Het meten van groei en genexpressie Dynamiek van Tumor-Gerichte<em&gt; S. Typhimurium</em&gt; Bacteriën

Samenvatting

Het doel van deze experimenten is om kwantitatief tijdsverloop gegevens over de groei en gen expressie dynamiek van verzwakte genereren S. typhimurium Bacteriële kolonies groeien binnen tumoren. Deze video behandelt tumorcel voorbereiding en de inplanting, bacteriën voorbereiding en injectie, hele-dier luminescentie beeldvorming, tumorexcisie, en bacteriële kolonie tellen.

Samenvatting

Het doel van deze experimenten is om kwantitatief tijdsverloop gegevens over de groei en gen expressie dynamiek van verzwakte S. genereren typhimurium bacteriële kolonies groeien binnen tumoren.

We gegenereerde model xenograft tumoren bij muizen door subcutane injectie van een mens eierstokkanker cellijn, OVCAR-8 (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD).

We getransformeerde verzwakte stammen van S. typhimurium bacteriën (ELH430: SL1344 ^PhoPQ-1) met een constitutief tot expressie luciferase (luxCDABE) plasmide voor visualisatie ^2. Deze stammen specifiek koloniseren tumoren terwijl hoofdzaak niet-virulent blijven de muis ^1.

Zodra meetbare tumoren werden vastgesteld, werden bacteriën intraveneus geïnjecteerd via de staartader met wisselende dosering. Tumor-gelokaliseerde werd bacteriële genexpressie in real tijd in de loop van 60 uur met eenin vivo imaging-systeem (IVIS). Op elk tijdspunt werden tumoren uitgesneden, gehomogeniseerd en uitgeplaat op bacteriële kolonies correlatie met genexpressiedata kwantificeren.

Tezamen zijn deze gegevens levert een kwantitatieve maat van de in vivo expressie en gen dynamiek van bacteriën groeien binnen tumoren.

Inleiding

Synthetische biologie is veel vooruitgang geboekt de afgelopen tien jaar en is nu gepositioneerd om belangrijke problemen in de energie en gezondheid beïnvloeden. Echter, heeft uitbreiding in de klinische arena is vertraagd door bezorgdheid over de veiligheid en de afwezigheid van het ontwikkelen van ontwerpcriteria voor in vivo genetische circuits. Versnellen hoge impact medische toepassingen vereisen het gebruik van methoden die rechtstreeks interface met medische infrastructuur, genetische circuits die buiten het gecontroleerde laboratorium omgeving functioneren, en veilig en klinisch-aanvaarde microbiële gastheren.

Een aantal stammen werden onderzocht voor de behandeling van kanker vanwege hun vermogen om bij voorkeur groeien in tumoren. Deze zijn opgenomen C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum en S. typhimurium ^3-8. S. typhimurium heeft bijzondere belangstelling opgewekt als ze de veiligheid en tolerantie zijn tentoongesteld in een aantal menselijke klinische proeven ^9-12. Deze bacteri een aanvankelijk aangetoond dat anti-tumor effecten via stimulatie van het gastheerimmuunsysteem en uitputting van voedingsstoffen die voor kanker celstofwisseling. Productie van therapeutische lading werd later toegevoegd door genetische modificaties. Hoewel deze studies vormen belangrijke vooruitgang in het gebruik van bacteriën voor tumor therapie, hebben de meerderheid van de bestaande inspanningen zich op hoog niveau expressie die doorgaans resulteert in de levering van hoge doseringen, off-target effecten, en de ontwikkeling van resistentie tegen ^13-16 .

Nu, kan synthetische biologie programmeerbare lading productie toevoegen door gebruik te maken van computer-ontworpen genetische circuits die geavanceerde detectie en levering ^17-20 kan uitvoeren. Deze circuits worden ontworpen als systemen die tumor-specifieke stimuli en zelfregulering cargo productie nodig zin. Echter, het bestuderen van de functie van deze schakelingen in vivo tot nu toe uitdagend.

ve_content "> Aangezien plasmiden zijn gemeenschappelijk kader voor synthetische circuits beschrijven we een methode om de dynamiek van plasmide-gebaseerde genexpressie karakteriseren in vivo in een muismodel. Deze werkwijzen maken gebruik van time-lapse luminescentie beeldvorming en kwantitatieve meting van biodistributie. Samen deze benaderingen een kader voor het bestuderen plasmide-gebaseerde netwerken in vivo klinische toepassingen.

Protocol

1. Cell Preparation

1. Passage cellijnen met behulp van standaard celkweek technieken. In dit experiment gebruikten we OVCAR-8 cellen (NCI DCTD Tumor Repository, Frederick, MD). Kweek cellen een doel confluentie van 80-100%.
2. Incubeer cellen met 5 ml trypsine gedurende 5 min, voeg 5 ml RPMI medium + FBS om trypsine te inactiveren.
3. Oogst en tellen cellen op een hemocytometer. Resuspendeer in fenolrood-vrij DMEM bij een doelconcentratie van 5 x 10 ⁷ cellen / ml, of ongeveer 200 ul per kolf.
4. Voeg 15% verminderde groeifactor Matrigel (BD Biosciences) en houd de celsuspensie op ijs tot implantatie.

2. Tumor Implantatie

1. Verdoven van 4 weken oude vrouwelijke NCR / nu muizen met 3% isofluraan en wacht ongeveer 5 min tot diepe verdoving zorgen. Gebruik vet zalven ogen droog terwijl onder narcose voorkomen.
2. Laad de cellen (100 ul per tumor) in een 1 ml spuit en bevestig een 27 1/ 2 gauge naald.
3. Voor elk van de twee bilaterale achterflank injectieplaatsen, til de huid met een tang om een ​​tent te maken en te injecteren cellen aan de basis. Let er niet te diep door te dringen, het produceren van bloed. Gebruik een pincet om voorzichtig spuit te verwijderen zonder spatten.
4. Monitor tumorgroei gedurende 10 - 20 dagen totdat een tumor diameter van 2-4 mm wordt bereikt.

3. Bacteriën Voorbereiding

1. Start een nachtelijke kweek van bacteriën in 3 ml LB-medium + ampicilline uit een -80 C vriezer voorraad of gekoelde plaat. In dit experiment gebruikten we S. typhimurium stam ELH430 (SL1344 PhoPQ-aroA-).
2. In de ochtend, verdunnen de cultuur 1:100 in gefilterd LB en groeien tot OD600 0,4-0,6.
3. Spin down en 3 keer wassen in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en resuspendeer in een uiteindelijke OD600 van 0,1 (ongeveer 1 x 10 ⁷ cellen / ml).

4. Bacteriën Injectie

1. Verdoven van het dier eend positie op zijn kant met de staart wijzend naar uw dominante hand. Gebruik vet zalven ogen droog terwijl onder narcose voorkomen.
2. Verwijden de staart ader met behulp van warm water of een warmtelamp.
3. Laad de bacteriën (100 pi per muis) in een 1 ml spuit en buig het uiteinde iets minder dan 90 graden.
4. Breng de spuit met de staart ader, dringen op een geringe diepte (mag geen weerstand voelen), en injecteer bacteriën. Observeer bloodflow verplaatsing voor een succesvolle injectie.

5. Muis Imaging

1. Verdoven van dieren in de inductie kamer plaats dan elke muis op de imaging platform. Gebruik vet zalven ogen droog terwijl onder narcose voorkomen. Behouden nauwkeurige positionering om kwantitatieve resultaten tussen tijdstippen zorgen.
2. Afbeelding dieren met behulp van de IVIS Spectrum imaging-systeem (Remklauw Life Sciences). Als de beeldvorming meer dan 1 dier, plaats licht barrières tussen hen om cross-illu voorkomenminatie. Dieren moet eerst worden afgebeeld op de buikzijde naar lokalisatie van bacteriën te bevestigen.
3. Afbeelding dieren dorsaal met IVIS elke 2 uur gedurende de duur van het experiment (36 uur). Genereer een tijdsverloop voor een bepaalde ROI.

6. Kwantificeren van Bacteriële Biodistributie

1. Euthanaseren dieren met behulp van CO ₂ en de plaats op de rug op een absorberende luier.
2. Draai het dier de twee achterste flank subcutane tumoren bloot. Snijd de omringende huidweefsel te scheiden en te verwijderen van de tumoren. Houden van de tumor met een pincet, verwijder de huid met behulp van een omgekeerde schaar beweging. Wanneer de meerderheid van de huid is gescheiden, volledig te verwijderen van de tumor met een pincet.
3. Plaats de organen in gewogen microcentrifugebuizen. Aangezien de massa van deze buizen aanzienlijk variëren is het belangrijk voor een pre-wegen van kwantitatieve resultaten.

7. Kwantificeren van Bacteriële Biodistributie

1. Voor elk tijdstip, accijnzen en wegen van de tumoren.
2. Voeg 500 ul PBS + 15% glycerol en homogeniseren met behulp van een Tissue-Tearor (BioSpec). Spoel de homogenisator 3 maal met ethanol tussen de monsters.
3. Genereer seriële verdunningen en plaat voor bacteriële kolonie tellen. Tot op het bord meerdere verdunningen op een enkele plaat gebruik pre-coupes platen.

Resultaten

Met behulp van dit protocol, zijn we in staat om gegevens over de in vivo groei en gen dynamiek expressie van tumor gerichte bacteriën genereren. De algehele werkstroom wordt samengevat in figuur 1.

In de eerste fase, het injecteren we bacteriën (groen) en het dier met behulp van IVIS om genexpressie te meten met luminescentie (blauw) als verslaggever.

Daarna, in de tweede fase, we accijnzen, homogeniseren, en plaat tumoren voor koloniet...

Discussie

Met behulp van deze procedure, zijn we in staat om de tijd cursussen voor de groei en gen dynamiek expressie van bacteriën koloniseren tumoren te genereren. Hoewel deze metingen worden routinematig uitgevoerd in vitro in batch cultuur of microfluïdische apparaten, ze veel moeilijker uit te voeren in vivo.

Er zijn verscheidene modificaties kunnen worden toegepast op deze methoden. Terwijl we de OVCAR-8 cellijn onze muismodellen genereren, kan een aantal andere cellijnen geli...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 ml spuit	BD Biosciences	309602
3/10 cc Insulinspuit	BD Biosciences	309301
PrecisionGlide Naald	BD Biosciences	301629
RPMI Medium 1640 (1X), vloeibaar, met L-glutamine	Invitrogen	11875-119
Ampicilline	Sigma Aldrich	A0166-5G
LB Agar Broth	Sigma Aldrich	L2897
Luria-Bertani bouillon	BD Biosciences	244610