Methodenartikel

Een gevoelige methode om Senescent kankercellen kwantificeren

DOI:

10.3791/50494

⸱

2 augustus 2013

 , 
1MILPAT (EA 4652), Université de Caen Basse-Normandie

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Of veroudering voorkomt of bevordert het ontstaan ​​van tumoren blijft controversieel. Sinds chemotherapeutische drugs kankercellen ertoe kunnen bewegen senesce, studeren veroudering is essentieel voor het voorstellen van nieuwe therapieën. De standaard en breed gebruikt β-galactosidase test geeft belangrijke nadelen. We stellen hier een snelle en gevoelige flowcytometrie gebaseerde bepaling senescentie kwantificeren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menselijke cellen niet onbeperkt vermenigvuldigen. Bij externe en / of extrinsieke factoren, kan cellen sterven of voer een stabiele celcyclus genoemd senescentie. Verschillende cellulaire mechanismen, zoals telomere verkorting en abnormale expressie van oncogenen mitogene, is aangetoond dat veroudering veroorzaken. Senescentie is niet beperkt tot normale cellen, kankercellen ook gerapporteerd senesce.

Chemotherapeutische geneesmiddelen is aangetoond senescentie induceren in kankercellen. Het blijft echter controversieel of veroudering voorkomt of bevordert het ontstaan ​​van tumoren. Omdat het uiteindelijk misschien patiëntspecifieke, zal een snelle en gevoelige methode voor senescentie in kankercel beoordelen binnenkort nodig.

Daartoe de standaard β-galactosidase assay, de gebruikelijke methode nog voor grote nadelen: het is tijdrovend en ongevoelig. We stellen hier een doorstroomcytometrie-gebaseerde test senescentie op li bestuderenve cellen. Deze test heeft het voordeel dat snelle, gevoelige, en kan worden gekoppeld met de immunokleuring van verschillende cellulaire markers.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinds begin jaren zestig en de ontdekking door Hayflick en Moorhead, veroudering blijft een cellulair nieuwsgierigheid 1. Menselijke cellen niet onbeperkt groeien en, door veroudering, Hayflick en Moorhead bedacht de cellulaire proces van veroudering. Senescentie is een stabiel celcyclus waarbij cellen metabool actief blijven in tegenstelling tot celdood. Tot op heden hebben vier cellulaire mechanismen aangetoond dat veroudering veroorzaken: telomeerverkorting, DNA-schade, chromatine verstoring, en abnormale expressie van mitogene oncogenen 2. Dit geeft aan dat niet alleen normale cellen maar ook kankercellen kunnen ondergaan senescentie 3. Als een zaak van de feiten, werden kankercellen ondergaan veroudering aangetoond dat een barrière voor verdere progressie van de tumor 4-5 vormen. Toch hebben verschillende rapporten nu op gewezen dat, onder bepaalde omstandigheden, kan cellulaire veroudering ook bevorderen maligniteit 6-7. Studeren veroudering van kanker cells is ongeveer om een drang in kankeronderzoek zoals momenteel gebruikte chemotherapeutische geneesmiddelen kan leiden tot veroudering van kankercellen niet alleen in vitro, maar ook in vivo 8 geworden.

De master assay te onderzoeken op de aanwezigheid van verouderde cellen is β-galactosidase assay bij zure pH. Dit histochemische test weerspiegelt de toegenomen lysosomale biogenese zich in de meeste verouderde cellen. Kort exogene X-gal, toegepast op cellen, wordt gesplitst door β-galactosidase verrijkt in lysosomen van verouderde cellen, waardoor een blauwe kleur 9. De blauwe verouderde cellen kunnen vervolgens worden gekwantificeerd onder een helder veld microscoop. Hoewel zeer populair, de β-galactosidase test geeft belangrijke nadelen. Eerst wordt deze test uitgevoerd op gefixeerde cellen. Ten tweede is tijdrovend omdat het impliceert de mate van senescentie kwantificeren door telling significant groot aantal verouderde cellen onder een microscoop. Ten derde, het assayis niet gevoelig als de discriminatie tussen verouderde en niet-verouderde cellen vertrouwt volledig op de waarnemer.

We bespreken hier een onontgonnen, snelle en gevoelige cytometrie-gebaseerde test om te beoordelen op de aanwezigheid van levende verouderde cellen. Deze test is gebaseerd op de hydrolyse van een doorlatend membraan molecuul, de 5-dodecanoylaminofluorescein di-β-D-galactopyranoside (FDG C 12), door β-galactosidase verrijkt in verouderde cellen. Na hydrolyse en laser excitatie, de C 12 FDG zendt groene fluorescentie en derhalve worden gedetecteerd door flow cytometrie 10, 11. De detectie van verouderde cellen via flowcytometrie biedt het grote voordeel dat snelle en gevoelige. Bovendien kan detectie van verouderde cellen door flowcytometrie worden gekoppeld aan de detectie van andere cellulaire markers. Deze test kan worden gebruikt om verouderde cellen te detecteren in een populatie van kankercellen behandeld met chemotherapie en kan routinematig wordenup op weefselcoupes, na cellulaire dissociatie, in de kliniek.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van C12FDG, bafilomycine A1 en Cultuur van de Cel

  1. Los de C 12 FDG poeder in dimethylsulfoxide (DMSO) tot een uiteindelijke concentratie van 20 mM. Aliquot en bewaar bij -20 ° C. DMSO moet worden gebruikt met de juiste veiligheidsvoorschriften.
  2. Los het poeder bafilomycine A1 in DMSO tot een uiteindelijke concentratie van 0,1 mM. Aliquot en bewaar bij - 20 ° C. Bafilomycine moet worden gebruikt met de juiste veiligheidsvoorschriften.
  3. Cultiveren RPMI 8226 cellijn of andere cellijnen hechtende of niet, in medium dat 10% foetaal runderserum en 1% antibiotica, bij 37 ° C, 5% CO2. Schat het aantal cellen nodig voor het experiment. Om een voldoende aantal gebeurtenissen vast tijdens de flowcytometrie-analyse, worden 5 x 10 5 cellen vereist. Om het percentage van verouderde cellen te bepalen, worden drie mobiele monsters vereist: unlabeled monster onbehandelde cellen gekleurd met C 12 FDG, behandelde cellen gekleurd metC 12 FDG.
  4. Zaad van de cellen 24 uur voorafgaande uitvoeren van de proef zodat cellen zijn in de log-fase van de cellulaire proliferatie curve.

2. Inductie van Senescentie

  1. Induceren senescentie van kankercellen door toevoeging van een chemotherapeutische middel. Geneesmiddelconcentratie en duur van de behandeling moeten worden afgestemd op het soort cel getest. Begin met een 48 uur behandeling in de uiteindelijke concentratie van 50 nM doxorubicine een concentratie van cellen op ongeveer 10 6 cellen / ml. Vergeet niet om onbehandelde monster bevatten (negatieve controle).

3. Bafilomycine A1 Behandeling

  1. Controleer cellevensvatbaarheid door het mengen cellen met trypan blauw (v / v), als chemotherapeutische geneesmiddel die in de vorige stap kan leiden tot apoptose. Vullen in een Malassez kamer en tel het aantal blauwe cellen (dode cellen) en witte bloedcellen (levende cellen). Indien het percentage van de levensvatbaarheid is minder dan 70%, zou dode cellen rem zijnoved met een geschikte kit om ervoor te zorgen dat de dode cellen zal niet vooringenomenheid de daaropvolgende analyse.
  2. Verwijder de cultuur media en vervangen door voorverwarmde verse voedingsbodems. Behandel de cellen met een uiteindelijke concentratie van 100 nM van bafilomycine A1. Bafilomycine A1 wordt gebruikt om de zure pH van lysosomen neutraliseren. Incubeer 1 uur bij 37 ° C, 5% CO2.

4. C 12 FDG kleuring

  1. Los C 12 FDG in voorverwarmde verse kweekmedia tot een eindconcentratie van 2 mM.
  2. Voeg de verbinding aan cellen in een eindconcentratie van 33 uM en incubeer 2 uur bij 37 ° C, 5% CO2. Bij gebruik van niet-hechtende cellen, de cellen gecentrifugeerd bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C (de snelheid zou moeten worden aangepast aan het gebruikte celtype), 2x wassen met PBS. Resuspendeer de celpellet in 500 ul koude PBS. Bij gebruik van hechtende cellen, verwijder de media en was 2x met PBS. Oogst de hechtende cellen met behulp van een trypsine-oplossing en centrifugecellen bij 300 g gedurende 5 min bij 4 ° C (de snelheid zou moeten worden aangepast aan het gebruikte celtype). Resuspendeer de celpellet in 500 ul koude PBS. In beide gevallen moet de celconcentratie ongeveer 10 6 cellen / ml.
  3. Voer een co-immunokleuring om verder te karakteriseren van de bevolking van verouderde cellen.

5. Flowcytometrieanalyse

  1. Kalibreer de flowcytometer met de controlekorrels aanbevolen door de fabrikant van de flowcytometer. Voor alle stappen, minstens 10 4 events moeten worden geregistreerd.
  2. Voer het eerste monster dat niet-gemerkte cellen. Bereid een twee-parameter grafische weergave Forward Scatter Channel (FSC) versus Side Scatter Channel (SSC). Stel de fotovermenigvuldigingsbuizen (PMT) en definiëren een van belang zonder dode cellen en celresten dat tijdens de monsterbereiding kunnen zijn verschenen. Gate deze regio van belang in een een-parameter histogram weergave VT1 op de log-schaalde x-as en het aantal gebeurtenissen in de y-as. Het totale aantal gebeurtenissen is het aantal geanalyseerde cellen. Stel de PMT zodat ongelabelde cellen worden weergegeven in de eerste tien op de log schaal van de x-as. Bepaal de autofluorescentie van de cellen indien nodig.
  3. Voer het tweede monster met onbehandelde cellen. Op de een-parameter histogram weergave FL1 (fluorescentie van C 12 FDG), plaatst u de cursor na de schaars label bevolking. Deze drempel zal het onderscheid tussen niet-verouderde cellen (slecht gelabelde cellen) en verouderde cellen (fel gelabelde cellen) toestaan.
  4. Voer het derde monster dat behandelde cellen. Helder gemerkte cellen, dwz verouderde cellen worden boven de drempelwaarde in het voorgaande stap. Evalueer het percentage van verouderde cellen door het aantal lichte events per het totale aantal gebeurtenissen. Indien nodig, kan de activiteit van de β-galactosidase worden geschat met behulp van de gemiddelde fluorescentieintensiteit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multiple Myeloma, een hematologische maligniteit, werd gebruikt om de senescentie geïnduceerd door chemotherapeutische methoden te beoordelen. Daartoe is een commercieel beschikbare MM cellijn (RPMI 8226) werd behandeld voor 2 dagen met doxorubicine, een chemotherapeutische geneesmiddelen. De cellen werden vervolgens onderworpen aan bafilomycine A1 behandeling en verder geïncubeerd met C 12 FDG. Cellen werden geanalyseerd door flow cytometrie. Figuur 1 toont de verschillende stappen en laat z...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We presenteerde hier een flowcytometrie-gebaseerde methode om cellulaire veroudering in levende kankercellen te kwantificeren. Deze methode is gebaseerd op het gebruik van het membraan permeabele stof, de C 12 FDG, en kan daarom worden gebruikt in een cel types en na verschillende behandelingen zolang de verbinding wordt opgenomen door de cellen. Bij cellulaire opname, de C 12 FDG gehydrolyseerd door β-galactosidase, verrijkt in lysosomen van verouderde cellen. Na laser excitatie, de verbinding zen...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de SF 4206 Icore (Universite de Caen) voor het gebruik van de cytometrie faciliteit. JC ontvangen post-doctorale beurzen van Conseil de radioprotectie d'EDF en de Conseil Regional van Basse-Normandie. Die gegevens waren onderdeel van gefinancierd door de Ligue Nationale contre le Cancer projecten - Comites de l'Orne et du Calvados.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5-dodecanoylaminofluorescein di-α-D-galactopyranosid InvitrogenD-2893
Dimethylsulfoxide SigmaD2650
Bafilomycin A1SigmaB1793
DoxorubicineSandoz
TrypaanblauwSigmaT8154
RPMI 1640 celkweekmediumLonzaBE12-702
Foetaal runder serumPAA Laboratories GmBHA15 101
AntibioticaGibco5290-018
Gallios flowcytometerBeckman CoulterA94291

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hayflick, L., Moorhead, P. S. The serial cultivation of human diploid cell strains. Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).
  2. Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nature Review Molecular Cell Biology. 8 (9), 729-740 (2007).
  3. Shay, J. W., Roninson, I. B. Hallmarks of senescence in carcinogenesis and cancer therapy. Oncogene. 23 (16), 2919-2933 (2004).
  4. Bartkova, J., Rezaei, N. Oncogene-induced senescence is part of the tumorigenesis barrier imposed by DNA damage checkpoints. Nature. 444 (7119), 633-637 (2006).
  5. Takacova, S., Slany, R., Bartkova, J., Stranecky, V., Dolezel, P., Luzna, P., et al. DNA damage response and inflammatory signaling limit the MLL-ENL-induced leukemogenesis in vivo. Cancer Cell. 21, 517-531 (2012).
  6. Krtolica, A., Parrinello, S., Lockett, S., Desprez, P. Y., Campisi, J. Senescent fibroblasts promote epithelial cell growth and tumorigenesis: a link between cancer and aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 98, 12072-12077 (2001).
  7. Coppe, J. P., Patil, C. K., Rodier, F., Sun, Y., Munoz, D. P., Goldstein, J., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6, 2853-2868 (2008).
  8. Roninson, I. B. Tumor cell senescence in cancer treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
  9. Dimri, G. P., Lee, X., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-937 (1995).
  10. Kurz, D. J., Decary, S., Hong, Y., Erusalimsky, J. D. Senescence-associated (beta)-galactosidase reflects an increase in lysosomal mass during replicative ageing of human endothelial cells. Journal of Cell Science. 113, 3613-3622 (2000).
  11. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  12. Cahu, J., Bustany, S., Sola, B. Senescence-associated secretory phenotype favors the emergence of cancer stem-like cells. Cell Death and Disease. Dec 20, 3-e446(2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Flowcytometrie assayC12 FDG substraatb ta galactosidase activiteitdoxorubicine behandelingfluorescentiekwantificeringcellevensvatbaarheidsanalyseimmunolabelingscontrolesscreening van chemotherapeutische geneesmiddelendetectiemethode voor senescentie

Gerelateerde artikelen