Methodenartikel

Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

DOI:

10.3791/50541

⸱

15 augustus 2013

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cancer and Inflammation Program, National Cancer Institute, 2Basic Science Program, SAIC-Frederick, Inc., 3Departments of Oncology and Radiation Medicine, Georgetown University Medical Center, 4Structural Biophysics Laboratory, National Cancer Institute

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microschaal thermophoresis (MST) op grote schaal kunnen worden gebruikt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten. Het protocol omvat overexpressie van GFP-gefuseerde eiwit, cellyse in niet-denaturerende omstandigheden en detectie van MST signaal in de aanwezigheid van variërende concentraties van het ligand.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantitatieve karakterisering van eiwit interacties is essentieel in vrijwel elk gebied van life sciences, met name drug discovery. De meeste momenteel beschikbare methoden Kd bepaling is toegang tot gezuiverde eiwit van belang, generatie die kan tijdrovend en duur. We hebben een protocol dat het mogelijk maakt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit door microschaal thermophoresis (MST) zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten ontwikkeld. De werkwijze omvat overexpressie van GFP gefuseerde eiwit en cellysis in niet-denaturerende omstandigheden. Toepassing van de methode STAT3-GFP transiënt tot expressie in HEK293 cellen zelf te bepalen voor de eerste maal de affiniteit van de goed onderzochte transcriptiefactor aan oligonucleotiden met verschillende sequenties. Het protocol is eenvoudig en kan een verscheidenheid aan applicatie voor het bestuderen van interacties van eiwitten met kleine moleculen, peptiden, DNA, RNA, en proteins.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kwantitatieve karakterisering van affiniteit van intermoleculaire interacties is belangrijk in veel gebieden van het biomedisch onderzoek. Binding dissociatieconstante (KD) is niet alleen noodzakelijk drug discovery, maar is ook een belangrijke parameter in de karakterisering van een binaire interactie in een biologisch systeem. Biochemische methoden voor detectie van eiwit-eiwit interacties, zoals immunoprecipitatie en gist twee-hybride-screening, niet aan ons van hoe strak zijn die interacties, terwijl affiniteit bepaald of dit complex bestaat onder bepaalde omstandigheden in vivo. In drug discovery proces, bindingassay ontwikkeling is een van d....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bereiding van cellysaat

Dit protocol is bedoeld voor hechtende cellen die geen GFP-gefuseerd eiwit. Benodigd aantal cellen kan variëren van zo laag als 10 6 tot wel 20 x 10 6 cellen, afhankelijk van het niveau van eiwitexpressie. Bijvoorbeeld lysaat van HEK overexpressie GFP-STAT3 werd bereid door cellen gekweekt in T75 kolven 10 tot bijna 70% confluentie met 1 ml lysis buffer. Echter lysaat moest worden verdund 150-voudig tot optimaal niveau van fluorescentie voorzien MST experiment. Cell lysis protocol sterk afhankelijk van de eigenschappen en intracellulaire lokalisatie van het eiwit onderzocht. Bij gebruik van r....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het meten van de affiniteit van de niet-gefosforyleerde STAT3 eiwit binding aan oligonucleotiden.

HEK293 cellen die STAT3-GFP werden gebruikt als een bron van fluorescent gelabelde STAT3 voor DNA-bindingstest. Cellysaten werden bereid met RIPA buffer (20x10 6 cellen / ml). Bij bindingsstudies werden de lysaten verdund 150x MST DNA-binding buffer om het optimale niveau van het fluorescente eiwit in de bindingsreactie (ongeveer 20 nM) verschaffen. Niet-getransfecteerde.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eiwit expressie en zuivering is een omslachtige en dure stap, die echter noodzakelijk voor het bepalen van interactie "K D op meest gebruikelijke methode. Toepassing van MST maakt het vermijden eiwitreiniging dus aanzienlijk vereenvoudigen en te versnellen kwantitatieve karakterisering van interacties. Het presenteert bijzonder belangrijk voordeel bij moeilijk te drukken en te zuiveren eiwitten zoals membraaneiwitten en transcriptiefactoren.

De belangrijkste beperking en eise.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen. De inhoud van deze publicatie geeft niet noodzakelijk de mening of het beleid van het ministerie van Volksgezondheid en Human Services, noch vermelding van handelsnamen, commerciële producten, of organisaties enkele wijze de goedkeuring door de Amerikaanse regering.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de Intramurale Research Program van de NIH, National Cancer Institute, Center for Cancer Research; Collaborative Research Overeenkomst tussen NCI en Calidris Therapeutics; American Cancer Society subsidie ​​IRG 97-152-17 om OT, en federale fondsen van de National Cancer Institute, NIH, onder contract HHSN26120080001E.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
RIPA bufferMillipore20-188Buffers van andere fabrikanten werken ook
Protease inhibitors cocktailSigma-AldrichP2714
Monolith NT.115NanoTemper Technologies GmbHG008
Monolith NT.115 Capillary TrayNanoTemper Technologies GmbHT001
Monolith NT.115 Standard Treated CapillariesNanoTemper Technologies GmbHK002
NT Control softwareNanoTemper Technologies GmbH2.0.2.29
NT Analysis softwareNanoTemper Technologies GmbH1.4.27
Table-top refrigerated centrifugeEppendorf5417RAndere microtube gekoelde centrifuges bieden
Protein LoBind Tube 0.5 mlEppendorf22431064

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lea, W. A., Simeonov, A. Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert. Opin. Drug Discov. 6, 17-32 (2011).
  2. Willander, M., Al-Hilli, S. Analysis of biomolecules using surface plasmons. Methods Mol. Biol. 544, 201-229 (2009).
  3. Hulme....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

GFP gefuseerd eiwitanalyse van cellysaatligandenverdunningsreeksfluorescentiemetingthermophorese experimentSTAT3 GFP transfectieoligonucleotide bindingsassay

Gerelateerde artikelen