Air Filter apparaten Inclusief geweven Netten van Electrospun Recombinant Spider Silk Eiwitten

Samenvatting

Spinnenzijde vezels geven buitengewone mechanische eigenschappen. Engineered Araneus diadematus Fibroin 4 (eADF4) kunnen worden verwerkt tot geweven mazen met electrospinning. Hier worden de eADF4 geweven mazen gebruikt om de prestaties van de lucht filteren van apparaten te verbeteren.

Samenvatting

Op basis van de natuurlijke opeenvolging van Araneus diadematus Fibroin 4 (ADF 4), de recombinante spinzijde eiwit eADF4 (C16) is ontwikkeld. Deze zeer repetitieve eiwit heeft een molecuulgewicht van 48kDa en is oplosbaar in verschillende oplosmiddelen (hexafluorisopropanol (HFIP), mierenzuur en waterige buffers). eADF4 (C16) een groot potentieel voor diverse technische toepassingen wanneer verwerkt tot morfologieën zoals films, capsules, deeltjes, hydrogels, bekledingen, vezels en niet-geweven mazen. Vanwege hun chemische stabiliteit en gecontroleerde morfologie, kan deze worden gebruikt om filtermaterialen verbeteren. In dit protocol presenteren we een procedure om de efficiëntie van verschillende luchtfilter inrichtingen verbeteren, door afzetting van geweven mazen van electrospun recombinante spinnenzijde-eiwitten. Elektrospinnen van eADF4 (C16) opgelost in HFIP resulteert in vloeiende vezels. Variatie van de eiwitconcentratie (5-25% g / v) leidt tot verschillende vezeldiameter (80-1,100 nm) enaldus poriegrootten van het niet-geweven maas.

Nabehandeling van eADF4 (C16) electrospun van HFIP noodzakelijk aangezien het eiwit wordt een overwegend α-helix secundaire structuur in vers gesponnen vezels en de vezels zijn daarom wateroplosbaar. Daaropvolgende behandeling met ethanol damp induceert vorming van waterbestendig, stabiele β-sheet structuur, het behoud van de morfologie van de zijde vezels en mazen. Secundaire structuur analyse werd uitgevoerd met Fourier transform infraroodspectroscopie (FTIR) en vervolgens Fourier zelf deconvolutie (FSD).

Het primaire doel was het filterrendement van bestaande filter substraten verbeterd door toevoeging zijde geweven lagen geplaatst. Om de invloed van electrospinning duur en dus nonwoven laagdikte op filterrendement evalueren we luchtdoorlaatbaarheid tests in combinatie met deeltjes depositiemetingen. De experimenten werden uitgevoerd volgens standaardprotocols.

Inleiding

Door de combinatie van sterkte en rekbaarheid, kan spinnenzijde vezels meer kinetische energie absorberen dan andere natuurlijke of synthetische vezels ^1. Bovendien, anders dan de meeste synthetische polymeermaterialen zijde materialen zijn niet-toxisch en biologisch compatibel en veroorzaken geen allergische reactie wanneer geïncorporeerd ^2,3. Vermeende gezondheidsrisico's kunnen worden voorkomen door het gebruik van spinrag. Deze eigenschappen maken spinzijde zeer aantrekkelijk voor een verscheidenheid van medische en technische toepassingen. Omdat spinnen niet kan worden gekweekt vanwege hun kannibalistische gedrag, zijn biotechnologische methoden ontwikkeld om spindraad eiwitten te produceren, zowel de kosten-efficiënt en in voldoende hoeveelheden ^4.

De recombinante zijdeproteïne eADF4 (C16) is ontworpen op basis van de natuurlijke opeenvolging van Araneus diadematus Fibroin 4 (ADF 4). eADF4 (C16) heeft een molecuulgewicht van 48kDa ⁵ en oplosbaar is in diverse oplosmiddelen (hexafluoroisopropanol (HFIP) ^6, mierenzuur ⁷ en waterige buffers) ^8. eADF4 (C16) kunnen worden verwerkt tot verschillende morfologieën zoals films ^9, capsules ^8, deeltjes ^10, hydrogels ^11, bekledingen ^{7, 12} vezels en nonwoven mazen ^6. Door hun chemische stabiliteit, de laatste in een hoog potentieel in filter toepassingen.

Hier presenteren we een protocol om luchtfilter apparaten, waaronder een niet-geweven gaas van electrospun recombinante spindraad eiwitten te fabriceren. Electrospinning of elektrostatische spinning is een techniek die karakteristiek is voor het produceren van polymeervezels met diameters in het bereik van 10 nm -10 urn ¹³ en geweven mazen reeds onderzocht voor filtertoepassingen ^14. In het verleden electrospinning is met succes toegepast voor de verwerking van geregenereerde ¹⁵ en recombinant geproduceerde ¹⁶ spinzijdeeiwitten. Typisch een hoog elektrisch voltage (5-30 kV) wordt aangebracht op een spuit en een tegenelektrode (0-20 kV) geplaatst op een afstand van 8-20 cm. De sterke elektrostatische veld induceert afstotende krachten binnen de opgeladen oplossing. Indien de oppervlaktespanning wordt overschreden, wordt een Taylor kegel gevormd, en een dunne straal barst van de punt ^17,18. Na het vormen, buigen instabiliteiten optreden binnen de straal veroorzaakt verder te strekken als het oplosmiddel verdampt en een vaste vezel gevormd. Tenslotte wordt de vezel willekeurig afgezet op de tegenelektrode als een niet-geweven gaas ^19. Fiber eigenschappen zoals diameter en oppervlakte topologie (glad, poreus) zijn voornamelijk afhankelijk oplossing parameters zoals de concentratie, viscositeit, oppervlakte-energie en intrinsieke elektrische geleidbaarheid van het oplosmiddel en permeabiliteit ^20. Elektrospinning van eADF4 (C16) opgelost in HFIP resulteert in gladde vezels met diameters van 80-1,100 nm afhankelijk van de eiwitconcentratie in de oplossing.eADF4 (C16) electrospun uit HFIP toont een overwegend α-helix secundaire structuur en de vezels zijn in water oplosbaar ^6. Om de zijde vezels stabiliseren, β-sheet structuren worden geïnduceerd door daaropvolgende behandeling met ethanol. In tegenstelling tot eerder vastgestelde nabehandeling methoden ^21, in deze studie eADF4 (C16) nonwovens zijn behandeld met ethanol damp om de morfologie van de zijde vezels behouden. Secundaire structuur analyse werd uitgevoerd met Fourier transform infraroodspectroscopie (FTIR) en vervolgens Fourier zelf deconvolutie (FSD) zoals beschreven in de literatuur ^22. FSD is een signaal-processing tool waarmee resolutie van FTIR spectra uit meer overlappende bands. Daardoor kan de onduidelijke banden van het brede midden van I-regio worden verkleind met behulp van een high-pass filter om een ​​gedeconvolueerde spectrum te ontvangen met een verbeterde peak resoluties.

Om de eff evaluereniciency filter substraten aangevuld met zijden geweven mazen werden luchtdoorlaatbaarheid proef volgens een Akustron inrichting volgens standaardprotocollen. Deposities werden gemeten met behulp van een Palas universele deeltje sizer.

Protocol

1. Spinning Dope Voorbereiding

1. Neem gevriesdroogd eADF4 (C16) eiwit.
2. Weeg 20 mg eADF4 (C16) in een 1 ml reactievat met een hoge precisie schaal.
3. Voeg 200 ul van hexafluorisopropanol (HFIP) en sluit het vat met Parafilm.
   Opmerking: HFIP is zeer volatiel en schadelijk. Als het schade kan veroorzaken in de luchtwegen, werken onder een beschermkap, pipet voorzichtig, en de dop van de buis.
4. Vortex de suspensie voor 1 min en verder schud om de oplossing te wissen. Om ervoor te zorgen, dat de gehele hoeveelheid eiwit volledig is opgelost, wacht gedurende de nacht.

2. Electrospinning

1. Bereid de electrospinning (figuur 1) plaats het filtermateriaal boven de tegenelektrode en de ingestelde spanning van de beide elektroden (-22.5 kV) en de tegenelektrode (2,5 kV). Stel de volumestroom tot 315 ul / uur.
   Opmerking: while electrospinning, giftige HFIP wordt verdampt. Zorg ervoor dat uw electrospinning apparaat is aangesloten op een zuurkast.
2. Neem een ​​commercieel verkrijgbaar 20 G naald en slijp de scherpe punt met een hand slijpmachine om een ​​resterende lengte van 30 mm. Sluit de naald naar een 1 ml spuit.
   Opmerking: Een vliegtuig naaldpunt nodig om een goed gedefinieerde Taylor kegel genereren.
3. Laad de gehele spinnen dope (200 pi) in de spuit. Overlay de dope met 100 ul van lucht, zodat de complete oplossing te extruderen tijdens het spinproces.
   Opmerking: Om te voorkomen dat verstopping van de naald, zorg ervoor dat er geen deeltjes (aggregaten of verontreinigingen) in het spinnen dope. Werken onder een zuurkast!
4. Bevestig de gevulde spuit naar de injectiepomp van de electrospinning apparaat en druk voorzichtig op de zuiger op de spuit totdat er een druppeltje verschijnt aan het uiteinde van de naald. Vergrendelen de zuiger.
5. Stel de afstandtussen de punt van de naald en de contra-elektrode aan 8-20 cm.
6. Start de spuit pomp en verwijder de (meestal uitgedroogd) druppel uit de opening van de naald. Activeer alle veiligheidsinstallaties van het electrospinning apparaat onmiddellijk uit en start de hoge spanningsbron zodra een nieuwe druppel verschijnt. Elektrospinning van de spinnen dope zal vervolgens starten. Gebruik een stopwatch om draaiende duration te beheren.
   Opmerking: Om uitdrogen te voorkomen van de oplossing en daardoor verstopping van de naald, moet onmiddellijk beginnen het spinproces na het verwijderen van de gedroogde druppel.
7. Aangezien elektrospinning van recombinante eiwitten spinzijde afhankelijk luchtvochtigheid en temperatuur, kan een aanpassing van de procesparameters op de individuele lab condities noodzakelijk zijn (Figuur 2).
   Opmerking: Om de druppel niet uitdroogt (Figuur 2B) in staat een voldoende debiet. Als er een lage humidity in de omringende atmosfeer, passen de relatieve vochtigheid of verhoging van het debiet. Verlaag de spanning tot een goede Taylor kegel optreedt (Figuur 2A). Als er geen oplossing aan het uiteinde (figuur 2C), verhoging van de stroomsnelheid en laat de spanning totdat een druppel optreedt. Passen dan spanning om een regelmatige en stabiele Taylor Cone (Figuur 2A) vast te stellen.
8. Na 30 sec / 60 sec / 90 sec van electrospinning schakelaar van de injectiepomp. Om de dalende druppeltjes te voorkomen, wacht 10 seconden voor het uitschakelen van de hoogspanning bron naar de resterende druk in de spuit los.
9. Stappen 6-8 worden uitgevoerd op verschillende filtermaterialen, zoals polyamide, polypropyleen en polyester geweven mazen, maar ook zwart papier voor vergelijking.
10. Om een ​​niet-geweven gaas voor latere stabiliteit experimenten produceren, gebruiken zwart papier in plaats van filtermateriaal en de stappen 5 tot 7. Na 5 min van electrospinning, stopde werkwijze beschreven in stap 8.

3. Nabehandeling van zijde geweven Netten

1. Verwarm de oven tot 60 ° C.
2. Plaats het filter substraten met eADF4 (C16) geweven mazen verticaal en met een minimale afstand van 2 cm in een glazen afsluitbare container. De houder moet twee openingen die worden gebruikt voor ethanol en water vervolgens introduceren.
   Opmerking: Bij de vaststelling van de filtermaterialen, zorg ervoor dat het gebied nodig is voor permeabiliteit experimenten niet wordt beschadigd door de klemmen.
3. Verbind twee 60 ml spuiten, een gevuld met ethanol en een gevuld met water, met silicone buizen wijst in het inwendige bodem van de nabehandeling container (figuur 3).
   Opmerking: Om in staat om de vloeistof uit de houder na de behandeling verwijderd, plaats de openingen van de leidingen zo dicht mogelijk bij de bodem.
4. Plaats de nabehandeling container in de ovnl en voeg 60 ml ethanol door het extruderen van de spuit. Gebruik een stopwatch om behandelingsduur beheersen.
5. Na 90 min van ethanol damp behandeling, verwijder de ethanol met de spuit van het glas, en voeg 60 ml water uit de tweede spuit.
6. Wachten op een andere 90 min, verwijder dan het water en schakel de oven. Om druppeltjes voorkomen door condensatie, laat de container in de oven totdat deze volledig is afgekoeld.

4. Analyse van Spider Silk geweven Netten

1. Bereid de zijde geweven mazen voor stabiliteitstests op zwart papier of andere verwijderbare steun. Snij twee frames van karton en pas dubbel-kleverige plakband. Druk op een frame op de zijde geweven gaas afgezet op zwart papier en gebruik een scalpel af te snijden het overtollige van zijde vezels (houd de overtollige vezels voor volgende SEM-imaging). Verwijder het frame zorgvuldig om de niet-geweven losmaken van het papier. Herhaal deze stap voor het tweede frame(Figuur 4).
2. Praktische dip-test: Knip een stuk (1 cm ²⁾ van elk, de post-behandelde en niet-behandelde zijde geweven gaas en dompel het in gedemineraliseerd water. De niet-behandelde zijde geweven gaas onmiddellijk oplossen, terwijl de behandelde geweven gaas stabiel zijn (figuur 5). Na het dompelen, drogen de gedimde monster en bereiden het voor SEM beeldvorming.
3. Fourier transform infrarood spectroscopie (FTIR)-metingen en de daaropvolgende Fourier self-deconvolution (FSD): Om informatie over de structurele veranderingen van de zijde-eiwitten bij nabehandeling van de niet-geweven mazen te krijgen, kan FTIR worden toegepast met behulp van de parameters: Transmissie -modus, scannen van 800 tot 4000 cm ^-1, worden 60 ophopingen gemeten en gemiddeld voor elk spectrum, wordt een verwijzing gemeten per spectrum. Voor kwantitatieve analyse van de gegevens kan worden toegepast FSD (Figuur 6 en Figuur 7). Daarbij worden de curves gereduceerd tot de gegevens area tussen 1590 en 1705 ^cm-1 en een basislijn correctie wordt uitgevoerd. Een lokale minste kwadraten berekend volgens de piekposities uit eerdere studies (1611, 1619, 1624, 1630, 1640, 1650, 1659, 1666, 1680, 1691, 1698 cm ^{-1) 22.}
4. SEM beeldvorming: SEM kan op vezeldiameter en de morfologie van zijde vezels op verschillende filter substraten te onderzoeken en de invloed van de nabehandeling analyseren de vezel morfologie (figuur 8). Gebruik vergrotingen van 5.000 x 25.000 x om voldoende gedetailleerde beelden te krijgen.

5. Bepaling van Luchtdoorlaatbaarheid

1. Plaats een juiste montage deel van het filter materiaal op het gebied van het meten van een Akustron luchtdoorlatendheid apparaat. Opmerking :: Als u een ander type luchtdoorlatendheid apparaat gebruikt, zorg ervoor dat het voldoet aan de eisen van DIN 53 887, DIN 53 120, ISO 9237 en ASTM D 737-96 normen.
2. Gebruik van een Akustron luchtdoorlaatbaarheid inrichting (of een ander zoals afgebeeld in 5.1). Eventueel berekenen genormeerde data [l / ^(m2 x sec)].
3. Herhaal stap 1 en 2 minstens 10 keer met verschillende onderdelen van uw monster en berekent het rekenkundig midden (figuur 9).
   Opmerking: Het meten van luchtdoorlatendheid contact van het apparaat en de niet-geweven gaas nodig. Dus een zorgvuldige behandeling van de monsters is essentieel om breuk van de gevoelige zijde geweven gaas voorkomen.

6. Bepaling van de Filter Efficiency

1. Gebruik een goede machine met drukregeling en deeltjesteller, zoals een Universele deeltje sizer (Palas GmbH, Karlsruhe, D).
2. Plaats het filter monsters in het apparaat en meet partikelretentie (Figuur 10). Aërosol: Di-ethyl-hexyl-sebacat (DEHS); deeltjesgrootte: 0,3-3 micrometer; duur: 30 sec; vloeistof snelheid: 2350 cm / sec; luchtstroom: 3400 m ³ / uur.
   Let op: Behandel het monster voorzichtig en raak het oppervlak tot de vernietiging van de niet-geweven gaas te voorkomen en te voorkomen dat de verontreiniging niet aan. Zorg dat er voldoende monsters van gelijke kwaliteit te creëren voor prestatiemetingen.

Resultaten

Elektrospinning van recombinante spinnenzijde met concentraties van 10% w / v van HFIP resulteerde in gladde vezels met een diameter van 80 tot 120 nm, wat de vorming van niet-geweven mazen. Nabehandeling met ethanol damp niet tot opvallende morfologische veranderingen die derhalve vastgesteld als een juiste manier van zijde nonwoven nabehandeling (figuur 8). Structurele veranderingen werden gedetecteerd met behulp van FT-IR en daaropvolgende FSD midden van I banden werd uitgevoerd om tegenprestatie pieken (figuur 6) geanalyseerd. Het kan worden aangetoond dat een nabehandeling leidt tot een toename van β-sheet structuren, terwijl het gehalte aan α-helische und random coil structuren af (Figuur 7). Dit resultaat kan praktisch worden bewezen door dippen nabehandelde geweven in water (figuur 5). Zelfs na een week worden geen oplossing van het niet-geweven gaas voorkomen.

De spinnen durantsoen is de belangrijkste parameter voor de toepassing van zijde nonwovens in filtermaterialen door de drukval op basis van de toenemende dichtheid van electrospun vezels. Uitgebreide spinning lengtes und dus een groter aantal vezellagen resulteren in een exponentiële afname van luchtdoorlaatbaarheid. Dit effect kan worden waargenomen voor alle verschillende filtersubstraat materialen voor en na de nabehandeling (figuur 9). Ook de filterefficiëntie van de zijde bevattende filtermaterialen van sub-micrometer deeltjes toeneemt (figuur 10). Terwijl de korte spinnen looptijden (30 sec) te krijgen low filter efficiency, hogere spinnen duur (90 sec) leiden tot hogere rendementen.

Figuur 1. Hoge elektrische spanning (0-30 kV) i s aangebracht op een spuit gevuld met een zijden oplossing en een tegenelektrode (0-20 kV) is geplaatst op een afstand van 8-20 cm. Deze opzet leidt tot een sterk elektrostatisch veld, het induceren van afstotende krachten binnen de in rekening gebrachte oplossing. Indien de oppervlaktespanning wordt overschreden, wordt een Taylor kegel gevormd, en een dunne straal barst van de punt. Na het vormen, buigen instabiliteiten optreden binnen de straal veroorzaakt verder te strekken als het oplosmiddel verdampt en een vaste vezel gevormd. Tenslotte wordt de vezel willekeurig afgezet op de tegenelektrode in de vorm van een geweven maas.

Figuur 2. Foto's van een reguliere Taylor kegel (A), een gedroogde druppel (B), en de setup zonder druppel (C).

iles/ftp_upload/50492/50492fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50492/50492fig3.jpg "/>
Figuur 3. Schematische voorstelling tijdens damp nabehandeling. In de eerste stap wordt de kamer gevuld met ethanol, en het monster gestoomd bij 60 ° C gedurende 90 minuten. Om de niet-geweven mazen voor daaropvolgende behandeling verzachten, wordt ethanol verwijderd en de vezels worden gestoomd met waterdamp gedurende 90 min bij 60 ° C. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 4. Foto van een kartonnen frame met aangehechte zijde geweven mazen worden gebruikt voor nabehandeling.

Figuur 5. Electrospun en vervolgens nabehandeld geweven in droge toestand (A) en onder water (B).

Figuur 6. Fourier zelf gedeconvolueerde absorptiespectrum van een amide I band van een onbehandeld (A) en een post-behandelde (B) spinnenzijde geweven mesh. De doorgetrokken lijn geeft de absorptie band als gevolg van de financiële tegenprestatie pieken (gestippelde lijnen) zoals afgeleid na deconvolutie. De toewijzing van de respectieve curves was gebaseerd op eerder gepubliceerde waarden uit de literatuur ^22. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

t-width = "5in" fo: src = "/ files/ftp_upload/50492/50492fig7highres.jpg" src = "/ files/ftp_upload/50492/50492fig7.jpg" />
Figuur 7. Secundaire structuur gehalte niet-behandelde en nabehandeld eADF4 (C16) geweven mazen.

SEM beelden figuur 8 van electrospun eADF4 (C16)-vezels op verschillende filter substraten:. Polyamide (PA), Polyester (PE), polypropyleen (PP) en zuiver eADF4 (C16) vezels voor (S1) en na (S2) post- behandeling met ethanol damp. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

/ Ftp_upload/50492/50492fig9.jpg "/>
Figuur 9. Luchtdoorlaatbaarheid testen, alvorens (A) en na post-behandeling (B) van de zijde geweven mazen met ethanol damp, het verhogen van spinnen tijden leiden tot meer niet-geweven lagen vervolgens verlagen van de luchtdoorlatendheid.

Figuur 10. Filterrendement van di-ethyl-hexyl-sebacat aerosol op electrospun spindraad geweven mazen op polyamidefilter materialen op verschillende spinnen duur, het beïnvloeden van de zijde layer hoeveelheid, na post-behandeling met ethanol.

Discussie

Nieuwe filter apparaten moet het mogelijk maken het verlagen van het totale energieverbruik in luchtfiltratie bij constante of hoger filter efficiëntie. Hier, dergelijke apparaten werden gemaakt met behulp van non-wovens gemaakt van spindraad. Door zijn lage oppervlaktespanning en een hoge volatiliteit, is HFIP is gekozen als een geschikt oplosmiddel voor het elektrospinproces. Bovendien zijn waterige oplossingen zijde besproken in eerdere experimenten getest, maar geen vezels kunnen worden gegenereerd. Hier zou het cruciaal om additieven te gebruiken om de oppervlaktespanning te verlagen en daardoor het spinnen eigenschappen van de oplossing te verbeteren. De meest cruciale stap is om de voorwaarden en het gebruikte materiaal concentratie en oplosmiddel van de spinoplossing passen, spinnen hoogte, spanning en extrusie snelheid. Tijdens de uitvoering, bijvoorbeeld verstopping van de tip kan worden voorkomen door in de naaldpunt met vocht in de vorm van waterdamp, maar elke vorm van toevoegingen in de electrospinning setup later kan verstorenhet gevoelig proces en elektrische velden. Essentieel proces parameters (concentratie, spanning, afstand, vochtigheid) werden individueel bepaald het uitvoeren van afzonderlijke experimentele serie (gegevens niet getoond). Het nemen van alle parameters in overweging is het cruciaal om te zorgen voor een continue taylor kegel en spinnen proces om uniforme vezels creëren.

Het filterrendement is een van de belangrijkste parameters van filtermaterialen. Deze parameter wordt hoofdzakelijk beïnvloed door de structuur van het filtermateriaal. Wovens erven uniforme poriegrootte en vervolgens consequent luchtdoorlatendheid. Het is cruciaal om homogeen geweven mazen in de volgende sjabloon materialen te creëren om de poriën te vullen en een zero-defect filter genereren. Het filterrendement in onze filters laat de directe afhankelijkheid spinnen duur (van de zijde eiwitten), en derhalve het aantal geweven mesh lagen. De openingen tussen enkelvoudige vezels worden consequent gevuld, waardoor de retentie of kleinere deeltjes.

In dit werk introduceerde we een methode om een ​​nieuw filtermateriaal met spinrag geweven mazen produceren, tonen een hoge filter efficiëntie. Daarom zijn deze filters zijn veelbelovende kandidaten voor toekomstig gebruik in luchtfiltratiesystemen.