Method Article

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie: Een High Throughput kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interactie Studie

DOI:

10.3791/50529

⸱

August 15th, 2013

 , 
1Department of Pharmacology, University of Illinois at Chicago

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie biedt een hoge doorvoer kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Deze methodologie kan worden toegepast op mapping eiwitbindingsplaatsen en screenen factoren die eiwit-eiwit interactie te bepalen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Onder methodes om eiwit-eiwit interacties binnen cellen te bestuderen, Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) is relatief eenvoudig en gevoelig. BiFC is gebaseerd op de productie van fluorescentie met behulp van twee niet fluorescerende fragmenten van een fluorescent eiwit (Venus, een geel fluorescent eiwit variant wordt hier gebruikt). Niet-fluorescerende Venus fragmenten (VN en VC) gefuseerd aan twee interagerende proteïnen (in casu AKAP LBC-en PDE4D3), waardoor fluorescentie door VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 interactie en de vorming van een functioneel fluorescent eiwit in cellen.

BiFC geeft informatie over de subcellulaire lokalisatie van eiwitcomplexen en de kracht van eiwit interacties op basis van fluorescentie-intensiteit. Echter, BiFC microscopische analyse van de sterkte van eiwit-eiwit interacties te kwantificeren is tijdrovend en enigszins subjectief door heterogeniteit in eiwitexpressie en interactie. Door koppeling flowcytometrischeanalyse BiFC methodologie, kan het fluorescerende BiFC eiwit-eiwitinteractie signaal nauwkeurig worden bepaald voor een grote hoeveelheid cellen in een korte tijd. Hier tonen we een toepassing van deze methode in kaart regio's in PDE4D3 die nodig zijn voor de interactie met AKAP-LBC. Deze high throughput methode kan worden toegepast op screening factoren die eiwit-eiwit interactie te bepalen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

650,000 eiwit-eiwit interacties worden geraamd, dat in het menselijk interactome, spelen cruciale rol in het handhaven van normale celfuncties 1,2. Naast co-immunoprecipitatie (co-IP), de gouden standaard eiwit-eiwit interacties te bestuderen van cellysaat, verschillende eiwitbanden fragment complementatie bepalingen (PCA) zijn ontwikkeld om de gevoeligheid in het detecteren van eiwit-eiwit interacties binnen cellen 3 verbeteren. Technieken omvatten Förster-energieoverdracht (FRET), Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), en Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) 4,5. BiFC is gebaseerd op het vergemakkelijkt assoc....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Cell Transfectie

  1. Plaat cellen de dag voor transfectie, plating minder cellen voor immunofluorescentie.
    1. Voor immunofluorescentie: in een 6-wells plaat, jas glas dekglaasjes (1 per putje) met 0,02% gelatine bij 37 ° C gedurende ten minste 4 uur, een keer wassen met medium, en voor elk putje, plate 1 x 10 5 HEK 293T cellen in 2 ml compleet kweekmedium [Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) plus 10% FBS].
    2. Voor flowcytometrische en Western blot analyses: plate 1,2 x 10 5 HEK 293T cellen / putje in 2 ml compleet groeimedium in 6-well platen (0,3 x 10 5 HEK 293T-cellen in 0,5 ml compleet kwee....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AKAP-LBC en PDE4D3 constructies (Figuur 1B) werden gefuseerd met VN en VC fragmenten, respectievelijk. Interactie van AKAP-LBC en PDE4D3 resulteert in functionele YFP fluorescentie (Figuur 1A). Hier gebruiken we de BiFC methode om de kaart AKAP-LBC-bindingsplaatsen in PDE4D3. Upstream geconserveerd gebied 1 (UCR1) stroomopwaarts geconserveerde gebied 2 (UCR2) en katalytische gebied (CAT) zijn geconserveerd onder PDE4 familie eiwitten, is de volledige lengte (FL), UCR1 en UCR2 plus CAT w.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BiFC is een eenvoudige en gevoelige methode om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Deze werkwijze kan niet worden gebruikt om nieuwe eiwit-eiwit interacties te identificeren, maar het is vooral handig om eiwit-eiwit interacties binnen cellen bevestigen en functionele eigenschappen te bestuderen, zoals subcellulaire lokalisatie van eiwitcomplexen, in kaart brengen van eiwit-eiwit interactieplaatsen en voor het screenen van kleine moleculen / peptiden die eiwit-eiwit interacties kunnen moduleren. Omdat VN en VC fragmen.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken de O'Bryan lab bij UIC voor kritische experimentele evaluatie en discussie. Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association Grant 11SDG5230003 om GKC en National Center for Translational Science Vooruitgaan - UIC Centrum voor klinisch en translationeel Sciences Grant UL1TR000050.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM)Invitrogen11965-092
Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100xInvitrogen15070-063
Fetal Bovine Serum (FBS)Invitrogen16000-044
Anti-Flag antibodySigmaM2, F1804
Anti-HA antibodyCovance16B12, MMS-101R
α-tubulinSigmaDM1A, T9026
Anti-GFP antibodyClontech632569
Cell culture plates, 6-well tissue culture treatedThermo Fisher Scientific130184
HEK 293T cellsATCCCRL-11268
Maxiprep plasmid purification kit, high speedQiagen12663
Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), sterile 1xInvitrogen14190-144
Trypsin-EDTA, 0.05% (w/v)Gibco25300
Polystyrene round-bottom tubes for FACS stainingBD Biosciences352052
ParaformaldehydeFisher ScientificS74337MF
Prolong gold antifade reagent with DAPIInvitrogenP-36931
Superfrost plus Microscope slidesFisher Scientific12-550-15
Fisherfinest premium cover glassFisher Scientific12-548-5P
EQUIPMENT
CO2 air-jacketed IncubatorNuAIR DH autoflow
Confocal microscope LSM510 METACarl Zeiss, Inc
Electrophoresis and transfer unitBiorad
Cyan ADP Flow CytometerBeckman Coulter

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
  2. Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
  3. Shekhawat, S. S., Ghosh, I. ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Protein Protein InteractionBimolecular Fluorescence ComplementationFlow CytometryFluorescence IntensityHigh Throughput ScreeningVenus Fluorescent ProteinWestern BlotSubcellular LocalizationTransfection MethodMean Fluorescence Intensity

Related Articles