Lokalisatie en relatieve kwantificering van koolstofnanobuizen in cellen met multispectrale beeldvorming en doorstromende cytometrie

Samenvatting

In deze studie was het belangrijkste doel om de cellulaire opname en uiteindelijke exocytose van koolstofnanobuizen (CNT's) te monitoren. Vanuit dit perspectief stelden we hier een unieke methode voor die gebruikmaakt van multispectrale beeldvorming en stromende cytometrie, waardoor een kwantificering en lokalisatie van CNT's in een statistisch relevant aantal cellen mogelijk is.

Samenvatting

Koolstofgebaseerde nanomaterialen, zoals koolstofnanobuizen (CNT's), behoren tot dit type nanodeeltjes dat zeer moeilijk te onderscheiden is van koolstofrijke celstructuren en de facto er is nog steeds geen kwantitatief methode om hun verdeling op cel- en weefselniveau te beoordelen. Wat we hier voorstellen is een innovatieve methode die de detectie en kwantificering van CNT's in cellen mogelijk maakt met behulp van een multispectrale beeldvormende flowcytometer (ImageStream, Amnis). Dit nieuw ontwikkelde apparaat integreert zowel een hoge doorvoer van cellen als hoge resolutie beeldvorming, waardoor beelden voor elke cel direct in stroom worden verkregen en daarom statistisch relevante beeldanalyse mogelijk is. Elke celbeeld wordt verkregen op helderveld (BF), donkerveld (DF) en fluorescente kanalen, die respectievelijk toegang geven tot het niveau en de verdeling van lichtabsorptie, verstrooid licht en fluorescentie voor elke cel. De analyse bestaat vervolgens in een pixel-voor-pixel vergelijking van elk beeld, van de 7.000-10.000 cellen die voor elke conditie van het experiment zijn verkregen. Lokalisatie en kwantificering van CNT's wordt mogelijk gemaakt dankzij enkele bijzondere intrinsieke eigenschappen van CNT's: sterke lichtabsorptie en verstrooiing; inderdaad verschijnen CNT's als sterk geabsorbeerde donkere vlekken op BF en heldere vlekken op DF met een nauwkeurige colocalisatie.

Deze methodologie zou een aanzienlijke impact kunnen hebben op onderzoek naar interacties tussen nanomaterialen en cellen, aangezien dit protocol toepasbaar is voor een breed scala aan nanomaterialen, voor zover ze licht voldoende kunnen absorberen (en/of verstrooien).

Inleiding

Gedurende de laatste decennia is de plaats van nanodeeltjes steeds belangrijker geworden in een breed scala aan toepassingen. Met name koolstofnanobuizen (CNT's) worden steeds meer onderzocht als nanotools voor diverse diagnostische en therapeutische toepassingen; dankzij hun specifieke elektrische, thermische en spectroscopische eigenschappen kunnen CNT's fungeren als transportmiddelen voor verschillende medicijnen of contrastmiddelen, of ook betrokken zijn bij weefselengineering¹.

Er zijn echter nog steeds zorgen over de mogelijke toxiciteit van dergelijke nanomaterialen, vooral omdat het lot van CNT's in het organisme erg controversieel blijft. Er is inderdaad een gebrek aan geschikte methoden om ze in levende cellen en weefsels te detecteren en te kwantificeren: bijvoorbeeld, technieken zoals Raman-spectroscopie, foto-akoestische en nabij-infrarood fotoluminescentie-beeldvorming zijn voorgesteld, maar elke methode vertoont beperkingen afhankelijk van het type nanobuis en/of hun omgeving^2-8.

Hier kan de voorgestelde methode toepasbaar zijn voor de detectie en kwantificering van nanodeeltjes in cellen. Dit werd mogelijk gemaakt door het gebruik van ImageStream, een apparaat dat zowel flowcytometrie als hoogwaardige beeldvorming combineert. Het koppelt de voordelen van het verzamelen van een groot aantal cellen (tot 5000 gebeurtenissen/sec) - en de voordelen van statistische gegevens en hoge resolutiebeelden van elke cel tegelijkertijd (ruimtelijke resolutie van 0,5 μm). Over het algemeen worden beelden verzameld met behulp van een CCD-camera en zijn het een tweedimensionale grijstintweergave van de cel. Het licht wordt gekwantificeerd voor elk pixel in het beeld en identificeert zowel de intensiteit als de locatie van zowel fluorescentie als componenten met een subcellulair formaat (bijvoorbeeld in BF), waardoor een krachtige mogelijkheid ontstaat om cellen te onderscheiden op basis van hun uiterlijk^9,10. 

Het doel was hier om een nanometrie-methode te ontwerpen die een kwantitatieve beoordeling van de verdeling en het gedrag van CNT's in cellen mogelijk zou maken. In het bijzonder werd deze methode ontwikkeld om de cellulaire opname, verwerking en exocytose van CNT's door cellen te bestuderen. We hebben eerst het complexe cellulaire verkeer van CNT's aangetoond en ten tweede de overdracht van deze nanomaterialen tussen cellen: cel-geïnternaliseerde CNT's ontsnappen aan hun gastheercellen wanneer ze gestrest zijn, verspreiden zich in de extracellulaire ruimte en worden opnieuw geïnternaliseerd door naïeve cellen, of ze nu homotypisch of heterotypisch zijn¹¹

.

Eerder onderzoek toonde aan dat verschillende mechanismen van celopname, ofwel actieve of passieve, kunnen optreden, afhankelijk van CNT-functionalisatie en aggregatietoestand¹². Hier werden de meerwandige CNT's gefunctionaliseerd door middel van 1,3-dipolaire cycloadditie en amidatie en vervolgens gederivatiseerd met een fluorescerende sonde, fluoresceïne isothiocyanate (FITC). Bij transmissie-elektronenmicroscopie lijken ze te worden geïnternaliseerd door cellen, hetzij individueel met cytosolische lokalisatie of als bundels, meestal gevonden in endosomale en lysosomale compartimenten¹¹. Op ImageStream verschijnen de geclusterde CNT's met een hoge correlatie als donkere vlekken op BF en heldere vlekken op DF, waardoor een duidelijk onderscheid mogelijk is tussen CNT-gelabelde cellen en controlecellen. Aan de andere kant was de verdeling van het fluorescente signaal uitgezonden door de fluorescente marker gefunctionaliseerd met CNT's niet zo goed gecolocaliseerd: inderdaad, waarschijnlijk vanwege een quenching-fenomeen, komen de groene fluorescente vlekken niet noodzakelijkerwijs overeen met de vlekken op BF en DF. Dit geeft aan dat, ten eerste, een fluorescente sonde niet verplicht is voor de detectie van CNT's met de ImageStream, en ten tweede - a fortiori - dat het niet volledig representatief is voor zowel kwantificering als lokalisatie van CNT's.

Naast het geven van een statistische relatieve kwantificering van nanodeeltjes, biedt deze methode ook informatie over de lokalisatie van CNT's in cellen, wat betekent dat het onderscheid maakt, bijvoorbeeld, CNT's in het binnenste van de cel versus die welke gebonden zijn aan het plasmamembraan. Het vermogen om CNT's op celbeelden te lokaliseren, overwint duidelijk de beperking van conventionele flowcytometrie-analyse¹³. De procedure werd hier ontwikkeld via de creatie van maskers die passen bij specifieke regio's van de cel en ook de donkere vlekken selecteren die overeenkomen met geladen CNT's.

Over het algemeen kan deze methode worden toegepast voor een groot aantal experimenten waarbij de visualisatie of kwantificering in cellen noodzakelijk is, op voorwaarde dat de gebruikte nanodeeltjes in staat zijn om het licht sterk te absorberen (en/of te verstrooien).

Protocol

1. Bereiding van in water dispergeerbare koolstofnanobuizen (CNT's)

1. Disperge eerst CNT's in celcultuurwater, voordat je ze 20 min. soniceert in een waterbad sonicator bij 20 °C. Als CNT's gefunctionaliseerd zijn met een fluorescerende sonde, bescherm ze dan zo veel mogelijk tegen licht gedurende het hele experiment.

2. Labels aanbrengen op cellen met CNT's

1. Laat humane navelstrengveneuze endotheelcellen (HUVEC) (bijvoorbeeld) groeien op platen van 25 cm² in DMEM-medium, dat 10% foetaal bovien serum en 1% penicilline-streptomycine bevat.
2. Maak oplossingen van CNT's bij een concentratie van 0, 10, 20 en 50 µg/ml in compleet medium en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 20 uur of bij 4 ° C gedurende 20 uur (2 ml van CNT-suspensie voor een 25 cm² plaat).

3. Celfixatie

1. Verwijder het incubatiemedium daarna; spoel cellen met PBS, trypsiniseer en suspendeer cellen in compleet DMEM-medium. Centrifugeer gedurende 5 min. bij 1.200 rpm.
2. Vervang het medium eerst door paraformaldehyde 4% gedurende 1 uur bij 4 ° C, en vervolgens door PBS om ze te bewaren. Indien nodig, kunnen cellen in dit stadium van het proces gedurende enkele dagen bij 4 ° C worden opgeslagen tot de cytometrie-analyse.
3. Elk monster moet ongeveer 10⁶ cellen bevatten, geconcentreerd in 50 µl van PBS. Suspendeer ze correct om aggregaten tijdens de analyse te voorkomen en filter ze door een 50 μm maas zeef.
   Opmerking: Elke stap moet zeer voorzichtig worden uitgevoerd om cellen te behouden.

4. ImageStream-acquisitie

Gebruik de multispectrale beeldstromingscytometer ImageStream om beelden van cellen te verkrijgen.
Er moet aan een aantal punten worden gedacht:

1. Selecteer een aangepaste vergroting (hier wordt een 40X objectief gebruikt).
2. Indien fluorochromen worden gebruikt:
   - bereid een controlemonster zonder fluorochroom voor.
   - bereid cellen voor met een enkele-kleur positieve controle voor elk fluorochroom dat gebruikt wordt naast uw monsters.
3. Gebruik de laser 488 nm om de FITC te exciteren en het kanaal 02 om de fluorescentie emissie te verzamelen (band-pass 480-560 nm). Gebruik daarnaast ook de kanalen 01 en 06 voor het heldere veld (BF) en donkere veld (DF) respectievelijk.

5. Post-verwerking - IDEAS Analyse Software (Versie 4.0)

1. Onder alle verkregen gebeurtenissen moet de analyse eerst worden beperkt tot de populatie van enkele cellen: gebruik een biparametrische stipplot die 'aspect ratio' (d.w.z. breedte/hoogte) weergeeft versus 'celgebied' (parameters toegepast op cellen op BF) (Figuur 1). Enkele cellen die zijn opgenomen in het gebied van belang met een standaard oppervlakte en aspect ratio dicht bij 1 worden dan onderscheiden van multicellulaire gebeurtenissen (grote oppervlakte en kleine aspect ratio) en puin (extreem kleine oppervlakte).
2. Gebruik een biparametrische stipplot voor gefocuste cellen met een hoog contrast om cellen in het scherpstellen vlak te selecteren: plot de 'contrast' versus de 'RMS gradiënt' (die de scherpte kwaliteit van een beeld meet) op de BF afbeelding - het staat de uitsluiting toe van onscherpe cellen die zowel een lage rms gradiënt en een lage contrast in hun BF beelden laten zien (Figuur 1).
3. 1. Bepaal de parameter die de beste statistische scheiding tussen gelabelde en niet-gelabelde cellen biedt door 'vind de beste functie' te gebruiken. In onze studie is het gemiddelde pixel object kenmerk de parameter die het meest geschikt is (Figuur 2).
   2. Traceer een histogram met behulp van deze parameter versus de genormaliseerde frequentie om de hoeveelheid opgenomen CNT's voor geteste concentraties te vergelijken (Figuur 3).
   3. Traceer de biparametrische grafiek 'gemiddelde pixel object op BF' (Notatie: Gemiddeld Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01) versus 'intensiteit op DF' (Intensiteit_MC_Ch06), om de correlatie tussen deze twee parameters te bestuderen (Figuur 4).
4. De kwantificering wordt ook beoordeeld met behulp van maskers:
   1. Aangezien CNT's zich als sterk absorberende donkere vlekken op BF manifesteren, maak eerst een drempelmasker dat ze precies past door een beperkt bereik van pixels met een lage intensiteit te selecteren, bevat tussen 0-533 in deze studie (Masker 1, notatie: Intensiteit(M01, BF, 0-533)) (Figuur 5). De keuze van de drempelintensiteit wordt gemaakt op gelabelde cellen in vergelijking met de controlecellen.
   2. Maak daarnaast ook een masker dat past bij de pixels met hoge intensiteit (150-4095 in dit geval) van de DF (Masker 2, notatie: Intensiteit (M06, DF, 150-4095)) (Figuur 6).
   3. Plot een grafiek met behulp van het gebied van het masker (1 of 2; (notatie: Area_Intensiteit(M01, BF, 0-533) voor masker 1): het zal een relatieve kwantificering van de internalisatie van CNT's bij verschillende concentraties geven (Figuur 7).
   4. Controleer de mate van correlatie tussen deze twee maskers (dankzij de biparametrische plot 'oppervlakte

Resultaten

Een overzicht van het principe van het ImageStream-apparaat wordt gegeven in Figuur 1. Het produceert meerdere hoge resolutie beelden van elke cel in flow, inclusief helder veld (BF), donker veld (DF of zijgespreid licht), en fluorescentiekanaal(s), zoals geexemplificeerd in Figuur 2 met drie verschillende cellen gelabeld met CNTs. De overlays van deze kanalen worden ook getoond, op het eerste gezicht de correlatie illustratieverende.

Aangezien alle post-processing analyse gebaseerd is op celbeeldvorming, is de selectie van gefocuste cellen cruciaal voor de studie (Figuur 3). Eigenlijk induceert de aanwezigheid van CNTs veranderingen op zowel het contrast als de gradiënt vergeleken met niet-gelabelde cellen: gefocuste cellen, die een belangrijke hoeveelheid CNTs hebben geïnternaliseerd, hebben de neiging een lage rms-gradiënt te hebben (wat gewoonlijk de unieke parameter is die gebruikt wordt voor de discriminatie van gefocuste versus niet-gefocuste cellen) maar ook een belangrijk contrast, wat verklaart waarom een biparametrische plot essentieel is. Op Figuur 3 wordt de discriminatie getoond tussen niet-gefocuste (gele gebied) versus gefocuste cellen (blauwe gebied).

In cel geïnternaliseerde CNTs zijn duidelijk onderscheidbaar - vooral op BF verschijnend als sterk absorberende donkere vlekken (zie het effect van diverse labelconcentraties, Figuur 4). Bovendien werd het gemiddelde pixelsignaal op BF geanalyseerd, waardoor een relatieve kwantificering van de opname gegeven werd: grafieken op Figuur 5 tonen de significante toename met de CNT-labelconcentratie (resultaten voor ongeveer 7.000 cellen per experimentele conditie).

Ten tweede is kwantificering van CNTs ook mogelijk door het gebruik van maskers, toegepast hetzij op een beperkt bereik van donkere pixels van de BF of op de pixels van hoge intensiteit van de DF (zie voorbeelden op Figuur 6), overeenkomend met de vlekken resulterend uit de aanwezigheid van CNTs. Het plotten van het gebied van deze maskers stelt dus zowel de toename van de opname in de spotlight (geexemplificeerd op Figuur 7 met het gebied van het masker op BF, selecterend pixels variërend van 0-533).

Daarnaast kan de correlatie tussen vlekken op BF en DF geëvalueerd worden door het plotten van de DF-intensiteit versus het gemiddelde pixelsignaal op BF (zoals in Figuur 8) (masker-onafhankelijke analyse) of het gebied van het masker op BF (Masker 1) versus het gebied op DF (Masker 2).

Met betrekking tot de procedure gecreëerd voor de lokalisatie van CNTs binnen de cellen, toont Figuur 9A de verschillende maskers die zijn gemaakt. Merk op dat de robuustheid van de lokalisatiemaskers (gebaseerd op erosie van standaardcelmasker) visueel moet worden gecontroleerd op een verzameling gelabelde en niet-gelabelde cellen. Dezelfde maskers worden voor alle monsters gebruikt.

Het plotten van het totale gebied van zwarte vlekken op de celmembraan versus dat op de gehele cel geeft een score van internalisatie voor cellen die gedurende 20 uur zijn geïncubeerd bij 37 °C in vergelijking met 2 uur incubatie bij 4 °C (zie Figuur 9B); het geeft aan dat CNTs meestal op het membraan zijn gelokaliseerd bij 4 °C, terwijl bij 37 °C CNTs in meer dan 90% van de cellen zijn geïnternaliseerd.

Ten slotte betreffende de fluorescentie, werd deze parameter niet gebruikt als indicator voor de kwantificering van CNTs vanwege een te lage correlatie tussen fluorescente vlekken en vlekken op BF (en DF). Inderdaad, de correlatie tussen de FITC-intensiteit en het gemiddelde pixelsignaal op helder veld geeft een Pearson-correlatiecoëfficiënt van -0,2 aan. Op Figuur 10 worden twee gevallen geïllustreerd, waarin het fluorescentie signaal goed of niet overeenkomt met de zwarte vlek op helder veld.

Figuur 1. Overzicht van de ImageStream- algemene werking. Het multispectrale beeldvormingssysteem verwerft maximaal 12 beelden/cel in drie verschillende modi: helder veld, donker veld en fluorescentie. De opstelling bestaat uit 5 excitatielasers, inclusief 405, 488, 560 en 658 nm. Licht wordt verzameld van de cellen die in de cuvet stromen met verschillende objectieven (in deze studie werd het 40X objectief gebruikt) en doorgegeven aan het spectrale ontbindingselement, dat bestaat uit een set langdoorlaatfilters in een hoekarray. De CCD-camera die celbeelden verzamelt wordt bediend met een techniek genaamd time-delay-integration om beeldstreping te voorkomen. Uitgebreide scherptediepte (EDF) is een optie.

Figuur 2. Beeldgalerij van cellen gelabeld met koolstofnanobuizen (50 μg/mL) gevangen door ImageStream door middel van diverse kanalen (Helder Veld (BF), Donker veld (DF), fluorescentie (FITC), en hun overlays). CNTs opgesloten binnen intracellulaire

Discussie

1. Wijziging en probleemoplossing

In deze studie was het eerste doel om de hoeveelheid en lokalisatie van CNT's in cellen te evalueren. De confocale microscopie zou a priori de gouden methode kunnen zijn om de intracellulaire verdeling van CNT's gefunctionaliseerd met de fluorescerende marker FITC^8,14 te beoordelen. Echter, het grootste nadeel is de beperking tot beeldvorming van enkele cellen en daarom een gebrek aan statistisch relevante gegevens. De ImageStream maakt werk mogelijk buiten deze obstakels: door het screenen van een groot aantal cellen (5.000-10.000) in een korte tijd (

In vergelijking met conventionele flowcytometrie is het unieke voordeel van ImageStream om multispectrale beelden van elke cel te leveren en een pixel per pixel vergelijking van signaalintensiteit. Dus combineert ImageStream de statistische kracht van hoogdoorvoer flowcytometrie met de analytische voordelen van confocale beeldvorming voor elke geanalyseerde cel. Het is cruciaal voor een label-vrije relatieve kwantificering en lokalisatie van CNT's in cellen.

2. Kritische stappen binnen het protocol

De kritieke stap bestaat uit de keuze van de parameters die het meest geschikt zijn voor elke studie. In ons geval was de beste manier om de analyse te baseren op de absorptie- en verstrooiingseigenschappen van de nanobuizen: de goede correlatie tussen de lokalisatie van donkere vlekken op BF en heldere vlekken op DF ondersteunt dat de ontwikkelde methode relevant en betrouwbaar is - en mogelijk niet zou zijn geweest zonder celafbeeldingen.

3. Beperkingen van de techniek

Het moet worden benadrukt dat de visualisatie van CNT's in cellen alleen mogelijk was omdat ze de neiging hebben om zich te accumuleren in endosomale intracellulaire blaasjes, en dan verschijnen als sterke absorberende en verstrooiende vlekken. Individuele nanobuizen mogen niet worden gedetecteerd op basis van deze methode, terwijl het uiteindelijk op fluorescentie zou kunnen worden gedetecteerd, wat een duidelijke beperking vormt. Ten tweede is de kwantificering niet 'absoluut', maar relatief voor verschillende labelconcentraties en in vergelijking met de controle ongelabelde cellen. Sommige kwantitatieve kenmerken (gemiddelde pixel, intensiteit, etc.) zijn absolute parameters, terwijl andere afhankelijk zijn van de keuze van de maskers (drempelmasker, lokalisatiemaskers).

4. Betekenis ten opzichte van bestaande methoden

Met betrekking tot fluorescentie, benadrukt de ImageStream-analyse de slechte colocalisatie van CNT-clusters tussen FITC helder signaal en vlekken op de andere kanalen. Daarom lijkt het erop dat fluorescentie geen betrouwbare indicator was voor de kwantificering en lokalisatie van CNT's. Desondanks, door de beperking van conventionele flowcytometrie, die voornamelijk gebaseerd is op fluorescentie kwantificering, overwint de multispectrale hoogdoorvoer ImageStream de weg voor een statistische label-vrije kwantificering, terwijl het de lokalisatie van koolstofnanobuizen in de cellen biedt.

5. Toekomstige toepassingen

Deze hoogdoorvoer statistische nanometrologie methode zou kunnen worden gegeneraliseerd naar alle nanomaterialen, die een hoge absorptie en verstrooiing van licht vertonen bij interactie met cellen. Daarom kan het belangrijke toepassingen hebben voor onderzoeken naar de nano-bio-interface, nanotoxicologie en nanogeneeskunde.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ImageStream	Amnis