.

We tonen ook aan de protocollen en technieken die nodig zijn om de doeltreffendheid van AuNPs als hypertherme thermische middelen, zowel in vitro als in vivo experimenten leverkanker modellen evalueren. Hoewel we voornamelijk gericht op eenvoudige colloïden-citraat bedekte AuNPs, kunnen dezelfde technieken worden toegepast op andere AUNP hybriden zoals antilichaam-en chemotherapie-geconjugeerde complexen. Bij het opvolgen van deze beginselen de experimentator hopelijk kunnen de mogelijkheden voor nanomateriaal een effectieve RF-geïnduceerde thermische hypertherme agent snel evalueren.

Protocol

Een volledige experimentele overzicht in figuur 1 weergegeven.

Verdere details worden weergegeven in onderstaande stappen 1-3.

1. Het beoordelen van RF Verwarming van NP colloïden: AuNPs als voorbeeld

1. In het algemeen, voor elk NP monster wordt onderzocht, het monster eerst een paar keer wassen door een centrifuge filter met gedeïoniseerd (DI) water naar de achtergrond ionen en verontreinigingen te verwijderen. Alle ionen en contaminanten zal zijn verwijderd uit de AUNP schorsing wanneer de vloeistof wordt uitgewassen heeft vergelijkbare RF verwarmingssnelheden (HRS) als DI water. Dit zuiveringsproces maakt ook hogere concentraties NP te verkrijgen. Het is vermeldenswaard dat, hoewel gebruik AuNPs in dit voorbeeld, kan de fundamentele beginselen worden toegepast op andere materialen NP.
2. Als voorbeeld, zuiveren een flesje van 500 ml commercieel verkrijgbaar AuNPs diameter van 5 nm en vervolgens daarop een 13.56 MHz RF-veld van elektrische-field sterkte 90 kV / m.
   1. Neem ~ 125 ml uit de voorraad AUNP oplossing en split tussen zes 50 kDa centrifuge filter buizen. Centrifugeer bij 3000 rpm. gedurende 2 min 5 sec. Verwijder gefilterd buffer en vulling filters met meer voorraad oplossing. Herhaal dit tot alle 500 ml is gefilterd.
   2. Vervang de gefilterde buffer met een vergelijkbaar volume van DI-water en herhaal ongeveer 8 keer (of totdat de gefilterde buffer RF HRs gelijkwaardig zijn aan DI-water). Opmerking, UV-Vis-analyse kan ook worden gebruikt om verontreiniging absorptiepieken controleren. Zodra de buffer verontreinigingen volledig zijn verwijderd, pipet ongeveer 0,5 ml DI water in elk filter en resuspendeer de AuNPs door herhaald pipetteren. Dit moet de AuNPs volledig te verwijderen uit het filter en zorgen voor volledige resuspensie. Combineer alle zes schorsingen in een 15 ml Eppendorf buis.
   3. Zodra de AuNPs zijn gezuiverd en geconcentreerd, analyseert het monster met behulp van ICP-OES en / of ICP-MS, UV-vis en Zeta potentieel voor gegevens over concentration en NP stabiliteit, respectievelijk. SEM en / of TEM analyse kan ook worden gebruikt om morfologische gegevens te verkrijgen. Gedetailleerde monstervoorbereiding voor deze technieken is te vinden in de literatuur ^4.
3. Met behulp van de Kanzius RF-systeem in eerdere studies ⁸ beschreven, of afleidingen van dit systeem, plaats een 1,3 ml cilindrische kwartscuvet zodat het RF elektrische veld in de lucht (zonder monster aanwezig) zou zijn ~ 90 kV / m in de cuvet. Voor een standaard zoutoplossing monster (0,9% NaCl) het elektrisch veld wordt verminderd tot ~ 1,1 kV / m.. Dit zijn de voorwaarden bij benadering gebruikt om vergelijkingen worden gemaakt tussen de verschillende systemen.
   1. Pipetteer 1,3 ml van een 1,000 mg / l monster van gezuiverd AUNP colloïde in de kwartscuvette en introduceren deze in het RF-veld. Dit kan worden gedaan met behulp van een custom-built Teflon monsterhouder. Expose monster naar de RF-veld gedurende 120 seconden of totdat het monster 70 ° C bereikt elektrische vonken of snel koken te voorkomen. Capture de thermal imaging data (evenals controle gebieden) met behulp van een IR-camera en bijbehorende software. Herhaal deze procedure drie keer.
   2. Filter de steekproef via een andere 50 kDa centrifuge filter om de AuNPs uittreksel uit het DI waterbuffer. Drie keer opnieuw bloot de buffer naar de RF-veld weer. Het verschil in uren tussen de AUNP colloïde en de achtergrond DI waterbuffer bepaalt de HR als gevolg van de AuNPs zelf. Verwachten dat HRs van ~ verkrijgen 0,3 ° C / sec en 0,05 ° C / sec tot een AUNP afhankelijke HR van ~ 0.25 ° C / sec geven. Resuspendeer de resterende AuNPs van de filter in 1,3 ml water voor in vitro / vivo experimenten.

2. Nanodeeltjes bijgestaan ​​RF-geïnduceerde Hyperthermie: In vitro studies

1. Deze in vitro studies kan worden toegepast op elk type van kanker celtype dat 2D monolagen vormen. In dit experiment gebruikt humane hepatocellulaire carcinoom afgeleide Hep3B cellen.
   1. Plaat ~ 50.000 celIs aan de voorkant drie putjes van een 12-wells plaat met 1 ml groeimedium. Herhaal dit 6 keer (gebruik drie platen voor NP studies en drie platen als controle). Incubeer bij 37,5 ° C gedurende 24 uur vóór de invoering van de NP. Steriliseren NP eerste gebruik van bioveiligheid kast UV-blootstelling aan licht gedurende 5 minuten.
   2. In elk putje introduceren 0,1 ml van een 1,000 mg / L AUNP oplossing en laat nog eens 24 uur. Voeg 0,1 ml water toe aan elk putje van de drie controle celplaten en ook laat voor 24 uur.
   3. Na 24 uur zijn verstreken, zuigen de cel media en wassen met PBS aan elk oppervlak gebonden AuNPs verwijderen. Vervang de cel media. Cellen zijn nu klaar voor blootstelling aan radiogolven.
2. Plaats elke 12-well cel pak binnen het RF-veld. Wacht tot de cellen tot 31 ° C afgekoeld Zet de RF-generator en bloot voor 3,5 minuten. De eindtemperatuur van het celmedium wordt ~ 37 ° C. Zet de RF-veld. Verwijder de cellen en plaats ze in een incubator gedurende 24 uur voor analyse.
   1. Verwijder cellen uit de incubator en zuig cel media. Voeg 1,6 ml celmedium aan elk putje en 0,4 ml MTT reagens. Incubeer de cellen gedurende 4 uur. Zuig media en vervangen door 2 ml dimethylsulfoxide (DMSO). Plaats de cel platen op een bankje rocker en laat gedurende 10 minuten om de DMSO aan de MTT reagentia oplosbaar te maken. Tenslotte pipet 100 ul elk putje in een 96-well plaat en optisch lees goed bij 570 nm met een plaatlezer zoals SPECTROstar Nano plaatlezer.

3. Nanodeeltjes bijgestaan ​​RF-geïnduceerde Hyperthermie: In vivo studies

1. Deze in vivo onderzoeken kunnen worden toegepast op elk type van kanker dat vaste tumoren vormen in een orthotope of ectopische muizenmodel. Dit experiment maakt gebruik Hep3B leverkanker cellen in een buitenbaarmoederlijke tumor BALB-C Naakt muismodel.
2. Let op: alle in vivo experimenten worden uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante richtlijnen, verordeningen en regelgevende instanties. Ook het protocol gedemonstreerd werd uitgevoerd onder de leiding en goedkeuring van de Universiteit van Texas MD Anderson Cancer Centers Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC).
   1. Kweek een geschikt aantal cellen (-100 k) in een weefselkweek kolf met het geschikte groeimedium. Incubeer in een 37 ° C incubator met 5% _CO2 gedurende de duur van celkweek.
   2. Behandel de cellen met trypsine (los te maken van de kolf) en produceren een oplossing van 2 miljoen cellen per 25 ul. Voeg een gelijk hoeveelheid Matrigel (op ijs) en meng de laatste injectie te bereiden. Injecteer deze oplossing in de gewenste positie op de rug van de muis en wacht een geschikte hoeveelheid tijd voor de tumoren groeien tot de gewenste grootte (2-4 weken meeste cellen). Voordat RF-blootstelling, moet BALB-C Naakt muizen solide buitenbaarmoederlijke tumoren dragen 0,5-1 cm diameter.
3. 1. Bereid de muizen te gebruiken (in dit geval BALB-C muizen Naakt) door anaesthetizing ze met een oplossing van ketamine en xylazine door IP injectie. Terwijl de muizen in slaap vallen, bewaar ze in een temperatuur gecontroleerde kamer bij 37 ° C. 20 muizen in totaal nodig zijn, allemaal met vergelijkbare grootte tumoren. Tien muizen worden gebruikt in combinatie met en zonder AuNPs (waarbij de laatste alleen PBS injecties) terwijl de resterende 10 muizen worden verdeeld RF-blootgestelde en niet-blootgestelde controles RF: beide groepen zonder AUNP injecties.
   2. Eenmaal goed verdoofd, injecteer de AuNPs rechtstreeks in de tumor met behulp van een 1-cc spuit met een 27 G naald. De AUNP oplossing moet op een Au concentratie van 200 mg / L in 0,1 ml PBS. Na injectie, gebruik dan een chirurgische wattenstaafje om bloed te absorberen en veeg de injectieplaats met een alcoholdoekje.
   3. Monteer vervolgens de muis te behandelen op het ontvangende hoofd van de RF-generator. De muis moet worden geplaatst dat de tumor dichtst bij de transmissie weg. Scherm de gebieden die niet worden behandeld, evenals sensitief gebieden zoals ogen, oren en tenen, met kopertape. Zorg ervoor dat de koperen band de juiste wijze is met de aarding vliegtuig zodat kosteloos opbouw plaatsvindt. Ook moet het belichtingsgebied een ruimte van minstens 1 cm groter dan de grootte van de gewenste behandelingsplaats hebben.
   4. Positie IR thermische camera zodat de tumor en de behandeling gebied zichtbaar zijn. Schakel RF gedurende 5 minuten. Noteer de resulterende temperatuur curve. Als therapie bereikt temperaturen hoger dan 42 ° C stop behandeling onmiddellijk.
4. 1. Na blootstelling aan RF herstellen van de muizen uit narcose in een warme kamer, totdat ze zich bewust zijn.
   2. Herhaal het experiment met dezelfde muizen 48 uur later (stap 3.3.1 - 3.4.1).
   3. Na het experiment euthanaseren de muizen in overeenstemming met de institutionele protocollen en procedures. Noteer het gewicht van de tumor. Voor histologische analyse bevestig de tumoren met behulp van formaline en insluiten in paraffine. Tumorsecties zijn meestal gekleurd with hematoxyline en eosine en voor de doelstellingen om het meten van de therapeutische werkzaamheid, bijvoorbeeld Ki-67 relevant, gesplitst caspase-3, enz.

Resultaten

1. Het beoordelen van RF verwarming van NP colloïden: AuNPs als voorbeeld.

Na volgende paragraaf 1.1 - 1.2.3 verwachten dat een sterk geconcentreerde, stabiele en gezuiverde oplossing van 5 nm en 10 nm diameter AuNPs hebben. Van de 500 ml als ingekocht voorraadoplossing, zal minimaal 4 ml oplossing te verkrijgen met een concentratie van 1000 mg / L. Het verschil in uren tussen de AuNPs en achtergrond DI water bufferoplossing bij deze concentratie dient -0,25 ° C / s en 0,1 ° C / sec 5 nm en 10 ...

Discussie

Deze protocollen kan de experimentator volledig geanalyseerd in hoeverre nanomaterialen (in dit geval AuNPs) kan RF-hyperthermie behandeling van kanker te verhogen. Het eerste protocol specifiek bezighoudt met het analyseren van de productie van warmte uit zeer geconcentreerd en gezuiverd AUNP monsters. Hoewel andere groepen warmteproductie hebben gemeld hoofdzakelijk van de buffers die de AuNPs gesuspendeerd in en niet AuNPs zelf ^9-11, de RF systemen lagere concentraties AuNPs met een diameter> 10 nm, als...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Reagens/Materiaal
500 ml gouden nanodeeltjes (5 nm)	Ted Pella, INC	15702-5
Amicon Ultra-4/-15 Centrifugeerfilters (50 kDa)	Millipore	UFC805024/UFC910096	(4 ml en 15 ml volumes)
MEM X1 Celkweekmedium	Cellgro	10-101-CV	(voeg extra voedingsstoffen toe indien nodig)
Foetaal runderserum	Sigma	F4135-500 ml
Kopertape	Ted Pella	16072
Apparatuur
Kanzius RF-systeem (13,56 MHZ)	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, VS)
IR-camera	FLIR SC 6000, FLIR Systems, Inc. (Boston, MA, VS)	Neem contact op met FLIR
1,3 ml Kwartscuvet	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, VS)
Teflon monsterhouder met draaitafel	ThermMed, LLC, Inc. (Erie, PA, VS)
SPECTROstar Nano Microplate reader	BGM Labtech
UV-Vis spectrometer	Applied Nanofluorescence, Houston, TX)	NS1 NanoSpectralyzer
ICP-–S	PerkinElmer	Optima 4300 DV
ZetaSizer	Malvern	Zen 3600 ZetaSizer