Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie biedt een hoge doorvoer kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Deze methodologie kan worden toegepast op mapping eiwitbindingsplaatsen en screenen factoren die eiwit-eiwit interactie te bepalen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Flowcytometrische analyse van Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie: Een High Throughput kwantitatieve methode om eiwit-eiwit interactie Studie
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Onder methodes om eiwit-eiwit interacties binnen cellen te bestuderen, Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) is relatief eenvoudig en gevoelig. BiFC is gebaseerd op de productie van fluorescentie met behulp van twee niet fluorescerende fragmenten van een fluorescent eiwit (Venus, een geel fluorescent eiwit variant wordt hier gebruikt). Niet-fluorescerende Venus fragmenten (VN en VC) gefuseerd aan twee interagerende proteïnen (in casu AKAP LBC-en PDE4D3), waardoor fluorescentie door VN-AKAP-LBC-VC-PDE4D3 interactie en de vorming van een functioneel fluorescent eiwit in cellen.
BiFC geeft informatie over de subcellulaire lokalisatie van eiwitcomplexen en de kracht van eiwit interacties op basis van fluorescentie-intensiteit. Echter, BiFC microscopische analyse van de sterkte van eiwit-eiwit interacties te kwantificeren is tijdrovend en enigszins subjectief door heterogeniteit in eiwitexpressie en interactie. Door koppeling flowcytometrischeanalyse BiFC methodologie, kan het fluorescerende BiFC eiwit-eiwitinteractie signaal nauwkeurig worden bepaald voor een grote hoeveelheid cellen in een korte tijd. Hier tonen we een toepassing van deze methode in kaart regio's in PDE4D3 die nodig zijn voor de interactie met AKAP-LBC. Deze high throughput methode kan worden toegepast op screening factoren die eiwit-eiwit interactie te bepalen.
Inleiding
650,000 eiwit-eiwit interacties worden geraamd, dat in het menselijk interactome, spelen cruciale rol in het handhaven van normale celfuncties 1,2. Naast co-immunoprecipitatie (co-IP), de gouden standaard eiwit-eiwit interacties te bestuderen van cellysaat, verschillende eiwitbanden fragment complementatie bepalingen (PCA) zijn ontwikkeld om de gevoeligheid in het detecteren van eiwit-eiwit interacties binnen cellen 3 verbeteren. Technieken omvatten Förster-energieoverdracht (FRET), Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET), en Bimoleculaire Fluorescentie Complementatie (BiFC) 4,5. BiFC is gebaseerd op het vergemakkelijkt associatie van twee fragmenten van een fluorescerend eiwit (hier gebruiken we Venus, een YFP variant) die elk worden gefuseerd aan een potentiële interactie eiwit partner (in dit voorbeeld gebruiken we AKAP LBC-en PDE4D3). Interactie van de twee eiwitten van belang in cellen resulteert in functionele fluorescentie, die gevisualiseerd door f kanluorescence microscopie met behulp van live of vaste cellen 6,7,8. Vergeleken met andere PCA's, BiFC is gevoelig en minder technisch uitdagend, met potentieel om de cellulaire lokalisatie in levende cellen te bestuderen. Een belangrijk nadeel van deze techniek is echter dat eenmaal gevormd, het fluorescerende eiwit complex kan niet worden omgekeerd. Daarom is het niet een goede methode om dynamische eiwit-eiwit interacties te bestuderen. In dit artikel gebruiken we BiFC om de interactie plaatsen van PDE4D3 kaart met AKAP-LBC door monitoring van de fluorescentie-intensiteiten van Venus. Vergeleken met traditionele analyse met fluorescentie microscopie, hetgeen tijdrovend en arbeidsintensief (indien niet uitgevoerd met behulp van geautomatiseerde high throughput machines), flowcytometrie biedt een eenvoudige kwantitatieve analyse van duizenden cellen in een heterogene populatie over een korte tijd 9, 10. Hier, door het uitvoeren van een side-by-side vergelijking van flowcytometrische analyse-BiFC en traditionele co-IP, tonen we aan dat de twee methoden bieden vergelijkbare gegevens echter flowcytometrische BiFC analyse is minder tijdrovend en gebruikt minder materiaal dat nuttiger kunnen zijn wanneer de cellen van belang zijn beperkt.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Cell Transfectie
- Plaat cellen de dag voor transfectie, plating minder cellen voor immunofluorescentie.
- Voor immunofluorescentie: in een 6-wells plaat, jas glas dekglaasjes (1 per putje) met 0,02% gelatine bij 37 ° C gedurende ten minste 4 uur, een keer wassen met medium, en voor elk putje, plate 1 x 10 5 HEK 293T cellen in 2 ml compleet kweekmedium [Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) plus 10% FBS].
- Voor flowcytometrische en Western blot analyses: plate 1,2 x 10 5 HEK 293T cellen / putje in 2 ml compleet groeimedium in 6-well platen (0,3 x 10 5 HEK 293T-cellen in 0,5 ml compleet kweekmedium per well in 24-well plaat ).
- Bereid DNA voor transfectie volgens proefopzet fabricage's: Effectene (Qiagen) wordt gebruikt voor immunofluorescentie. Transit-LT1 (Mirus) wordt gebruikt voor flowcytometrische en Western blot analyses. Hoeveelheid DNA gebruikt wordt hieronder vermeld.
Transfectie met Effectene (6-well):24-well plaat (ng) 6-well plaat (ng) CFP-vector 10 50 VN N-AKAP-LBC 200 1000 VC N-PDE4D3-FL (full-length PDE4D3) 2.5, 5, 10, 20, 40, 80 100 VC N-PDE4D3-UCR1 (a PDE4D3 N-terminaal fragment dat de UCR1 domein) 100 VC N-PDE4D3-UCR2 + CAT (een PDE4D3 C-terminale fragment dat de UCR2 en katalytische domeinen) 100 - Voeg aangegeven hoeveelheid plasmide-DNA + 4 ui enhancer aan 100 gl buffer EC, meng en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 5 ul Effectene, meng en incubeer gedurende 10 minuten bijkamertemperatuur. Voeg druppelsgewijze aan cellen.
- Voeg aangegeven hoeveelheid plasmide DNA μl/50 250 gl Opti-MEM I serumvrij medium in een steriele buis.
- Voeg transit-LT1 reagens om de verdunde DNA-mengsel en pipet voorzichtig te mengen. (Transit-LT1 Reagens: DNA-verhouding is 3 pi van doorvoer-LT1 reagens per 1 ug DNA).
- Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur en voeg druppelsgewijze aan cellen.
2. Cel Voorbereiding voor flowcytometrie, Western Blot en Immunofluorescentie
- 24 uur na transfectie, check fluorescentie onder epifluorescentiemicroscoop voor de oogst cellen.
- Celpreparaat voor flowcytometrische analyse:
- Was de cellen met 0,5 ml / 2 ml ijskoude PBS 24-well/6-well platen.
- Los cellen met behulp van 50 μl/250 pi 0,05% trypsine.
- Neutraliseer trypsine met 200 ul / 1 ml DMEM medium.
- Collect 250 ul cellen (voor 24 putjes en 6-wells plaat) door centrifugatie bij 500 xg gedurende 5 minuten, met de resterende cellen (1 ml) voor Western blot analyse.
- Resuspendeer cellen in 250 pi FACS buffer [PBS + 0,5% (w / v) BSA + 2 mM EDTA], opslag op ijs flowcytometrische analyse. Cellen kunnen ook in 1% paraformaldehyde vastgesteld (in PBS) als flowcytometrieanalyse zal niet onmiddellijk.
- Celpreparaat voor Western blot analyse: uitgevoerd in parallel met celpreparaten van flowcytometrie-analyse.
- Was de cellen met 1 x 2 ml ijskoude PBS, lyseren cellen door toevoeging van 100 ul lysis buffer [10 mM natriumfosfaatbuffer, pH 6,95, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1% Triton X-100] .
- Verzamel cellysaat door centrifugatie gedurende 10 min bij 21.000 xg bij 4 ° C.
- Kwantificeren eiwitconcentratie door Bradford eiwit assay, laadt gelijke hoeveelheden eiwit per laan voor SDS-PAGE, en over te dragen aan nitrocellulose voor immunoblotting.
- Celpreparaat voor immunofluorescentie.
- Spoel cellen 3x met 2 ml PBS, repareren cellen in 1 ml van 3,7% paraformaldehyde (in PBS) gedurende 10 min bij kamertemperatuur was daarna 3x met 2 ml PBS gedurende 5 minuten.
- Monteer dekken slip op een glasplaatje, met behulp van montage medium. Dicht de dekglaasje randen met nagellak indien nodig.
- Bewaar de dia bij 4 ° C voor onderzoek.
3. Flowcytometrie en immunofluorescentie microscopie
- Flowcytometrie wordt uitgevoerd met behulp van een Beckman Coulter Cyan ADP, uitgerust met 488 nm, 405 nm en 642 nm solid-state lasers. Summit software wordt gebruikt voor het verwerven en analyseren.
- Kalibreren doorstroomcytometer met standaard kralen.
- Perceel Forward verstrooiing (FSC) / Zijwaartse verstrooiing (SSC) op een lineaire schaal voor venstertijd levende cel populatie.
- Perceel FSC / spanning pulsbreedte voor gating niet-geaggregeerde levende cel populatie.
- Perceel count/FL6 (GVB fluorescence, 405 nm) op een log schaal voor gating niet-geaggregeerde levende GVB-positieve cellen.
- Perceel count/FL1 (YFP fluorescentie, 488 nm) op een log schaal voor BiFC intensiteit.
- Run YFP-CFP-double negatieve monsters, passen FSC, SSC, VT1 en FL6 fotoversterkerbuis (PMT) spanning om de drempel voor elk signaal instellen.
- Run single positief (zowel YFP + en GVB +) monsters voor toekomstige off-line compensatie
- Verwerven ten minste 10.000 gated events (niet-geaggregeerde levende GVB + cellen) voor analyse.
- Immunofluorescentiemicroscopie wordt uitgevoerd met behulp van een Zeiss LSM 510 confocale microscoop. Opmerking: het is belangrijk om alle instellingen (zoals de zoom, pinhole, detector gain, versterker offset, framegrootte, scansnelheid, scan-gemiddelde, en laservermogen) consistente tussen houden monsters voor een goede vergelijking van alle data.
4. Data-analyse (uitgevoerd met behulp van Summit Software)
- Stel de analyse protocol vergelijkbaar met die voor acquisition met de juiste gating:
Gate 1 in FSC / SSC dot plot voor levende cellen.
Gate 2 in FSC / pulsbreedte van Gate 1 voor niet-geaggregeerde levende cellen.
Poort 3 in count / GVB van Gate 3 voor niet-geaggregeerde GVB + levende cellen. - Compenseren YFP en CFP signaal met behulp van YFP + en GVB + enkele positieve cellen.
- Opnieuw bepalen Uiterste lijnen voor CFP / YFP-positieve cellen.
- Export YFP gemiddelde fluorescentie-intensiteit (MFI) van GVB + cellen naar Excel voor data-plotten.
- Normaliseren YFP MFI de expressie van AKAP-LBC, PDE4D3 en belastingsbegrenzing α-tubuline, zoals bepaald door Western blot.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
AKAP-LBC en PDE4D3 constructies (Figuur 1B) werden gefuseerd met VN en VC fragmenten, respectievelijk. Interactie van AKAP-LBC en PDE4D3 resulteert in functionele YFP fluorescentie (Figuur 1A). Hier gebruiken we de BiFC methode om de kaart AKAP-LBC-bindingsplaatsen in PDE4D3. Upstream geconserveerd gebied 1 (UCR1) stroomopwaarts geconserveerde gebied 2 (UCR2) en katalytische gebied (CAT) zijn geconserveerd onder PDE4 familie eiwitten, is de volledige lengte (FL), UCR1 en UCR2 plus CAT w...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
BiFC is een eenvoudige en gevoelige methode om eiwit-eiwit interacties te bestuderen. Deze werkwijze kan niet worden gebruikt om nieuwe eiwit-eiwit interacties te identificeren, maar het is vooral handig om eiwit-eiwit interacties binnen cellen bevestigen en functionele eigenschappen te bestuderen, zoals subcellulaire lokalisatie van eiwitcomplexen, in kaart brengen van eiwit-eiwit interactieplaatsen en voor het screenen van kleine moleculen / peptiden die eiwit-eiwit interacties kunnen moduleren. Omdat VN en VC fragmen...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Wij danken de O'Bryan lab bij UIC voor kritische experimentele evaluatie en discussie. Dit werk werd ondersteund door de American Heart Association Grant 11SDG5230003 om GKC en National Center for Translational Science Vooruitgaan - UIC Centrum voor klinisch en translationeel Sciences Grant UL1TR000050.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| REAGENTS | |||
| Dulbecco’s modified Eagle’s media (DMEM) | Invitrogen | 11965-092 | |
| Penicilin-Streptomycin (pen/strep), 100x | Invitrogen | 15070-063 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Invitrogen | 16000-044 | |
| Anti-Flag antilichaam | Sigma | M2, F1804 | |
| Anti-HA antilichaam | Covance | 16B12, MMS-101R | |
| α-tubulin | Sigma | DM1A, T9026 | |
| Anti-GFP antilichaam | Clontech | 632569 | |
| Cell culture platen, 6-well weefselkweek behandeld | Thermo Fisher Scientific | 130184 | |
| HEK 293T cellen | ATCC | CRL-11268 | |
| Maxiprep plasmide zuiveringskit, hoge snelheid | Qiagen | 12663 | |
| Dulbecco’s Phosphate-buffered saline (DPBS), steriele 1x | Invitrogen | 14190-144 | |
| Trypsin-EDTA, 0,05% (w/v) | Gibco | 25300 | |
| Polystyreen rondbodem buizen voor FACS-kleuring | BD Biosciences | 352052 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | S74337MF | |
| Prolong gold antifade reagens met DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Superfrost plus microscoopglazen | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Fisherfinest premium dekglazen | Fisher Scientific | 12-548-5P | |
| UITRUSTING | |||
| CO2 air-jacketed Incubator | NuAIR DH autoflow | ||
| Confocale microscoop LSM510 META | Carl Zeiss, Inc | ||
| Elektroforese en overdrachtseenheid | Biorad | ||
| Cyan ADP Flow Cytometer | Beckman Coulter |
Referenties
- Collura, V., Boissy, G. From protein-protein complexes to interactomics. Subcell Biochem. 43, 135-183 (2007).
- Stumpf, M. P., et al. Estimating the size of the human interactome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6959-6964 (2008).
- Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 789-797 (2011).
- Dwane, S., Kiely, P. A. Tools used to study how protein complexes are assembled in signaling cascades. Bioeng. Bugs. 2, 247-259 (2011).
- Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Curr. Opin. Struct. Biol. 15, 4-14 (2005).
- Kerppola, T. K. Design and implementation of bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays for the visualization of protein interactions in living cells. Nat. Protoc. 1, 1278-1286 (2006).
- Shyu, Y. J., Suarez, C. D., Hu, C. D. Visualization of ternary complexes in living cells by using a BiFC-based FRET assay. Nat. Protoc. 3, 1693-1702 (2008).
- Wong, K. A., O'Bryan, J. P. Bimolecular fluorescence complementation. J. Vis. Exp. (50), e2643(2011).
- Sugarbaker, E. V., Thornthwaite, J. T., Temple, W. T., Ketcham, A. S. Flow cytometry: general principles and applications to selected studies in tumor biology. Int. Adv. Surg. Oncol. 2, 125-153 (1979).
- Koshy, S., Alizadeh, P., Timchenko, L. T., Beeton, C. Quantitative measurement of GLUT4 translocation to the plasma membrane by flow cytometry. J. Vis. Exp. (45), e2429(2010).
- Smith, C. L. Basic confocal microscopy. Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter 14 (Unit 14), 11(2008).
- Westwick, J. K., Lamerdin, J. E. Improving drug discovery with contextual assays and cellular systems analysis. Methods Mol. Biol. 756, 61-73 (2011).
- Kilpatrick, L. E., Holliday, N. D. Dissecting the pharmacology of G protein-coupled receptor signaling complexes using bimolecular fluorescence complementation. Methods Mol. Biol. 897, 109-138 (2012).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
