Methodenartikel

Metabole Labeling en Membrane Fractionation for Comparative Proteomic analyse van

14.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50535

⸱

28 september 2013

 ,  , 
1Signaling Proteomics, Max Plank Institute of Molecular Plant Physiology, 2Department of Plant Systems Biology, University of Hohenheim

In dit artikel

Samenvatting

Hier beschrijven we een robuuste werkwijze voor de fractionering van plantaardige plasmamembranen in reinigingsmiddelenbestendige en detergent oplosbare membranen gebaseerd op een mengsel van gelabelde en in vivo volledig 15N gemerkt Arabidopsis thaliana celculturen. De procedure wordt toegepast voor vergelijkende proteomics studies om signalering processen te begrijpen.

Samenvatting

Plasmamembraan microdomeinen zijn functies op basis van de fysische eigenschappen van het lipide en sterol milieu en hebben een specifieke rol bij het signaleren van processen. Extraheren-sterol verrijkte membraan microdomeinen van plantencellen voor proteomics analyse is een moeilijke taak vooral te wijten aan meerdere voorbereidende stappen en de bronnen van verontreinigingen uit andere cellulaire compartimenten. Het plasmamembraan vormt slechts 5-20% van de membranen in een plantencel, en dus isolatie van sterk gezuiverde celmembraan fractie uitdagend. Een veel gebruikte methode bestaat waterige twee-fase verdeling in polyethyleenglycol en dextran, die plasmamembraan vesicles oplevert met een zuiverheid van 95% 1. Sterol-rijke membraan microdomeinen binnen het plasmamembraan onoplosbaar na behandeling met koud ionogene detergentia bij alkalische pH. Dit detergent-resistente membraan fractie kan vanuit de bulk plasmamembraan worden gescheiden door ultracentrifuge in alsucrose gradiënt 2. Vervolgens kunnen eiwitten worden geëxtraheerd uit de lage dichtheid band van de sucrose gradiënt van methanol / chloroform precipitatie. Geëxtraheerd eiwit vervolgens met trypsine worden gedigereerd, ontzout en tenslotte geanalyseerd met LC-MS/MS. De extractie protocol voor sterol-rijke microdomeinen is geoptimaliseerd voor de bereiding van schone detergens resistent membraan fracties uit Arabidopsis thaliana celkweken.

We gebruiken volledige metabole kenmerken van Arabidopsis thaliana schorsing celculturen met K 15 NO 3 als de enige bron van stikstof voor kwantitatieve vergelijkende proteomics studies na biologische behandeling van belang 3. Door gelijke verhoudingen van gelabelde en ongelabelde celculturen gezamenlijke eiwitextractie invloed voorbereiding stappen uiteindelijke kwantitatief resultaat wordt minimaal gehouden. Ook verlies van materiaal tijdens de extractie zowel controle en behandeling monsters op dezelfde wijze affectd dus de verhouding van licht en bijdraaien peptide blijft constant. In de voorgestelde werkwijze ofwel gemerkt of ongemerkt celkweek ondergaat een biologische behandeling, terwijl de andere dient als controle 4.

Inleiding

In 1972, Jonathan Singer en Garth Nicolson voorgesteld de vloeistof mozaïek model een structuur model van cellulaire membranen, het vervangen van de eiwit-lipide-eiwit sandwich model dat in het algemeen in de vroege jaren 1960 werd aanvaard. Singer en Nicolson gepostuleerd dat het biologische membraan kan worden beschouwd als een tweedimensionale vloeistof waar alle lipiden en eiwitmoleculen vrij en gemakkelijk 5 diffunderen. Sindsdien structuurmodel van het plasmamembraan en kennis van het membraan preparaat werd nog ingewikkelder. Vooral in de plasmamembraan, structuren zoals eiwitcomplexen lipiden / sterol gebaseerd structureel verstoord microdomeinen worden waargenomen. In kunstmatige modelmembranen 6,7, kan sterolen en sphingolipiden zijdelings te scheiden van andere soorten lipiden aan regio's te vormen met gewijzigde fysieke kenmerken. Deze segregatie binnen het celmembraan wordt voornamelijk veroorzaakt door de zelfassocierende eigenschappen tussen sterolen en zeer saonverzadigde koolwaterstof ketens van phopsho-en sfingolipiden 8. Bijzonder, de starre sterol ringen gunst interacties met stijvere en rechtere verzadigde soorten lipiden en deze interacties dwingen naburige koolwaterstofketens in meer uitgebreide conformaties, toenemende membraandikte en hardheid.

Een van de vaak waargenomen kenmerken sterol verrijkte membraan microdomeinen was hun onoplosbaarheid na behandeling met niet-ionische detergentia zoals Triton X-100 en Brij 35. Deze fracties werden verondersteld identiek met membraan microdomeinen te zijn en werden genoemd reinigingsmiddelenbestendige membranen (DRM) op basis van hun biochemische bereidingswijze 2. Het gebruik van niet-ionische detergenten tijdens DRM extractie kreeg kritiek omdat de biochemische DRM preparaat kan niet rechtstreeks overeen met een specifieke membraancompartiment binnen de levende cel 9. Vooral, het wasmiddel aan eiwitverhouding lijkt cruciaal in dergelijke preparaten, eenTussen verschillende detergenten, evenals verschillende hoeveelheden detergens kunnen andere samenstelling van de reinigingsmiddelenbestendige membraanfractie 10 opleveren. Er is bewijs dat bepaalde proteïne species specifiek associëren met deze cellulaire sterol-rijke membraan domeinen, en dat deze eiwitten zijn goed verrijkt biochemische preparaten wasmiddel-resistente membraan fracties 11. De kern van eiwitten die werden gevonden in plantaardige DRM fractie en waarbij de aanwezigheid DRM was sterol afhankelijk waren bijzonder GPI-verankerde eiwitten, zoals fascicline-achtige eiwitten arabinogalactaan (knip) en leden van de SKU eiwitfamilie. Ook enkele signalerende proteïnen, zoals receptor-achtige kinasen of fosfolipase gevonden 11. Deze resultaten zijn consistent met vele proteomische studies voor zoogdieren membraan microdomeinen 12,13. Ook in planten is er steeds meer bewijs voor de rol van membraan microdomeinen in context van stress respons 14 -16.

De hier beschreven protocol voorziet in een robuuste methode voor fractionering van plasmamembraan microdomeinen en bijzonder maakt gebruik van een eiwit aan detergent concentratie die ons in staat stelt om stress geïnduceerde veranderingen van de sterol-rijke membraancompartiment 4,11,14 verbeelden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

PROCEDURE

Gemeenschappelijke reagentia en buffers die in de extractie protocol:

  1. JPL medium voor Arabidopsis thaliana schorsing celculturen
    • 3 uM H 3 BO 3
    • 3 uM MnSO 4 x H2O
    • 1.1 uM ZnSO 4 x 7 H2O
    • 0,15 uM KJ
    • 0,03 uM Na 2 MoO 4 x 2 H2O
    • 3 nM CoCl2 x 6 H2O
    • 3 nM CUSO4 x 5 H2O
    • 0,9 mM CaCl2 x 2 H2O
    • 0,5 mM MgSO4 x 7 H2O
    • 0,5 uM FeSO 4 x 7 H2O
    • 0,5 uM Na2EDTA x 2 H2O
    • 0,12 uM thiamine HCl
    • 0,16 uM nicotinezuur
    • 0.097 uM pyridoxine HCl
    • 0.107 uM NAA
    • 0.375 mM KH 2 PO 4
    • 0.061 mM NaH2 PO 4 x 2 H2O
    • 0,039 mM Na 2 HPO 4
    • 0.027 mM glycine
    • 0,56 mM myo-inositol
    • 1,5% sucrose
    • 10 mM K 14 NO 3 of 10 mM K 15 NO 3

OPMERKING: pH van het medium JPL worden aangepast tot 5,7 met KOH. Het medium moet worden gesteriliseerd door filtratie of autoclaveren voor gebruik.

  1. Buffer H
    • 100 mM HEPES-KOH (pH 7,5)
    • 250 mM sucrose
    • 10% (w / v) glycerol
    • 5 mM EDTA
    • 5 mM ascorbinezuur
    • 0.6% (w / v) PVP K-25 en K-30
    • 5 mM DTT (voeg verse)
    • 1 mM PMSF (voeg verse)
    • protease en fosfatase remmers (voeg verse)
      • 50 mM NaF
      • 1 mM Na 3 VO 4
      • 1 mM benzamidin
      • 0,3 uM mikrocystin
      • 4 uM leupeptine
      • proteaseremmercocktail
  2. Buffer R
    • 5 mM kaliumfosfaat
    • 0,33 M sucrose
    • 3 mM KCl
    • 0,1 mM EDTA
    • 1 mM DTT (voeg verse)
  3. Buffer TNE
    • 25 mM Tris-HCl, pH 7,5
    • 150 mM NaCl
    • 5 mM EDTA
  4. Twee-fasen systeem (6 g-systeem is geschikt voor maximaal 15 g monster vers gewicht) bereidingswijze
    In 15 ml Falcon buis mix ingrediënten hieronder vermeld en meng:
    • 20% (w / w) dextran T500 - 2,6 g
    • 40% (w / w) poly (ethyleenglycol) (PEG 3350) - 1,3 g
    • sucrose - 0.678 g
    • 0,2 M kalium fosfaat, pH 7,8-0,15 ml
    • 2 M KCl - 0.014 ml
    • voeg water tot totale massa van het tweefasensysteem is 6 g.
  5. Sucrose oplossingen in TNE buffer
    • 2.4 M, 1,6 M, 1,4 M, 0,15 M
  6. Reagentia voor trypsinedigestie
    • UTU: 6 M ureum, 2 M thioureum (pH 8,0 met 10 mM Tris-HCl)
    • Reductie buffer (1 ug / ul DTT in water; 6,5 mm)
    • Alkylering buffer (5 ug / ul joodaceetamide in water; 27 mm)
    • LysC endopeptidase (0,5 ug / ul)
    • Trypsine, gewijzigd sequencing waardering (0,4 ug / ul)
  7. Reagentia voor peptide ontzouten dan C 18
    • resuspensie oplossing: 2% trifluorazijnzuur (TFA), 5% acetonitril in water
    • oplossing A: 0,5% azijnzuur
    • oplossing B: 80% acetonitril, 0,5% azijnzuur
  8. Reagentia voor fosfopeptide verrijking
    • Oplossing A: 0,1% TFA, 5% azijnzuurnitril
    • Oplossing B: 0,1% TFA, 80% acetonitril
    • TiO 2 10 urn
    • Ammoniak (voorraad 25% oplossing)
    • Piperidine (voorraad 100%)

PROTOCOLS

1. Metabolisch merken van Arabidopsis thaliana celsuspensieculturen

  1. Grow Arabidopsis Col-0 celsuspensiekweken afgeleid van bladeren 17 in volle 14 N-JPL medium (18, zie gedeelte "Algemene reagentia en buffers") en een set van culturen in 15 N-JPL medium in steriele kolf bij constant licht staat op 80 tot 100 umol / m 2 s, 23 ° C onder voortdurend schudden bij 120 rpm.
  2. De celkweken behouden inoculeren 400 ml vers medium JPL met 40 ml zeven dagen oude celcultuur in 1 L flessen.
  3. Oogsten van celkweken optreedt via afzuiging door een brede glazen trechter met een roestvrij stalen gaas. Cellen ophopen op het gaas plaat en in de trechter en kan gemakkelijk worden opgehaald vanaf daar. Cellen worden aanbevolen bij -80 ° C of in vloeibare stikstof worden bevroren voor slijpen.

OPMERKING: Voor 15 N metabolisch gemerkt celculturen gebruiken de K 15 NO 3 als de enige bron van stikstof voor minstens twee passages over twee weken 19. In ervariments voor vergelijkende proteomics, gebruik dan een 15N gelabelde celcultuur en ook een ongemerkt cultuur te behouden in de normale medium. Biologische behandeling wordt dan toegepast op zowel gelabelde of ongelabelde cultuur, terwijl de andere dient als controle (Figuur 1). Voor eiwit voorbereiding, zullen beide culturen worden gecombineerd 20. Bij het ​​plannen van de experimentele opstelling, raden wij gezien wederzijdse labeling opstart 4, waarbij dezelfde behandeling eenmaal is aangebracht op de 15 N-gemerkte cellen en eenmaal aan het ongelabelde cellen en de respectievelijke ongelabelde of 15N gemerkte cellen als controles te dienen. In dit geval wordt een dubbele hoeveelheid celculturen nodig.

2. Plasmamembraan Zuivering

OPMERKING: alle verdere stappen in de koude kamer en / of op ijs uitgevoerd, tenzij anders is vermeld.

  1. Meng cellen van ongeveer 1 L van 7 dagen oud celsuspensieculturen in vloeibare stikstof.Het materiaal kan worden opgeslagen bij -80 ° C tot verder gebruik.
  2. Meng dezelfde hoeveelheden geëtiketteerd en ongelabelde bevroren celculturen gebaseerd op vers gewicht in een beker en voeg 2 volumes buffer H onmiddellijk. Bij membraan microdomain bereiding wordt voorgesteld ten minste 7 g versgewicht gebruik van zowel gelabelde en ongelabelde cellen.
  3. Plaats het bekerglas op een shaker en schud totdat het materiaal wordt gesmolten en de oplossing vloeistof zonder ijskristallen.
  4. Filter de homogenaat door een laag van Miracloth in 50 ml centrifuge buizen.
  5. Stand monsters met buffer H en centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 8 minuten.
  6. Laad het supernatans in voorgekoeld ultra-centrifuge buizen (bijv. voor rotor Beckman Coulter SW31Ti), met een volume van ongeveer 32 ml
  7. Stand monsters met buffer H en de microsomen pellet door centrifugeren bij 100.000 xg bij 4 ° C gedurende 30 min met behulp van Beckman SW32Ti rotor.
  8. Verwijder de supernatant na centrifugeren.

OPMERKING: de bovenstaande vloeistof bevat oplosbare eiwitten. Een kleine hoeveelheid van de fractie kan worden opgeslagen voor verder eiwitten neerslaan en daaropvolgende analyse ook oplosbare eiwitten.

  1. Resuspendeer de membraan pellet van elk monster in de respectievelijke hoeveelheid buffer R en laden op de bovenkant van U1 tweefasensysteem (figuur 2). Als de 6 g tweefasensysteem wordt gebruikt, plaatst precies 2 g geresuspendeerde pellet membraan.

Opmerking: Het eindvolume buffer R afhankelijk van de grootte van het tweefasensysteem dat zal worden gebruikt (~ 1,6 ml buffer R nodig wanneer u 6 g systeem). Aanbevolen wordt minder buffer voor resuspensie zo zuiver buffer kan worden toegevoegd aan tweefasensysteem de gevraagde gewicht te verkrijgen, in plaats van te veel buffer voor solubilisatie en niet kunnen het gehele monster op het tweefasensysteem laden.

  1. Laad hetzelfde volume zuivere buffer R zoals gebruikt voor ee monster resuspensie op U2.
  2. U1 en U2 buizen langzaam meng door hen 30x (ongeveer 1 inversie / sec).

OPMERKING: Niet krachtig schudden de twee-fasen systeem. Het kan een onvoldoende scheiding van de fasen in de ultracentrifugatie stap veroorzaken.

  1. Centrifugeer de monsters bij 1500 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
  2. Verwijder de supernatant na centrifugeren.
  3. Breng de bovenste fase van U1 naar U2 en herhaal centrifugeren bij 1500 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
  4. Verplaats de bovenste fase van U2 in de SW41Ti ultracentrifugebuizen en verdun het met vijf volumes buffer R en meng.

OPMERKING: De laatste bovenste fase wellicht worden onderverdeeld in afzonderlijke ultracentrifugebuizen voordat vijfmaal verdund kan worden.

  1. Centrifugeer de monsters bij 200.000 xg bij 4 ° C gedurende een uur met de SW41Ti rotor.
  2. Hersuspenderen membraan pellet in small hoeveelheid TNE buffer (meestal 200 pl buffer wordt gebruikt) voor de isolatie van reinigingsmiddelenbestendige membranen.

OPMERKING: Een kleine hoeveelheid van deze fractie kan worden opgeslagen voor de analyse van niet-gefractioneerde plasmamembraan.

OPMERKING: De plasmamembraan fractie kan worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende de nacht vóór fractionering in reinigingsmiddelenbestendige membranen en detergent oplosbare fracties.

3. Reinigingsmiddelenbestendige Membraan Voorbereiding

  1. Controleer de concentratie van de plasmamembraan fractie Bradford assay.
  2. Voeg Triton X-100 aan de plasmamembraan fractie. De uiteindelijke concentratie van het wasmiddel moet blijven tussen de 0,5-1%. Het wasmiddel eiwit gewichtsverhouding moet blijven tussen 13-15.
  3. Schud de monsters bij ongeveer 100 rpm bij 4 ° C gedurende 30 minuten.
  4. Voeg drie delen van 2,4 M sucrose tot een volume van het behandelde plasma membraan 1,8 M eindconcentratie saccharose vinden.
  5. Bereid de sucrose gradiënt in SW41Ti ultracentrifuge buizen door het laden van de respectievelijke sacharoseoplossingen bovenop de 1,8 M fractie zoals geïllustreerd in figuur 3.
  6. Centrifugeer de monsters bij 250.000 xg bij 4 ° C gedurende 18 uur met de Beckman SW41Ti rotor.
  7. Verwijder voorzichtig de ultracentrifuge buizen van de rotor naar verstoren van de low-density band die zichtbaar is als een melkachtige ring op het snijvlak van 0,15 M/1.4 M sucrose kan worden voorkomen. Soms is er niets te zien, maar de fractie bevat nog steeds de reinigingsmiddelenbestendige eiwitfractie.
  8. Verwijder fractie van 0,75 ml volume uit de top van de gradiënt. Fracties 2 en 3 die volume van ongeveer 1,5 ml boven de interfase ring onder 0,5 ml bedekken vertegenwoordigen reinigingsmiddelenbestendige membraanfractie. Verzamel deze fracties in 15 ml Falcon buizen. Fracties 9 en 10 bevatten detergent oplosbare membraan fractie en kan worden verzameld vergelijking. Voor verdere analyse, zwembad fractionen 2 en 3, alsmede fracties 9 en 10.

4. Extractie van eiwitten uit de reinigingsmiddelenbestendige Fraction door methanol / chloroform

OPMERKING: Alle stappen worden in de kamertemperatuur.

  1. Voeg 4 delen methanol aan de verzamelde fracties en vortex grondig.
  2. Voeg 1 volume chloroform, vortex grondig.
  3. Voeg 3 delen water, vortex grondig.
  4. Centrifugeer de monsters bij 2000 xg gedurende 5 minuten met behulp van een tafelcentrifuge (bijv. Eppendorf 5417R).
  5. Verwijder de waterige fase boven het eiwit laag in de interfase.
  6. Voeg 3 delen methanol, vortex grondig.
  7. Centrifugeer de monsters bij 4000 xg gedurende 10 minuten.
  8. Verwijder supernatant en droog de pellet. De gedroogde pellet is klaar voor in-oplossing spijsvertering.

5. In-oplossing trypsinedigestie

OPMERKING: In deze procedure worden alle stappen gedaan bijkamertemperatuur tot ongewenste derivatisering van aminozuur zijketens verminderen denatureringsmiddelen.

  1. Ontbinden monster in een klein volume van 6 M ureum, 2 M thiurea, pH 8 (UTU). Gebruik zo laag volume als verenigbaar is met het monster (meestal ongeveer 40 pl).
  2. Spin monsters opgelost in UTU bij 5000 xg in een tafelcentrifuge (bijv. Eppendorf 5417R) gedurende 10 minuten aan een onoplosbaar materiaal neer te slaan.
  3. De pH van de uiteindelijke oplossing moet dicht bij 8,0 voor optimale trypsinedigestie. Controleer met een pH-strips.
  4. Voeg 1 ul van vermindering buffer per 50 ug eiwit monster en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.

NB: Alleen een ruwe schatting van het eiwitgehalte is noodzakelijk. Wanneer hoeveelheid monster beperkt is het beter om de nauwkeurigheid te offeren plaats van het verspillen monster op een proteïne assay.

  1. Voeg 1 ul van alkylering buffer per 50 ug eiwit monster en incubeer 20 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
  2. Voeg 0,5 ul van LysC per 50 ug eiwit monster en incubeer gedurende drie uur bij kamertemperatuur onder constant schudden bij 700 rpm. Indien nodig, de digest kan ook 's nachts uitgevoerd. Echter, wordt uitgebreid tijd bij warme temperaturen niet aanbevolen als het peptide verlies kan toenemen als gevolg van adsorptie aan plastic buis materiaal onder waterige pH 8 voorwaarden.
  3. Verdun monster met vier volumes 10 mM Tris-HCI, pH 8.

Opmerking: Deze stap is absoluut noodzakelijk om het ureum te verdunnen trypsine is zeer gevoelig voor hoge zout.

  1. Voeg 1 ul van trypsine per 50 ug eiwit monster en incubeer overnacht bij kamertemperatuur onder constant schudden bij 700 rpm.
  2. Zuur de monsters tot 0,2% TFA uiteindelijke concentratie pH 2 (voeg ongeveer 1/10 volume van 2% trifluorazijnzuur) bereiken.

Opmerking: De monsters worden bewaard bij - 20 ° C tot verder gebruik, maar het is beter te slaanze op StageTips bij 4 ° C als het voor een korte tijd (een week) of op te slaan na StageTips ontzouten.

6. Productie van C 18-StageTips

  1. Plaats een Empore Disk C18 op een vlakke, schone ondergrond zoals een wegwerp plastic petrischaal.
  2. Pons een kleine schijf met behulp van een stompe getipt injectienaald met een diameter van 1,5 mm. De schijf steekt in de naald en in een pipet tip kan worden overgedragen.
  3. Druk de diskette uit de naald en bevestig het in het afbouwen van een pipet tip door een stuk gesmolten silica of buis passend in de binnenkant van de naald.

OPMERKING: StageTips kan droog worden bewaard bij kamertemperatuur 21.

7. Het gebruik van C 18-StageTips voor Peptide Desalting en concentratie

  1. Voorwaarde een C 18-StageTip door het plaatsen van 50 ul van oplossing B op de voorbereide StageTip. Spin de tip in de centrifuge bij 2000 rpm gedurende 2 minuten in een tafelmodel centrifuge (bijv. Eppendorf 5417R).

OPMERKING: Gebruik adapters StageTips draaien in een Eppendorf centrifuge, zal er vloeistof wordt opgevangen in een 2 ml reageerbuis. Voor grootschaliger voorbereidingen, podium tips kunnen ook worden opgenomen in een tip rek geplaatst met 96 van de 200 ul tips en vloeistof kan worden opgevangen in een microtiterplaat.

OPMERKING: Gebruik nooit hogere snelheden dan 3000 xg in een tafelcentrifuge (bijv. Eppendorf 5417R) vanwege het risico van het spinnen uit de C 18 schijf van de punt.

  1. Equilibreer de StageTip behulp van 100 pi oplossing A. Draai de tip in de centrifuge bij 5000 xg in een tafelcentrifuge (bijv. Eppendorf 5417R).
  2. Herhaal stap 2.
  3. Belasting monster op schijf door het monster voorzichtig pipetteren in de pipet tip met de disc in.

OPMERKING: Een disc kan ca. binden. 100 ug eiwit.

  1. Spin de tips in het centrifuge totdat het hele volume van het monster door het C 18 schijf.
  2. Was de StageTips twee keer met 100 ul van oplossing A. Spin de tips in de centrifuge.

OPMERKING: De gewassen en geladen StageTips kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C gedurende maximaal een week.

  1. Elueren monster met 40 ul van oplossing B. Vang het eluaat op in een frisse 1,5 ml reageerbuis.
  2. Concentreer het monster in de Speed ​​Vac. Onder ideale omstandigheden, stop het droogproces want er is zo ongeveer 1 of 2 pl vloeistof die overblijft.

OPMERKING: Gedroogde monsters kunnen in de -80 ° C worden opgeslagen voor jaren.

  1. Voeg een eindvolume van 9 ui resuspensie oplossing van het monster en aan de microtiterplaat voor massaspectrometrie analyse.

Opmerking: Het eindvolume van de gebruikte resuspensie buffer afhankelijk van de behoeften van de onderzoeker en de gevoeligheid van de massaspectrometergebruikt.

8. Alternatieve Protocol voor Phosphopeptide Verrijking

OPMERKING: Voor fosfopeptide verrijking, eiwitextractie in stap 2 moet worden gedaan in het bijzijn van fosfataseremmers.

Let op: exacte eiwitconcentratie hoeft niet te worden bepaald voor de volgende stappen. Het is genoeg om een ​​ruwe schatting van het eiwitgehalte moeten onnodige monster verlies te voorkomen

  1. Bereid de C8-StageTips (volgen hetzelfde protocol voor de bereiding van C 18-StageTips bij stap 6).
  2. Breng 1 mg TiO 2-korrels boven geprepareerde C8-StageTips (gebruik 1 mg TiO 2 per 100 ug eiwit).
  3. Equilibreer de TiO 2-tips met 100 pi oplossing C, centrifugeren bij 2000 xg gedurende 5 minuten in een benchtop centrifuge (bijv. Eppendorf 5417R).
  4. Meng 100 ug verteerd en ontzout peptiden uit stap 7.7 (het moet in 100 ul oplossingB) met 100 ul oplossing A
  5. Laad mengmonster op de geëquilibreerde TiO 2 kolommen; centrifugeren op 1000 xg, 5 min.
  6. Verzamel de doorstroming en te laden op hetzelfde punt weer (te houden stroom door na tweede pas).
  7. Was tip met 100 ul van oplossing A; centrifugeren op 2000 xg, 5 min in een tafelcentrifuge (bijv. Eppendorf 5417R).
  8. Elueer monster met 50 ul van 5% ammonia.
  9. Elueer monster met 50 ul van 5% piperidine (beide eluaten te combineren).
  10. Zuur onmiddellijk het monster met 50 ui 20% fosforzuur. pH moet rond 2.

OPMERKING: Sla de TiO 2 tips en het poeder op te halen. Het kan worden gewassen met oplossing B en opnieuw gebruikt voor een of twee rondes.

  1. Opnieuw ontzouten aangezuurd monsters dan C 18 tips (zie stap 8).

9. LC-MS/MS analyse van peptide mengsels

  1. Resuspendeer ontzout phosphopeptides in hersuspensiebuffer.
  2. Load geresuspendeerd monster op LC-MS/MS systeem van keuze en het verwerven van spectra in data afhankelijke modus bij gesuggereerd resolutie van 60.000 volle breedte op halve hoogte.

OPMERKING: Voor een optimale fragmentatie, moet ofwel neutraal-verlies scannen worden toegepast 22, of indien beschikbaar het meertraps activering 23. Als ETD beschikbaar is, wordt peptidehoofdketen fragmentatie mogelijk te maken zonder verlies van fosforzuur 24.

OPMERKING: Peak lijsten van ruwe data moeten worden gehaald en naar de database identificatie en kwantificatie ingediend. Hier, instellingen beschrijven we voor het gebruik van Mascot en MSQuant, die werkt voor ruwe data bestanden van LTQ, LTQ-Orbitrap en LTQ-FT instrumenten (Thermo Scientific).

  1. Extract piek lijst met behulp DTAsupercharge binnen de "Helper" Menu in MSQuant. Gebruik standaardinstellingen.
  2. Submit resulterende piek lijst bestand naar Mascot zoekmachine. Critical instellingen: precursorion massatolerantie 10 ppm, MS / MS massatolerantie 0,5 Da. Vaste wijzigingen: carbamidomethylation van cysteïnes, variabele wijzigingen: oxidatie van methionine, fosforylering van serine, threonine, tyrosine. Kwantificering methode: 15 N metabolisch merken.
  3. Opslaan Mascot resultaat als webpagina bestand.
  4. Laad Mascot resultaat bestand en ruwe bestand in MSQuant. Selecteer alle eiwitten van belang en run "Automatic kwantificatie". Het programma zal volledige scan spectra gelezen uit het Raw-bestand en doe piekintegratieparameters voor geëtiketteerd en ongelabelde partners van elk peptide.
  5. Export kwantificatie resultaten naar een spreadsheet programma of aan een door tabs gescheiden tekstbestand. De gegevens kunnen vervolgens tot verdere statistische analyse in Excel of met behulp van andere software pakketten zoals Statquant 25 of cracker 26 worden ingediend.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Bij de gepresenteerde protocol met metabolisch gemerkt Arabidopsis celkweken kan men plasmamembranen isoleren van plantenweefsel (stap 2, figuren 2 en 4) en verrijken reinigingsmiddelenbestendige membraanfracties in het plasmamembraan (stap 3, figuren 3 en 5). Vervolgens het protocol maakt extractie van eiwitten uit deze reinigingsmiddelenbestendige membraanfracties (stap 4) en digestie van het eiwit vergelijkende proteoomanalyse (stap 5). Ten slotte is de optionele verrijking ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De in dit document protocol bevat vele stappen en ze zijn cruciaal voor zuivere en representatieve fractionering van de plant plasmamembraan in reinigingsmiddelenbestendige membranen en detergent oplosbare fracties te verkrijgen. Daarom is het belangrijk om elke stap te volgen instructies.

Behandeling van de plasmamembraan fractie met niet-ionisch detergens (stap 3.2) heeft de sterkste invloed op de kwaliteit van het membraan microdomain fractionering. Om reproduceerbare resultaten te verkri...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

De auteur, Witold Szymanski, is een medewerker van het Max Planck Instituut voor Moleculaire Plantenfysiologie. De auteur, Waltraud Schulze is een medewerker aan de Universiteit van Hohenheim, Duitsland.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
REAGENTS
Chemicals werden besteld bij Sigma-Aldrich, tenzij anders vermeld
Ammoniak (voorraad 25 % oplossing)WAKO010-03166
TiO2 10 μm GL-Science5020-75010
Empore Disk C18Varian12145004
Polyethyleenglycol(PEG 3350)Sigma88276
Dextran T500Roth9219.2
TrypsinePromegaV5113
Protease-remmercocktail (PIC)SigmaP9599
K15NO3Cambridge Isotope LaboratoriesNLM-765-PK
APPARATUUR
Optima L-80 XP Ultracentrifuge Beckman
Plate readerBioTek
EASY-nLC II nano-Liquid ChromatograafThermo Scientific
LTQ-Orbitrap massaspectrometerThermo Scientific
Centrifuge 5810REppendorf
Centrifuge 5417REppendorf
ThermomixerEppendorf
Speed Vac RVC 2-25Christ
Shaker Unimax 2010Heidolph

Referenties

  1. Alexandersson, E., Saalbach, G., Larsson, C., Kjellbom, P. Arabidopsis plasma membrane proteomics identifies components of transport, signal transduction and membrane trafficking. Plant Cell Physiol. 45, 1543-1556 (2004).
  2. Brown, D. A., Rose, J. K. Sorting of GPI-anchored proteins to glycolipid-enriched membrane subdomains during transport to the apical cell surface. Cell. 68, 533-544 (1992).
  3. Lanquar, V., et al. 15N-metabolic labeling for comparative plasma membrane proteomics in Arabidopsis cells. Proteomics. 7, 750-754 (2007).
  4. Kierszniowska, S., Walther, D., Schulze, W. X. Ratio-dependent significance thresholds in reciprocal 15N-labeling experiments as a robust tool in detection candidate proteins responding to biological treatment. Proteomics. 9, 1916-1924 (2009).
  5. Singer, S. J., Nicolson, G. L. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science. 175, 720-731 (1972).
  6. Simons, K., Ikonen, E. Functional rafts in cell membranes. Nature. 387, 569-5672 (1997).
  7. Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104, 3165-3170 (2007).
  8. Silvius, J. R. Partitioning of membrane molecules between raft-and non raft-domains: insights from model membrane studies. Biochim. Biophys. Acta. 1746, 193-202 (2005).
  9. Tanner, W., Malinsky, J., Opekarova, M. In plant and animal cells, detergent-resistant membranes do not define functional membrane rafts. Plant Cell. , (2011).
  10. Lauwers, E., Andre, B. Association of yeast transporters with detergent-resistant membranes correlates with their cell-surface location. Traffic. 7, 1-15 (2006).
  11. Kierszniowska, S., Seiwert, B., Schulze, W. X. Definition of Arabidopsis sterol-rich membrane microdomains by differential treatment with methyl-ß-cyclodextrin and quantitative proteomics. Mol. Cell. Proteomics. 8, 612-623 (2009).
  12. Simons, K., Toomre, D. Lipid rafts and signal transduction. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 31-39 (2000).
  13. Maeda, Y., Kinoshita, T. Structural remodeling, trafficking and functions of glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins. Prog. Lipid Res. 50, (2011).
  14. Keinath, N. F., et al. PAMP-induced changes in plasma membrane compartmentalization reveal novel components of plant immunity. J. Biol. Chem. 285, 39140-39149 (2010).
  15. Stanislas, T., et al. Quantitative proteomics reveals a dynamic association of proteins to detergent resistant membranes upon elicitor signaling in tobacco. Mol. Cell. Proteomics. 8, 2186-2198 (2009).
  16. Minami, A., et al. Alterations in detergent-resistant plasma membrane microdomains in Arabidopsis thaliana during cold acclimation. Plant Cell Physiol. 50, 341-359 (2008).
  17. Pauly, M., Eberhard, S., Albersheim, P., Darvill, A., York, W. S. Effects of the mur1 mutation on xyloglucans produced by suspension-cultured Arabidopsis thaliana cells. Planta. 214, 67-74 (2001).
  18. Jouanneau, J. P., Peaud-Lenoel, C. Growth and synthesis of proteins in cell suspensions of a kinetin dependent tobacco. Physiol. Plant. 20, 834-850 (1967).
  19. Engelsberger, W. R., Erban, A., Kopka, J., Schulze, W. X. Metabolic labeling of plant cell cultures with K15NO3 as a tool for quantitative analysis of proteins and metabolites. Plant Methods. 2, 1-11 (2006).
  20. Arsova, B., Kierszniowska, S., Schulze, W. X. The use of heavy nitrogen in quantitative proteomics experiments in plants. Trends Plant Sci. 17, 102-112 (2012).
  21. Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. Stop And Go Extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics. Anal. Chem. 75, 663-670 (2003).
  22. Olsen, J. V., Macek, B. High accuracy mass spectrometry in large-scale analysis of protein phosphorylation. Methods Mol. Biol. 492, 131-142 (2009).
  23. Schroeder, M. J., Shabanowitz, J., Schwartz, J. C., Hunt, D. F., Coon, J. J. A neutral loss activation method for improved phosphopeptide sequence analysis by quadrupole ion trap mass spectrometry. Anal. Chem. 76, 3590-3598 (2004).
  24. Frese, C. K., et al. Improved peptide identification by targeted fragmentation using CID, HCD and ETD on an LTQ-Orbitrap Velos. Journal of Protrome Research. 10, 2377-2388 (2011).
  25. van Breukelen, B., vanden Toorn, H. W., Drugan, M. M., Heck, A. J. StatQuant: a post-quantification analysis toolbox for improving quantitative mass spectrometry. Bioinformatics. 25, 1472-1473 (2009).
  26. Zauber, H., Schulze, W. X. Proteomics wants cRacker: Automated standardized data analysis of LC/MS derived proteomic data. J. Proteome Res. 11, 5548-5555 (2012).
  27. Raffaele, S., Mongrand, S., Gamas, P., Niebel, A., Ott, T. Genome-wide annotation of remorins, a plant-specific protein family: Evolutionary and functional perspectives. Plant Physiol. 145, 593-600 (2007).
  28. Shah, M. B., Sehgal, P. B. Nondetergent isolation of rafts. Methods Mol. Biol. 398, 21-28 (2007).
  29. Persaud-Sawin, D. -A., Lightcap, S., Harry, G. J. Isolation of rafts from mouse brain tissue by a detergent-free method. Journal of Lipid Research. 50, 759-767 (2009).
  30. Macdonald, L. J., Pike, L. J. A simplified method for the preparation of detergent-free lipid rafts. Journal of Lipid Research. 46, 1061-1067 (2005).
  31. Mühlhaus, T., Weiss, J., Hemme, D., Sommer, F., Schroda, M. Quantitative shotgun proteomics using a uniform 15N-labeled standard to monitor proteome dynamics in time course experiments reveals new insights into the heat stress response of Chlamydomonas reinhardtii. Mol. Cell. Proteomics. 10, M110.004739(2011).
  32. Schulze, W., Usadel, B. Quantitation in mass-spectrometry-based proteomics. Annu. Rev. Plant Biol. 61, 491-516 (2010).
  33. Foster, L. J., de Hoog, C., Mann, M. Unbiased quantiative proteomics of lipid rafts reveales high specificity for signaling factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 5813-5818 (2003).
  34. Lilley, K. S., Dupree, P. Plant organelle proteomics. Curr. Opin. Plant Biol. 10, 594-599 (2007).
  35. Sadowski, P. G., Groen, A. J., Dupree, P., Lilley, K. S. Sub-cellular localization of membrane proteins. Proteomics. 8, 3991-4011 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Plasmamembraansterolrijke microdomeinendetergentresistente membranensucrosegradi ntcentrifugatietweefasenpartitioneringLC MS MS

Gerelateerde artikelen