Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Summary

Microschaal thermophoresis (MST) op grote schaal kunnen worden gebruikt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten. Het protocol omvat overexpressie van GFP-gefuseerde eiwit, cellyse in niet-denaturerende omstandigheden en detectie van MST signaal in de aanwezigheid van variërende concentraties van het ligand.

Abstract

Kwantitatieve karakterisering van eiwit interacties is essentieel in vrijwel elk gebied van life sciences, met name drug discovery. De meeste momenteel beschikbare methoden _Kd bepaling is toegang tot gezuiverde eiwit van belang, generatie die kan tijdrovend en duur. We hebben een protocol dat het mogelijk maakt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit door microschaal thermophoresis (MST) zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten ontwikkeld. De werkwijze omvat overexpressie van GFP gefuseerde eiwit en cellysis in niet-denaturerende omstandigheden. Toepassing van de methode STAT3-GFP transiënt tot expressie in HEK293 cellen zelf te bepalen voor de eerste maal de affiniteit van de goed onderzochte transcriptiefactor aan oligonucleotiden met verschillende sequenties. Het protocol is eenvoudig en kan een verscheidenheid aan applicatie voor het bestuderen van interacties van eiwitten met kleine moleculen, peptiden, DNA, RNA, en proteins.

Introduction

Kwantitatieve karakterisering van affiniteit van intermoleculaire interacties is belangrijk in veel gebieden van het biomedisch onderzoek. Binding dissociatieconstante _(KD) is niet alleen noodzakelijk drug discovery, maar is ook een belangrijke parameter in de karakterisering van een binaire interactie in een biologisch systeem. Biochemische methoden voor detectie van eiwit-eiwit interacties, zoals immunoprecipitatie en gist twee-hybride-screening, niet aan ons van hoe strak zijn die interacties, terwijl affiniteit bepaald of dit complex bestaat onder bepaalde omstandigheden in vivo. In drug discovery proces, bindingassay ontwikkeling is een van de noodzakelijke en vaak het meest tijdrovende stappen. Meest gebruikte methoden van _Kd bepaling omvatten fluorescentiepolarisatie, ¹ surface plasmon resonance (SPR) technologie, ² radioligand binding, ³ isothermische titratie calorimetrie ⁴ Equilibrium dialyse (ED), ⁵ ultrafiltratie (UF), ⁵ en ultracentrifuge (UC). ⁶ Allemaal vereisen aanzienlijke hoeveelheden gezuiverd doelwit eiwit. Microschaal thermophoresis (MST) is een zich snel ontwikkelende methode die gerichte beweging van moleculen in een microscopische temperatuurgradiënt detecteert. Eventuele wijzigingen van de hydratatie schil van biomoleculen resultaat in een relatieve verandering van beweging langs de temperatuurgradiënt. ⁷ MST wordt gebruikt om bindende affiniteiten te bepalen en is aangevraagd voor het bestuderen van ligand binding aan fluorescent gelabelde eiwitten of fluorescerende liganden aan een doelwit eiwit. ^{8, 9} MST maakt meting van interacties direct in oplossing zonder immobilisatie op een oppervlak (immobilisatie-vrije technologie). Praktisch wordt bindende gepaard met een verandering in het signaal MST, hoewel de grootte van de verandering verschilt van systeem tot systeem sterk. Voor de detectie molecuul verzoek van MST, zij moet fluorescerennt. Deze belangrijke beperking van de methode kan worden omgezet in een voordeel. Wanneer een eiwit tot expressie als een GFP-fusie in een systeem, zal de enige fluorescent molecuul zijn en dus kunnen worden bestudeerd zonder isolatie van het cellysaat of celvrij expressiesysteem. Generatie van cellysaten die het mogelijk maken voor bindende voorwaarden met minimale artefacten is de grote uitdaging. Hier een protocol cellysaat preparaat en MST experiment dat kan worden gebruikt voor vele oplosbare en membraaneiwitten beschrijven we.

STAT eiwitten latente cytoplasmische transcriptiefactor geactiveerd door tyrosine fosforylering in respons op extracellulaire signalen en zijn betrokken bij vele biologische processen zoals immuniteit, hematopoiese, ontsteking en ontwikkeling. ¹⁰ In zoogdieren, de STAT STAT familie bestaat uit 1, 2, 3, 4 , 5A, 5B en 6. Alle geactiveerde STAT's zijn bekend te binden aan dezelfde DNA-sequentie, zogenaamde GAS motief, IFN-gamma geactiveerd sequentie. De transcriptioneel effecten van verschillende STAT's zijn zeer verschillend. ¹¹ Ondanks betrokkenheid bij vele pathologische processen en uitgebreide studies waarbij meer dan 17.000 publicaties hebben de _KD van STAT interacties met andere DNA-sequenties niet vastgesteld. Slechts relatieve affiniteit van verschillende statistieken tot varianten van GAS motief werd gekenmerkt. ¹¹ Moeilijkheden in eiwit expressie en zuivering zijn de belangrijkste belemmeringen in de karakterisering van STAT 'DNA-binding selectiviteit. Hoewel de meeste studies zijn gericht op de rol van "geactiveerde" STAT, die synoniem geworden aan Tyr-gefosforyleerde transcriptiefactor, de rol van niet-gefosforyleerde STAT (U-STAT) in regulatie van transcriptie snel opkomende. ¹² echter deze mechanismen worden slecht begrepen, en het was niet duidelijk of U-STAT daadwerkelijk binden aan DNA of optreden via interacties met andere transcriptiefactoren. We hebben onlangs aangetoond dat de U-STAT3 kan binden aan DNA sequences verschillend van GAS motieven met een nog hogere affiniteit. ¹³ De bevinding heeft belangrijke implicaties voor ons begrip van de biologische functies van deze belangrijke proteïne. We hebben microschaal thermophoresis relatieve affiniteiten van STAT3 bepalen GAS toegepast en AT-rijke oligonucleotide S 100 (figuur 4). Bijna identieke protocol is gebruikt _KD bepaling voor binding van een ander ligand STAT3, een lipopeptide inhibitor. Nr. ¹⁴ binding aan een verbonden transcriptiefactor GFP-STAT1 die werd gebruikt als een negatieve controle worden gedetecteerd hetgeen bevestigt selectiviteit van interactie. ¹⁴

Protocol

1. Bereiding van cellysaat

Dit protocol is bedoeld voor hechtende cellen die geen GFP-gefuseerd eiwit. Benodigd aantal cellen kan variëren van zo laag als 10 ⁶ tot wel 20 x 10 ⁶ cellen, afhankelijk van het niveau van eiwitexpressie. Bijvoorbeeld lysaat van HEK overexpressie GFP-STAT3 werd bereid door cellen gekweekt in T75 kolven 10 tot bijna 70% confluentie met 1 ml lysis buffer. Echter lysaat moest worden verdund 150-voudig tot optimaal niveau van fluorescentie voorzien MST experiment. Cell lysis protocol sterk afhankelijk van de eigenschappen en intracellulaire lokalisatie van het eiwit onderzocht. Bij gebruik van reinigingsmiddelen is ongewenst vanwege eiwit instabiliteit, sonicatie hieronder beschreven, zou de beste keuze zijn. Verschillende additieven kunnen worden toegevoegd aan de lysis buffer eiwitmodificatie reacties te voorkomen EDTA voorkomt fosforylering natriumvanadaat remt tyrosine proteïne fosfatasen, zodatdium fluoride is een remmer van Ser / Thr fosfatasen.

1. Bereid lysebuffer. Om gemakkelijk te extraheren cytoplasmatische eiwitten de volgende samenstelling werkt goed: 25 mM Tris HCl, pH 8,0, en proteaseremmercocktail 100 maal verdund (Sigma-Aldrich P2714, bestaande uit 2 mM AEBSF, 0,3 uM aprotinine, 130 uM bestatine, 1 mM EDTA, 14 uM E-64, 1 uM leupeptine). Als alternatief voor minder oplosbare eiwitten, een commercieel kunnen RIPA buffer gebruiken proteaseremmers cocktail en niet-denaturerende detergenten. Houd de buffer op ijs.
2. Was de cellen kort met ijskoude PBS met behulp van 10 ml buffer per T75 fles. Blijf cellen op ijs gedurende 5 minuten of totdat cellenbegin los van de fles. Schraap cellen met celschraper te halen als dat nodig is.
3. Resuspendeer cellen in 10 ml ijskoude PBS en overbrengen in een voorgekoeld 14 ml ronde bodem centrifugebuis.
4. Pellet cellen door centrifugeren bij 400-600 xg bij 4 ° C gedurende 5 minuten. Combineer cellen van meerdere kolven op dit punt if nodig.
5. Verwijder PBS supernatant en resuspendeer pellet in 200 pl ijskoude lysis buffer, suspensie overbrengen naar een vooraf gekoelde 1,5 ml Eppendorf buisje.
6. Houd cellen op ijs plaatselijke oververhitting te minimaliseren. Lyse cellen met 3x 10 sec pulsen van ultrasoonapparaat op 30% amplitude, met een 2-3 mm pre-gekoelde tip. Houd de punt onder de oppervlakte te minimaliseren schuimen. Sla deze stap over wanneer u een afwasmiddel-bevattende buffer en incubeer op ijs gedurende 30 minuten plaats.
7. Corrigeer de lysaatoplossing aan fysiologische zoutconcentratie (100 mM NaCl), indien nodig met behulp van 5 M NaCl bevatten.
8. Verzamel lysaten door centrifugatie bij 26.000 xg bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
9. Bepaal de optimale lysaat verdunning (zoals beschreven in paragraaf 3 hieronder) en de hoeveelheid lysaat nodig is voor een titratie (meestal rond de 300 pi van pre-verdund lysaat).
10. Aliquot het lysaat en bewaar bij geschikte temperatuur voor het onderzochte eiwit (-80 ° C, in de meeste gevallen).

2. MST Buffer en voorbereiding

1. Aangezien het eiwit-ligand interacties zijn afhankelijk buffer omstandigheden wordt MST buffersamenstelling gekozen op basis van de eigenschappen van een bepaald systeem. Het is in het algemeen voordelig om ten minste twee verschillende buffers testen.
2. Bereid 2 5x MST buffers. We hadden goede ervaringen met deze twee samenstellingen: HEPES (250 mM HEPES, pH 7,4, 25 mM _MgCl2, 500 mM NaCl, 0,25% NP-40) en Tris HCl (250 mM Tris HCl, pH 7,4, 750 mM NaCl, 50 mM _MgCl2, 0,05% Tween-20). Toevoeging van BSA (5% in het uiteindelijke mengsel binding) kan helpen adhesie van eiwitten op kunststof buizen en glazen capillairen te voorkomen. _NaN3 (0,5 mM) zijn mogelijk om de groei van micro-organismen te voorkomen.

3. Bepaling van de optimale verdunning lysaat

1. Selecteer de LED excitatie lichtbron met de golflengte λ = 470 nm van de MST instrument.
2. Laad capillairen met de cell extract verdund 2 en 10x met MST buffer.
3. Presteren "Zoek Haarvaten" operatie op Control Software van MST instrument. De optimale fluorescentie assortiment in verdunde lysaat is van 400 tot 1500 fluorescentie-eenheden.

4. Het bepalen van de optimale Ligand Concentratiebereik

1. De hoogste concentratie van het ligand moet minstens 20x hoger dan de verwachte dissociatieconstante.
2. De laagste concentratie ligand moet lager zijn dan de molaire concentratie van het fluorescerende eiwit.

Raadpleeg de NanoTemper Technologies Concentratie Finder tool voor het ligand concentratiegebied schatting.

5. Bereiding van cellysaat en Ligand Verdunningen

1. Plaats een buis rek met een benodigde aantal (meestal 10-16) van 0,5 ml LoBind centrifuge buizen op ijs. Pipetteer 25 ul MST buffer naar de bodem van elke buis. Voeg 25 ul van de ligand stockoplossing aan de eerste kuipe (# 1, ligand hoogste concentratie) en voer seriële tweevoudige verdunning van de ligand met de overige buizen. Houd het rek met ligand monsters op ijs.
2. Dooi cellysaat langzaam op ijs.
3. Verdun cellysaat met MST buffer om het optimale niveau van het fluorescente doeleiwit in de bindingsreacties verschaffen. Uiteindelijke eiwitconcentratie te dicht bij verwachte K _D of lager. Het moet worden aangepast om benodigde aantal fluorescentie tellingen vinden in de uiteindelijke oplossing. Voor de bepaling van GFP-concentratie STAT3 in het lysaat werd het instrument gekalibreerd met behulp van fluoresceïne. De molaire concentratie van GFP in het lysaat werd bepaald met de verhouding van fluoresceïne en EGFP kwantumopbrengsten, 0,85 en 0,61 respectievelijk. ¹⁵

6. Microschaal thermophoresis Binding Studies

1. Selecteer de LED excitatiebron met λ = 470 nm van de MST instrument.
2. Plaats 0,5 ml LoBind buizen in de tube rack tegenover buizen met ligand seriële verdunning monsters. Voeg voorzichtig 15 ul cellysaat van de aan de bodem van elke buis. Probeer niet te pijpwanden raken om te proeven verlies te voorkomen.
3. Voeg 15 ul van de ligand monster met de hoogste concentratie (nr. 1) op de overeenkomstige buis # 1 met het cellysaat. Meng goed en wijzigen van een pipet tip. Herhaal deze stap voor de overige buizen behalve de laatste, waarbij geen ligand bevatten.
4. Voeg 15 ul van buffer MST de laatste buis en meng.
5. Vul ongeveer 2/3 van de eerste capillair met bindende mengsel van buis # 1, kantelen om de oplossing te verplaatsen naar het midden, en plaats het capillair op de capillaire lade om de positie # 1 (de dichtst mogelijke positie van de opening tray) . Herhaal deze stap met de rest haarvaten. Capillair uiteinden kunnen worden aangesloten met wax voor langere experimenten.
6. Plaats de lade in de MST-instrument en de deur van het instrument te sluiten.
7. Presteren "Zoek Haarvaten"commando te laten het instrument te vinden exacte posities van de haarvaten en meet de fluorescentie van de monsters.
8. Op basis van de fluorescentie-intensiteit van het signaal, passen de LED-vermogen (10-100%) om het in 400-1,500 eenheden interval brengen.
9. Klik op de knop "Start" om de thermophoresis experiment uit te voeren. Meer dan een IR-laservermogen kan het experiment worden gekozen om de optimale temperatuurgradiënt voor het specifieke systeem. Gegevensverzameling 2-3 runs voor dezelfde set van capillairen om de reproduceerbaarheid van metingen te garanderen. Het duurt 10-12 minuten om een ​​set van 16 capillairen lopen.

7. Microschaal thermophoresis Data Analysis

1. Open de Analysis software.
2. Laad de projectmap. In het verschenen Information Run Viewer selecteren verzameld op een bepaald IR laservermogen thermophoretic bochten. Er is een optie van het openen van alle thermophoretic sporen onder verschillende omstandigheden, zoals IR-laser macht verzameld, LED-power, temperatuur, concentratie, etc. in een keer en dan te kiezen voor alle curves voor analyse door het inschakelen hen aan en uit (klik op de naam van het experiment).
3. In de Evaluatie Points grafiek venster selecteert u de thermophoresis of thermophoresis met T-sprong. Zorgen dat blauwe en rode lijnen juist gepositioneerd zijn. Om de gemiddelde punten met standaarddeviaties te verkrijgen, selecteert u "Gemiddeld" of "Onderscheiden loopt" voor afzonderlijke runs.
4. Om een ​​dissociatie constante pasvorm plot, selecteer "Gebruik Gemiddeld", voer en bevestig de gelabelde molecuul concentratie waarde (controleer de "concentratie" plein in een vlaag venster menu), en past de curve. De K _D-waarde met zijn standaardafwijking verschijnt in een apart informatie pop-up venster. Om een ​​fit met Hill-methode plot, selecteer "Gemiddeld", Hill-methode, en dan past de curve. De EC ₅₀ waarde affiniteit met standaardafwijking wordt in dit geval. Het kenmerk van _KD of Hill "border" kan ook worden gebruikt bij verzadigingin een gebonden toestand niet wordt bereikt.
5. Sla de gemiddelde fit data in een tekstbestand en overbrengen naar Excel.
6. Plot F _norm (genormaliseerde fluorescentie), AF _norm (verschil in genormaliseerde fluorescentie als verschillende experimenten worden vergeleken) of gebonden fractie (zie onderstaande formule) als functie van de gemerkte (getitreerd) molecuul concentratie.

Fraction Bound (fractie van moleculen in een complex) = (Therm (C)-gebonden) / (bound-gebonden), waarbij Therm (C) is thermophoresis gemeten voor de concentratie C, ongebonden is thermophoresis de ongebonden toestand (wanneer moleculen niet in een complex), en gebonden is thermophoresis voor het volledig gebonden toestand.

Results

Het meten van de affiniteit van de niet-gefosforyleerde STAT3 eiwit binding aan oligonucleotiden.

HEK293 cellen die STAT3-GFP werden gebruikt als een bron van fluorescent gelabelde STAT3 voor DNA-bindingstest. Cellysaten werden bereid met RIPA buffer (20x10 ⁶ cellen / ml). Bij bindingsstudies werden de lysaten verdund 150x MST DNA-binding buffer om het optimale niveau van het fluorescente eiwit in de bindingsreactie (ongeveer 20 nM) verschaffen. Niet-getransfecteerde...

Discussion

Eiwit expressie en zuivering is een omslachtige en dure stap, die echter noodzakelijk voor het bepalen van interactie "K _D op meest gebruikelijke methode. Toepassing van MST maakt het vermijden eiwitreiniging dus aanzienlijk vereenvoudigen en te versnellen kwantitatieve karakterisering van interacties. Het presenteert bijzonder belangrijk voordeel bij moeilijk te drukken en te zuiveren eiwitten zoals membraaneiwitten en transcriptiefactoren.

De belangrijkste beperking en eise...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RIPA buffer	Millipore	20-188	Buffers van andere fabrikanten werken ook
Protease inhibitors cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies GmbH	G008
Monolith NT.115 Capillary Tray	NanoTemper Technologies GmbH	T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries	NanoTemper Technologies GmbH	K002
NT Control software	NanoTemper Technologies GmbH	2.0.2.29
NT Analysis software	NanoTemper Technologies GmbH	1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge	Eppendorf	5417R	Andere microtube gekoelde centrifuges bieden
Protein LoBind Tube 0.5 ml	Eppendorf	22431064