Eiwitzuivering-vrij bindwijze affiniteit Bepaling door Microschaal thermophoresis

Summary

Microschaal thermophoresis (MST) op grote schaal kunnen worden gebruikt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten. Het protocol omvat overexpressie van GFP-gefuseerde eiwit, cellyse in niet-denaturerende omstandigheden en detectie van MST signaal in de aanwezigheid van variërende concentraties van het ligand.

Abstract

Kwantitatieve karakterisering van eiwit interacties is essentieel in vrijwel elk gebied van life sciences, met name drug discovery. De meeste momenteel beschikbare methoden _Kd bepaling is toegang tot gezuiverde eiwit van belang, generatie die kan tijdrovend en duur. We hebben een protocol dat het mogelijk maakt voor de bepaling van de bindingsaffiniteit door microschaal thermophoresis (MST) zonder zuivering van het doelwit eiwit uit cellysaten ontwikkeld. De werkwijze omvat overexpressie van GFP gefuseerde eiwit en cellysis in niet-denaturerende omstandigheden. Toepassing van de methode STAT3-GFP transiënt tot expressie in HEK293 cellen zelf te bepalen voor de eerste maal de affiniteit van de goed onderzochte transcriptiefactor aan oligonucleotiden met verschillende sequenties. Het protocol is eenvoudig en kan een verscheidenheid aan applicatie voor het bestuderen van interacties van eiwitten met kleine moleculen, peptiden, DNA, RNA, en proteins.

Introduction

Kwantitatieve karakterisering van affiniteit van intermoleculaire interacties is belangrijk in veel gebieden van het biomedisch onderzoek. Binding dissociatieconstante _(KD) is niet alleen noodzakelijk drug discovery, maar is ook een belangrijke parameter in de karakterisering van een binaire interactie in een biologisch systeem. Biochemische methoden voor detectie van eiwit-eiwit interacties, zoals immunoprecipitatie en gist twee-hybride-screening, niet aan ons van hoe strak zijn die interacties, terwijl affiniteit bepaald of dit complex bestaat onder bepaalde omstandigheden in vivo. In drug discovery proces, bindingassay ontwikkeling is een van d....

Protocol

1. Bereiding van cellysaat

Dit protocol is bedoeld voor hechtende cellen die geen GFP-gefuseerd eiwit. Benodigd aantal cellen kan variëren van zo laag als 10 ⁶ tot wel 20 x 10 ⁶ cellen, afhankelijk van het niveau van eiwitexpressie. Bijvoorbeeld lysaat van HEK overexpressie GFP-STAT3 werd bereid door cellen gekweekt in T75 kolven 10 tot bijna 70% confluentie met 1 ml lysis buffer. Echter lysaat moest worden verdund 150-voudig tot optimaal niveau van fluorescentie voorzien MST experiment. Cell lysis protocol sterk afhankelijk van de eigenschappen en intracellulaire lokalisatie van het eiwit onderzocht. Bij gebruik van r....

Results

Het meten van de affiniteit van de niet-gefosforyleerde STAT3 eiwit binding aan oligonucleotiden.

HEK293 cellen die STAT3-GFP werden gebruikt als een bron van fluorescent gelabelde STAT3 voor DNA-bindingstest. Cellysaten werden bereid met RIPA buffer (20x10 ⁶ cellen / ml). Bij bindingsstudies werden de lysaten verdund 150x MST DNA-binding buffer om het optimale niveau van het fluorescente eiwit in de bindingsreactie (ongeveer 20 nM) verschaffen. Niet-getransfecteerde.......

Discussion

Eiwit expressie en zuivering is een omslachtige en dure stap, die echter noodzakelijk voor het bepalen van interactie "K _D op meest gebruikelijke methode. Toepassing van MST maakt het vermijden eiwitreiniging dus aanzienlijk vereenvoudigen en te versnellen kwantitatieve karakterisering van interacties. Het presenteert bijzonder belangrijk voordeel bij moeilijk te drukken en te zuiveren eiwitten zoals membraaneiwitten en transcriptiefactoren.

De belangrijkste beperking en eise.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
RIPA buffer	Millipore	20-188	Other manufacturer's buffers work as well
Protease inhibitors cocktail	Sigma-Aldrich	P2714
Monolith NT.115	NanoTemper Technologies GmbH	G008
Monolith NT.115 Capillary Tray	NanoTemper Technologies GmbH	T001
Monolith NT.115 Standard Treated Capillaries	NanoTemper Technologies GmbH	K002
NT Control software	NanoTemper Technologies GmbH	2.0.2.29
NT Analysis software	NanoTemper Technologies GmbH	1.4.27
Table-top refrigerated centrifuge	Eppendorf	5417R	Other microtube refrigerated centrifuges providing
Protein LoBind Tube 0.5 ml	Eppendorf	22431064