In deze studie was het belangrijkste doel om de cellulaire opname en uiteindelijke exocytose van koolstofnanobuizen (CNT's) te monitoren. Vanuit dit perspectief stelden we hier een unieke methode voor die gebruikmaakt van multispectrale beeldvorming en stromende cytometrie, waardoor een kwantificering en lokalisatie van CNT's in een statistisch relevant aantal cellen mogelijk is.
Methodenartikel
Lokalisatie en relatieve kwantificering van koolstofnanobuizen in cellen met multispectrale beeldvorming en doorstromende cytometrie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Koolstofgebaseerde nanomaterialen, zoals koolstofnanobuizen (CNT's), behoren tot dit type nanodeeltjes dat zeer moeilijk te onderscheiden is van koolstofrijke celstructuren en de facto er is nog steeds geen kwantitatief methode om hun verdeling op cel- en weefselniveau te beoordelen. Wat we hier voorstellen is een innovatieve methode die de detectie en kwantificering van CNT's in cellen mogelijk maakt met behulp van een multispectrale beeldvormende flowcytometer (ImageStream, Amnis). Dit nieuw ontwikkelde apparaat integreert zowel een hoge doorvoer van cellen als hoge resolutie beeldvorming, waardoor beelden voor elke cel direct in stroom worden verkregen en daarom statistisch relevante beeldanalyse mogelijk is. Elke celbeeld wordt verkregen op helderveld (BF), donkerveld (DF) en fluorescente kanalen, die respectievelijk toegang geven tot het niveau en de verdeling van lichtabsorptie, verstrooid licht en fluorescentie voor elke cel. De analyse bestaat vervolgens in een pixel-voor-pixel vergelijking van elk beeld, van de 7.000-10.000 cellen die voor elke conditie van het experiment zijn verkregen. Lokalisatie en kwantificering van CNT's wordt mogelijk gemaakt dankzij enkele bijzondere intrinsieke eigenschappen van CNT's: sterke lichtabsorptie en verstrooiing; inderdaad verschijnen CNT's als sterk geabsorbeerde donkere vlekken op BF en heldere vlekken op DF met een nauwkeurige colocalisatie.
Deze methodologie zou een aanzienlijke impact kunnen hebben op onderzoek naar interacties tussen nanomaterialen en cellen, aangezien dit protocol toepasbaar is voor een breed scala aan nanomaterialen, voor zover ze licht voldoende kunnen absorberen (en/of verstrooien).
Inleiding
Gedurende de laatste decennia is de plaats van nanodeeltjes steeds belangrijker geworden in een breed scala aan toepassingen. Met name koolstofnanobuizen (CNT's) worden steeds meer onderzocht als nanotools voor diverse diagnostische en therapeutische toepassingen; dankzij hun specifieke elektrische, thermische en spectroscopische eigenschappen kunnen CNT's fungeren als transportmiddelen voor verschillende medicijnen of contrastmiddelen, of ook betrokken zijn bij weefselengineering1.
Er zijn echter nog steeds zorgen over de mogelijke toxiciteit van dergelijke nanomaterialen, vooral omdat het lot van CNT's in het organisme erg controversieel blijft. Er is inderdaad een gebrek aan geschikte methoden om ze in levende cellen en weefsels te detecteren en te kwantificeren: bijvoorbeeld, technieken zoals Raman-spectroscopie, foto-akoestische en nabij-infrarood fotoluminescentie-beeldvorming zijn voorgesteld, maar elke methode vertoont beperkingen afhankelijk van het type nanobuis en/of hun omgeving2-8.
Hier kan de voorgestelde methode toepasbaar zijn voor de detectie en kwantificering van nanodeeltjes in cellen. Dit werd mogelijk gemaakt door het gebruik van ImageStream, een apparaat dat zowel flowcytometrie als hoogwaardige beeldvorming combineert. Het koppelt de voordelen van het verzamelen van een groot aantal cellen (tot 5000 gebeurtenissen/sec) - en de voordelen van statistische gegevens en hoge resolutiebeelden van elke cel tegelijkertijd (ruimtelijke resolutie van 0,5 μm). Over het algemeen worden beelden verzameld met behulp van een CCD-camera en zijn het een tweedimensionale grijstintweergave van de cel. Het licht wordt gekwantificeerd voor elk pixel in het beeld en identificeert zowel de intensiteit als de locatie van zowel fluorescentie als componenten met een subcellulair formaat (bijvoorbeeld in BF), waardoor een krachtige mogelijkheid ontstaat om cellen te onderscheiden op basis van hun uiterlijk9,10.
Het doel was hier om een nanometrie-methode te ontwerpen die een kwantitatieve beoordeling van de verdeling en het gedrag van CNT's in cellen mogelijk zou maken. In het bijzonder werd deze methode ontwikkeld om de cellulaire opname, verwerking en exocytose van CNT's door cellen te bestuderen. We hebben eerst het complexe cellulaire verkeer van CNT's aangetoond en ten tweede de overdracht van deze nanomaterialen tussen cellen: cel-geïnternaliseerde CNT's ontsnappen aan hun gastheercellen wanneer ze gestrest zijn, verspreiden zich in de extracellulaire ruimte en worden opnieuw geïnternaliseerd door naïeve cellen, of ze nu homotypisch of heterotypisch zijn11
.
Eerder onderzoek toonde aan dat verschillende mechanismen van celopname, ofwel actieve of passieve, kunnen optreden, afhankelijk van CNT-functionalisatie en aggregatietoestand12. Hier werden de meerwandige CNT's gefunctionaliseerd door middel van 1,3-dipolaire cycloadditie en amidatie en vervolgens gederivatiseerd met een fluorescerende sonde, fluoresceïne isothiocyanate (FITC). Bij transmissie-elektronenmicroscopie lijken ze te worden geïnternaliseerd door cellen, hetzij individueel met cytosolische lokalisatie of als bundels, meestal gevonden in endosomale en lysosomale compartimenten11. Op ImageStream verschijnen de geclusterde CNT's met een hoge correlatie als donkere vlekken op BF en heldere vlekken op DF, waardoor een duidelijk onderscheid mogelijk is tussen CNT-gelabelde cellen en controlecellen. Aan de andere kant was de verdeling van het fluorescente signaal uitgezonden door de fluorescente marker gefunctionaliseerd met CNT's niet zo goed gecolocaliseerd: inderdaad, waarschijnlijk vanwege een quenching-fenomeen, komen de groene fluorescente vlekken niet noodzakelijkerwijs overeen met de vlekken op BF en DF. Dit geeft aan dat, ten eerste, een fluorescente sonde niet verplicht is voor de detectie van CNT's met de ImageStream, en ten tweede - a fortiori - dat het niet volledig representatief is voor zowel kwantificering als lokalisatie van CNT's.
Naast het geven van een statistische relatieve kwantificering van nanodeeltjes, biedt deze methode ook informatie over de lokalisatie van CNT's in cellen, wat betekent dat het onderscheid maakt, bijvoorbeeld, CNT's in het binnenste van de cel versus die welke gebonden zijn aan het plasmamembraan. Het vermogen om CNT's op celbeelden te lokaliseren, overwint duidelijk de beperking van conventionele flowcytometrie-analyse13. De procedure werd hier ontwikkeld via de creatie van maskers die passen bij specifieke regio's van de cel en ook de donkere vlekken selecteren die overeenkomen met geladen CNT's.
Over het algemeen kan deze methode worden toegepast voor een groot aantal experimenten waarbij de visualisatie of kwantificering in cellen noodzakelijk is, op voorwaarde dat de gebruikte nanodeeltjes in staat zijn om het licht sterk te absorberen (en/of te verstrooien).
Protocol
1. Bereiding van in water dispergeerbare koolstofnanobuizen (CNT's)
- Disperge eerst CNT's in celcultuurwater, voordat je ze 20 min. soniceert in een waterbad sonicator bij 20 °C. Als CNT's gefunctionaliseerd zijn met een fluorescerende sonde, bescherm ze dan zo veel mogelijk tegen licht gedurende het hele experiment.
2. Labels aanbrengen op cellen met CNT's
- Laat humane navelstrengveneuze endotheelcellen (HUVEC) (bijvoorbeeld) groeien op platen van 25 cm² in DMEM-medium, dat 10% foetaal bovien serum en 1% penicilline-streptomycine bevat.
- Maak oplossingen van CNT's bij een concentratie van 0, 10, 20 en 50 µg/ml in compleet medium en incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 20 uur of bij 4 ° C gedurende 20 uur (2 ml van CNT-suspensie voor een 25 cm² plaat).
3. Celfixatie
- Verwijder het incubatiemedium daarna; spoel cellen met PBS, trypsiniseer en suspendeer cellen in compleet DMEM-medium. Centrifugeer gedurende 5 min. bij 1.200 rpm.
- Vervang het medium eerst door paraformaldehyde 4% gedurende 1 uur bij 4 ° C, en vervolgens door PBS om ze te bewaren. Indien nodig, kunnen cellen in dit stadium van het proces gedurende enkele dagen bij 4 ° C worden opgeslagen tot de cytometrie-analyse.
- Elk monster moet ongeveer 106 cellen bevatten, geconcentreerd in 50 µl van PBS. Suspendeer ze correct om aggregaten tijdens de analyse te voorkomen en filter ze door een 50 μm maas zeef.
Opmerking: Elke stap moet zeer voorzichtig worden uitgevoerd om cellen te behouden.
4. ImageStream-acquisitie
Gebruik de multispectrale beeldstromingscytometer ImageStream om beelden van cellen te verkrijgen.
Er moet aan een aantal punten worden gedacht:
- Selecteer een aangepaste vergroting (hier wordt een 40X objectief gebruikt).
- Indien fluorochromen worden gebruikt:
- bereid een controlemonster zonder fluorochroom voor.
- bereid cellen voor met een enkele-kleur positieve controle voor elk fluorochroom dat gebruikt wordt naast uw monsters. - Gebruik de laser 488 nm om de FITC te exciteren en het kanaal 02 om de fluorescentie emissie te verzamelen (band-pass 480-560 nm). Gebruik daarnaast ook de kanalen 01 en 06 voor het heldere veld (BF) en donkere veld (DF) respectievelijk.
5. Post-verwerking - IDEAS Analyse Software (Versie 4.0)
- Onder alle verkregen gebeurtenissen moet de analyse eerst worden beperkt tot de populatie van enkele cellen: gebruik een biparametrische stipplot die 'aspect ratio' (d.w.z. breedte/hoogte) weergeeft versus 'celgebied' (parameters toegepast op cellen op BF) (Figuur 1). Enkele cellen die zijn opgenomen in het gebied van belang met een standaard oppervlakte en aspect ratio dicht bij 1 worden dan onderscheiden van multicellulaire gebeurtenissen (grote oppervlakte en kleine aspect ratio) en puin (extreem kleine oppervlakte).
- Gebruik een biparametrische stipplot voor gefocuste cellen met een hoog contrast om cellen in het scherpstellen vlak te selecteren: plot de 'contrast' versus de 'RMS gradiënt' (die de scherpte kwaliteit van een beeld meet) op de BF afbeelding - het staat de uitsluiting toe van onscherpe cellen die zowel een lage rms gradiënt en een lage contrast in hun BF beelden laten zien (Figuur 1).
-
- Bepaal de parameter die de beste statistische scheiding tussen gelabelde en niet-gelabelde cellen biedt door 'vind de beste functie' te gebruiken. In onze studie is het gemiddelde pixel object kenmerk de parameter die het meest geschikt is (Figuur 2).
- Traceer een histogram met behulp van deze parameter versus de genormaliseerde frequentie om de hoeveelheid opgenomen CNT's voor geteste concentraties te vergelijken (Figuur 3).
- Traceer de biparametrische grafiek 'gemiddelde pixel object op BF' (Notatie: Gemiddeld Pixel_Object (M01,Ch01,Tight)_Ch01) versus 'intensiteit op DF' (Intensiteit_MC_Ch06), om de correlatie tussen deze twee parameters te bestuderen (Figuur 4).
- De kwantificering wordt ook beoordeeld met behulp van maskers:
- Aangezien CNT's zich als sterk absorberende donkere vlekken op BF manifesteren, maak eerst een drempelmasker dat ze precies past door een beperkt bereik van pixels met een lage intensiteit te selecteren, bevat tussen 0-533 in deze studie (Masker 1, notatie: Intensiteit(M01, BF, 0-533)) (Figuur 5). De keuze van de drempelintensiteit wordt gemaakt op gelabelde cellen in vergelijking met de controlecellen.
- Maak daarnaast ook een masker dat past bij de pixels met hoge intensiteit (150-4095 in dit geval) van de DF (Masker 2, notatie: Intensiteit (M06, DF, 150-4095)) (Figuur 6).
- Plot een grafiek met behulp van het gebied van het masker (1 of 2; (notatie: Area_Intensiteit(M01, BF, 0-533) voor masker 1): het zal een relatieve kwantificering van de internalisatie van CNT's bij verschillende concentraties geven (Figuur 7).
- Controleer de mate van correlatie tussen deze twee maskers (dankzij de biparametrische plot 'oppervlakte
Resultaten
Een overzicht van het principe van het ImageStream-apparaat wordt gegeven in Figuur 1. Het produceert meerdere beelden met een hoge resolutie van elke cel in de flow, waaronder bright-field (BF), dark-field (DF of zijwaarts verstrooid licht) en fluorescentiekanalen, zoals geïllustreerd in Figuur 2 met drie verschillende cellen gelabeld met CNT's. De overlays van deze kanalen worden ook getoond, wat in eerste instantie de correlatie illustreert.
Aangezien alle analyses tijdens de post-processing gebaseerd zijn op celbeeldvorming, is de selectie van in focus liggende cellen cruciaal voor de studie (Figuur 3). In feite induceert de aanwezigheid van CNT's veranderingen in zowel het contrast als de gradiënt in vergelijking met niet-gelabelde cellen: cellen in focus, die een aanzienlijke hoeveelheid CNT's hebben geïnternaliseerd, hebben de neiging een lage rms-gradiënt te hebben (wat gewoonlijk de enige parameter is die wordt gebruikt voor het onderscheid tussen cellen in focus versus cellen buiten focus), maar ook een aanzienlijk contrast, wat verklaart waarom een biparametrische plot essentieel is. In Figuur 3 wordt het onderscheid getoond tussen cellen buiten focus (geel gebied) versus cellen in focus (blauw gebied).
In de cel opgenomen CNT's zijn duidelijk te onderscheiden - met name in BF, waar ze verschijnen als sterk absorberende donkere vlekken (zie het effect van diverse labelingsconcentraties, Figuur 4). Bovendien werd het gemiddelde pixelsignaal in BF geanalyseerd, wat een relatieve kwantificering van de opname opleverde: de grafieken in Figuur 5 tonen een significante toename naarmate de CNT-labelingsconcentratie stijgt (resultaten voor ongeveer 7.000 cellen per experimentele conditie).
Ten tweede is kwantificering van CNT's ook mogelijk door het gebruik van maskers, die worden toegepast op ofwel een beperkt bereik van donkere pixels van de BF, of op de pixel met een hoge intensiteit van de DF (zie voorbeelden in Figuur 6), overeenkomend met de vlekken die resulteren uit de aanwezigheid van CNT's. Door het oppervlak van deze maskers uit te zetten, kan zowel de aanwezigheid als de toename van de opname worden gehighlight (geïllustreerd in Figuur 7 met het oppervlak van het masker op BF, waarbij pixels variërend van 0-533 zijn geselecteerd).
Daarnaast kan de correlatie tussen spots op BF en DF worden geëvalueerd door de DF-intensiteit uit te zetten tegen het gemiddelde BF-pixelsignaal (zoals in Figuur 8) (maskeronafhankelijke analyse) of de oppervlakte van het masker op BF (Masker 1) tegenover de oppervlakte op DF (Masker 2).
Wat betreft de procedure die is ontwikkeld voor de lokalisatie van CNT's in de cellen, toont Figuur 9A de verschillende maskers die zijn aangemaakt. Let erop dat de robuustheid van de lokalisatiemaskers (gebaseerd op erosie van het standaard celmasker) visueel moet worden gecontroleerd op een verzameling gelabelde en ongelabelde cellen. Dezelfde maskers worden gebruikt voor alle monsters.
Het uitzetten van het totale oppervlak van zwarte vlekken op het celmembraan tegenover dat op de gehele cel geeft een score voor internalisatie voor cellen die gedurende 20 uur bij 37 °C zijn geïncubeerd in vergelijking met een incubatie van 2 uur bij 4 °C (zie Figuur 9B); dit geeft aan dat CNT's bij 4 °C zich voornamelijk op het membraan bevinden, terwijl CNT's bij 37 °C in meer dan 90% van de cellen zijn geïnternaliseerd.
Ten slotte met betrekking tot de fluorescentie: deze parameter werd niet gebruikt als indicator voor de kwantificering van CNT's vanwege een te lage correlatie tussen fluorescentiepuntjes en puntjes in BF (en DF). In feite geeft de correlatie tussen de FITC-intensiteit en de gemiddelde pixelwaarde van het bright field een Pearson-correlatiecoëfficiënt van -0,2 aan. In Figuur 10 worden twee gevallen geïllustreerd waarin het fluorescentiesignaal wel of niet correct overeenkomt met de zwarte stip in het bright field.
Figuur 1. Overzicht van de algemene werking van de ImageStream.Het multispectrale imaging-systeem legt tot 12 beelden per cel vast in drie verschillende modi: brightfield, darkfield en fluorescentie. De opstelling bestaat uit 5 excitatie-lasers, waaronder 405, 488, 560 en 658 nm. Licht wordt verzameld van de cellen die door de cuvette stromen met verschillende objectieflenzen (in deze studie werd de 40X objectieflens gebruikt) en doorgegeven aan het spectrale decompositie-element, dat bestaat uit een set langpassfilters in een hoekige array. De CCD-camera die celbeelden verzamelt, werkt met een techniek genaamd time-delay-integration om beeldstrepen te voorkomen. Extended depth of field (EDF) is een optie.
Figuur 2. Beeldengalerij van cellen gelabeld met koolstofnanobuisjes (50 μg/mL) vastgelegd door ImageStream via diverse kanalen (helderveld (BF), donkerveld (DF), fluorescentie (FITC) en hun overlays). CNTs opgesloten in intracellulaire lysosomen verschijnen als grote zwarte stippen op helderveldbeelden. Omgekeerd creëren ze heldere stippen op de donkerveld- en fluorescentiebeelden.
Figuur 3. Selectie van cellen in focus. Een bivariate dotplot die de root mean square (rms) gradiënt tegenover het contrast op BF-beelden weergeeft, maakt het mogelijk om onscherpe cellen uit te sluiten. Hier vertegenwoordigt het gele gebied de onscherpe cellen, terwijl de cellen in focus in het blauw zijn weergegeven. De onscherpe cellen worden gekenmerkt door zowel een laag contrast als een lage gradiënt rms op het bright field-beeld. Naast de rms-gradiënt is de contrastkenmerk vereist om cellen in focus te onderscheiden na hun labeling met CNTs.
Figuur 4. Dosisafhankelijke opname van CNT's gevisualiseerd door ImageStream. Het aantal en de oppervlakte van de zwarte stippen op de brightfield-beelden nemen toe met de dosis CNT's tijdens incubatie met cellen (variërend van 0-50 µg/ml). Let op dat de controlecellen geen zwarte stippen vertonen.
Figuur 5. Relatieve kwantificatie van CNT-opname op basis van de brightfield-beelden.Histogrammen van de gemiddelde pixelkenmerken toegepast op het "object"-masker met de gehele cel tonen duidelijk een dosisafhankelijk gedrag, dat gebruikt kan worden voor kwantificatie. Het R9-bereik omsluit de CNT-positieve cellen.
Figuur 6. Creatie van maskers voor het selecteren van zwarte vlekken op BF-beelden en heldere vlekken op DF-beelden. Aangezien CNT's verschijnen als sterk absorberende donkere vlekken op het BF-beeld, wordt een drempelmasker gemaakt om een beperkt bereik van pixels met een lage intensiteit te selecteren, in deze studie tussen 0-533 (Masker 1, notatie: Intensity(M01, BF, 0-533)). Omgekeerd wordt een masker dat past bij de pixels met een hoge intensiteit (in dit geval 150-4095) op het DF-beeld (Masker 2, notatie: Intensity (M06, DF, 150-4095)) gebruikt om heldere vlekken op DF te selecteren, die overeenkomen met gebieden met een hoge verstrooiing.
Figuur 7. Dosisafhankelijke opname van CNT's wordt aangetoond door kwantificatie van het oppervlak van de zwarte vlekken op BF-beelden. Door een drempelmasker (mask 1) toe te passen op de BF-beelden, kan het oppervlak van de zwarte vlekken per cel worden gekwantificeerd, wat een dosisafhankelijke verdeling laat zien.
Figuur 8. CNT-kwantificeringsmethoden op basis van BF- (absorptie) en DF- (verstrooiing) beelden zijn gecorreleerd. Links is de gemiddelde pixel op het BF-beeld versus de intensiteit op het DF-beeld weergegeven, wat een goede correlatie laat zien voor cellen gelabeld met CNT's (50 µg/ml) (Pearson-correlatiecoëfficiënt r = -0,68). Rechts is het oppervlak van het masker dat de donkere vlekken op BF past versus het oppervlak van het masker dat de lichte vlekken op DF past weergegeven voor cellen gelabeld met CNT's (50 µg/ml). De Pearson-correlatiecoëfficiënt is r = -0,83. Waarden van 7.000 cellen zijn uitgezet.
Figuur 9. Lokalisatie van CNT in cellen met behulp van specifieke maskers. (A) Er zijn maskers gemaakt die passen bij een specifieke locatie van de cel, namelijk van links naar rechts - de gehele cel, alleen het membraan en het binnenste van de cel. Een ander masker past op zwarte vlekken dankzij een drempelintensiteit (Masker 1, notatie: Intensity(M01, BF, 0-533)). (B) De beoordeling van de lokalisatie van CNTs kan worden verkregen door het oppervlak van de zwarte vlekken op verschillende lokalisaties van de cellen te meten met behulp van de in A beschreven lokalisatiemaskers. Incubatie met CNTs (50 µg/ml) werd uitgevoerd bij zowel 37 °C als bij 4 °C om het internalisatiepad te remmen. De grafiek die het zwarte oppervlak op het membraan tegenover het zwarte oppervlak op de gehele cel weergeeft, toont een dosisafhankelijke absorptie van CNTs op het membraan bij 4 °C, terwijl de volledige internalisatie van CNTs effectief is bij 37 °C.
Figuur 10. Colocalisatie van door CNT geïnduceerde zwarte stippen op BF met fluorescentie heldere vlekken op de FITC-afbeelding. De heldere fluorescentievlekken zijn niet altijd gecolocaliseerd met de zwarte stippen op BF. Ze komen correct overeen voor de eerste twee getoonde cellen, maar niet voor de laatste twee cellen.
Discussie
1. Wijziging en probleemoplossing
In deze studie was het eerste doel om de hoeveelheid en lokalisatie van CNT's in cellen te evalueren. De confocale microscopie zou a priori de gouden methode kunnen zijn om de intracellulaire verdeling van CNT's gefunctionaliseerd met de fluorescerende marker FITC8,14 te beoordelen. Echter, het grootste nadeel is de beperking tot beeldvorming van enkele cellen en daarom een gebrek aan statistisch relevante gegevens. De ImageStream maakt werk mogelijk buiten deze obstakels: door het screenen van een groot aantal cellen (5.000-10.000) in een korte tijd (
In vergelijking met conventionele flowcytometrie is het unieke voordeel van ImageStream om multispectrale beelden van elke cel te leveren en een pixel per pixel vergelijking van signaalintensiteit. Dus combineert ImageStream de statistische kracht van hoogdoorvoer flowcytometrie met de analytische voordelen van confocale beeldvorming voor elke geanalyseerde cel. Het is cruciaal voor een label-vrije relatieve kwantificering en lokalisatie van CNT's in cellen.
2. Kritische stappen binnen het protocol
De kritieke stap bestaat uit de keuze van de parameters die het meest geschikt zijn voor elke studie. In ons geval was de beste manier om de analyse te baseren op de absorptie- en verstrooiingseigenschappen van de nanobuizen: de goede correlatie tussen de lokalisatie van donkere vlekken op BF en heldere vlekken op DF ondersteunt dat de ontwikkelde methode relevant en betrouwbaar is - en mogelijk niet zou zijn geweest zonder celafbeeldingen.
3. Beperkingen van de techniek
Het moet worden benadrukt dat de visualisatie van CNT's in cellen alleen mogelijk was omdat ze de neiging hebben om zich te accumuleren in endosomale intracellulaire blaasjes, en dan verschijnen als sterke absorberende en verstrooiende vlekken. Individuele nanobuizen mogen niet worden gedetecteerd op basis van deze methode, terwijl het uiteindelijk op fluorescentie zou kunnen worden gedetecteerd, wat een duidelijke beperking vormt. Ten tweede is de kwantificering niet 'absoluut', maar relatief voor verschillende labelconcentraties en in vergelijking met de controle ongelabelde cellen. Sommige kwantitatieve kenmerken (gemiddelde pixel, intensiteit, etc.) zijn absolute parameters, terwijl andere afhankelijk zijn van de keuze van de maskers (drempelmasker, lokalisatiemaskers).
4. Betekenis ten opzichte van bestaande methoden
Met betrekking tot fluorescentie, benadrukt de ImageStream-analyse de slechte colocalisatie van CNT-clusters tussen FITC helder signaal en vlekken op de andere kanalen. Daarom lijkt het erop dat fluorescentie geen betrouwbare indicator was voor de kwantificering en lokalisatie van CNT's. Desondanks, door de beperking van conventionele flowcytometrie, die voornamelijk gebaseerd is op fluorescentie kwantificering, overwint de multispectrale hoogdoorvoer ImageStream de weg voor een statistische label-vrije kwantificering, terwijl het de lokalisatie van koolstofnanobuizen in de cellen biedt.
5. Toekomstige toepassingen
Deze hoogdoorvoer statistische nanometrologie methode zou kunnen worden gegeneraliseerd naar alle nanomaterialen, die een hoge absorptie en verstrooiing van licht vertonen bij interactie met cellen. Daarom kan het belangrijke toepassingen hebben voor onderzoeken naar de nano-bio-interface, nanotoxicologie en nanogeneeskunde.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door ANR P2N (Nanother project 2010-NANO-008-04), door de regio Ile de France (contractnr. E539), en door CNRS. Open Access werd betaald door EMD Millipore.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| ImageStream |  Amnis |
Referenties
- Kostarelos, K., Bianco, A., Prato, M. Promises, facts and challenges for carbon nanotubes in imaging and therapeutics. Nat. Nano. 4, 627-633 (2009).
- De La Zerda, A., et al. Carbon nanotubes as photoacoustic molecular imaging agents in living mice. Nat. Nano. 3, 557-562 (2008).
- Zavaleta, C., et al. Noninvasive Raman Spectroscopy in Living Mice for Evaluation of Tumor Targeting with Carbon Nanotubes. Nano Lett. 8, 2800-2805 (2008).
- Tong, L., et al. Label-free imaging of semiconducting and metallic carbon nanotubes in cells and mice using transient absorption microscopy. Nat. Nano. 7, 56-61 (2012).
- Welsher, K., et al. A route to brightly fluorescent carbon nanotubes for near-infrared imaging in mice. Nat. Nano. 4, 773-780 (2009).
- Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. Size dependent cellular uptake and expusion of single-wall carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. ACS Nano. 3, 149-158 (2009).
- Al-Jamal, K. T., et al. Cellular uptake mechanisms of functionalised multi-walled carbon nanotubes by 3D electron tomography imaging. Nanoscale. 3, 2627-2635 (2011).
- Reuel, N. F., Dupont, A., Thouvenin, O., Lamb, D. C., Strano, M. S. Three-Dimensional Tracking of Carbon Nanotubes within Living Cells. ACS Nano. 6, 5420-5428 (2012).
- Phanse, Y., Ramer-Tait, A. E., Friend, S. L., Carrillo-Conde, B., Lueth, P., Oster, C. J., et al. Analyzing Cellular Internalization of Nanoparticles and Bacteria by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (64), e3884(2012).
- Qian, F., Montgomery, R. R. Quantitative Imaging of Lineage-specific Toll-like Receptor-mediated Signaling in Monocytes and Dendritic Cells from Small Samples of Human Blood. J. Vis. Exp. (62), e3741(2012).
- Marangon, I., et al. Intercellular Carbon Nanotube Translocation Assessed by Flow Cytometry Imaging. Nano Lett. 12, 4830-4837 (2012).
- Lacerda, L., et al. Translocation mechanisms of chemically functionalised carbon nanotubes across plasma membranes. Biomaterials. 33, 3334-3343 (2012).
- Al-Jamal, K. T., Kostarelos, K. Methods in Molecular Biology. Balasubramanian, K., Burghard, M. 625, Humana Press. 123-124 (2010).
- Zhou, F., et al. New Insights of Transmembranal Mechanism and Subcellular Localization of Noncovalently Modified Single-Walled Carbon Nanotubes. Nano Lett. 10, 1677-1681 (2010).
Herprints en machtigingen
