Test Monsters voor het optimaliseren van STORM superresolutietechnieken

Summary

We beschrijven de bereiding van drie monsters en hoe ze kunnen worden gebruikt voor het optimaliseren en de prestatie van microscopen STORM beoordelen. Met behulp van deze voorbeelden laten we zien hoe ruwe data te verwerven en vervolgens te verwerken tot super-resolutie beelden te verwerven in cellen van ongeveer 30-50 nm resolutie.

Abstract

STORM is een recent ontwikkelde super-resolutie microscopie techniek met tot 10 keer betere resolutie dan standaard fluorescentie microscopie technieken. Echter, zoals de afbeelding in een heel andere manier wordt verkregen dan normaal, door het opbouwen van een beeld molecuul-by-molecuul, zijn er enkele belangrijke uitdagingen voor de gebruikers in een poging om hun imago acquisitie optimaliseren. Om dit proces te helpen en meer inzicht krijgen in hoe STORM werkt presenteren we de bereiding van 3 proefmonsters en de methodologie van het verwerven en verwerken van STORM super-resolutie beelden met typische resoluties van tussen 30-50 nm. Door de proefnemingen bij het gebruik van de vrij beschikbare regenbui processing software is het mogelijk om een ​​grote hoeveelheid informatie over de beeldkwaliteit en resolutie te verkrijgen. Met behulp van deze statistieken is het dan mogelijk om de beeldvorming procedure optimaliseren van de optica, de voorbereiding, kleurstof keuze, buffer omstandigheden, en beeldacquisitie instellingen proeven. We eenLSO tonen voorbeelden van een aantal veel voorkomende problemen die resulteren in een slechte beeldkwaliteit, zoals zijdelingse drift, waar het monster beweegt tijdens beeldacquisitie en dichtheid gerelateerde problemen resulterend in de 'mislocalization' fenomeen.

Introduction

Onlangs zijn ontwikkeld een reeks optische microscopie technieken, typisch aangeduid als superresolutietechnieken of nanoscopy die de diffractie limiet kan omzeilen en genereren beelden met een resolutie van 100 nm of beter ^1,2. Sinds de aankondiging van de super-resolutie microscopie als de Nature Methods methode van het jaar in 2008, is er een groot deel van de ontwikkeling van lokalisatie gebaseerde microscopen. Zo zijn er veelkleurige toepassingen ^3-6, 3D implementaties ^7-12 en zelfs levende cellen toepassingen ^5,13-17. Bovendien, omdat deze systemen worden gecommercialiseerd en maken nu hun weg naar buiten van de optica laboratoria in de handen van celbiologen is er waarschijnlijk een verdere toename van het gebruik en de toepassing van biomedische vragen zijn.

Een tak van deze familie is de lokalisatie-gebaseerde methoden die werken door het opbouwen van een beeld molecuul-by-molecuul. IkTen einde dit te doen, moet de meerderheid van fluorescerende moleculen in het monster worden uitgeschakeld, zodat slechts enkele ruimtelijk gescheiden moleculen actief tegelijk. Deze moleculen worden dan snel en uitgeschakeld en vele beelden worden genomen, zodat een aanzienlijk deel van de bevolking wordt afgebeeld op de onderliggende structuur met sub-diffractie nauwkeurig weerspiegelen. Een aantal benaderingen zijn gepubliceerd inclusief GSDIM ^18, PALM ^19, fPALM ^20, STORM ²¹ en RESOLFT ^22. Algoritmen die de positie van een enkel molecuul detectie meten kan dan worden gebruikt om de actuele positie van het molecuul te lokaliseren met precisie beter dan 20 nm Gaussian fitting ^23, bijvoorbeeld rapidSTORM ^24,25 QuickPALM ^26, palm3d ¹² en ²⁷ regenbui. Bij beeldvorming cel of andere biologische monsters, die een hoge molecuul dichtheid hebben, is het daarom noodzakelijk om vele duizenden frames van te nemendeze knippert, ruimtelijk gescheiden, signaal zijn om het imago van een aanzienlijk deel van de gelabelde moleculen.

Stochastische optische reconstructie microscopie (STORM) en sterk verwante dSTORM en GSDIM methoden lokalisatie-gebaseerde superresolutie methoden die zijn aangetoond om met commercieel beschikbare organische kleurstoffen ^21. Ze zijn sindsdien is aangetoond voor een aantal verschillende kleurstoffen ^28-30, waarbij de methode bijzonder aantrekkelijk vanwege de specificiteit en relatieve gemak van gevestigde immunokleuring benaderingen fluorescentie microscopie maakt zijn. Bijgevolg is er een gemakkelijke toegang tot een scala van kleurstof-antilichaam en dye-biomolecuul conjugaten, die het potentieel om gebruikt te worden in-lokalisatie gebaseerde super-resolutie beeldvorming hebben. Hoewel de algemene beginselen van STORM en soortgelijke benaderingen zijn relatief eenvoudig, en op het eerste gezicht de hardware en monstervoorbereiding lijken relatief straightforward, zijn er een aantal stappen in het proces dat stelligen van hoge kwaliteit, artefactvrij, super-resolutie beelden zijn.

Zoals met alle microscopische technieken het proces kan worden gezien in 3 stappen: eerst, monstervoorbereiding, tweede, beeldacquisitie en ten derde, beeldverwerking en / of beeldanalyse en interpretatie. De extra oplossend vermogen en de methode voor het genereren super-resolutie beelden met behulp van een lokalisatie aanpak introduceert een aantal nieuwe problemen en overwegingen ^31-33. Vanaf monstervoorbereiding, bij het uitvoeren immunokleuring, met name indirecte immunofluorescentie wanneer een primair en secundair antilichaam combinatie wordt gebruikt, moet worden opgemerkt dat de fluorescente kleurstof tot 20 nm van het molecuul van belang kan zijn. Bij microtubuli, resulteert dit in diameters van 35-50 nm vergeleken met een verwachte microtubule diameter van 25 nm ^28,30. Ook moet de etikettering dichtheid mEet de Nyquist criteria om een hoge beeldkwaliteit ¹⁴ genereren. Bijvoorbeeld voor een verwachte beeldresolutie van 20 nm langs een filamenteuze structuur moet er een kleurstof molecuul ten minste elke 10 nm ²⁷ zijn. Hoewel veel kleurstoffen zijn gepubliceerd werken voor lokalisatie gebaseerde nadert de algemene prestaties van de kleurstof is een mengsel van ten minste vier belangrijke criteria, namelijk gedetecteerde fotonen per schakelen gebeurtenis (de helderheid per blink - helderder is beter), het evenwicht op -off duty cycle (de contrast ratio van kleurstoffen in de off versus op de staatstelevisie - meer off is over het algemeen beter), de overleving fractie (een laag bleken tarief is beter) en het aantal schakelingen (het aantal knipperingen per fluorofor - meer is beter voor hoge resolutie, hoewel 1 knipperen per fluorophore een voordeel voor molecuul tellen doeleinden kan zijn). De situatie wordt verder gecompliceerd door het feit dat deze eigenschappen voor een bepaalde kleurstof kan variëren in verschillende bufferomstandigheden enmet laservermogen ^28,29. Bovendien, en deze unieke STORM overwegingen beeldkwaliteit kan worden verbeterd door het optimaliseren monstervoorbereiding op dezelfde wijze als traditionele fluorescentie microscopie technieken bijvoorbeeld door het minimaliseren autofluorescentie door modificatie van fixatie omstandigheden en het gebruik van quenching reagentia. Ook minimaliseert niet-specifiek gebonden fluoroforen is belangrijk, dat kan worden gedaan door het aanpassen label concentraties incubatietijden en blokkeren en wasstappen.

De tweede stap van het beeld overname is ook kritisch. De optimale instellingen van de microscoop afhankelijk van de kleurstof, bufferomstandigheden, etikettering dichtheid en monster type, bijvoorbeeld monolagen op glas, cellen of weefselmonsters. De belangrijkste overwegingen zijn camera belichtingstijd, framenummer, verlichting hoek (TIRF, Hilo, Epi) en laservermogen. Het doel is om zoveel mogelijk helder ruimtelijk gescheiden knippert zo snel mogelijk te verzamelen. Als de achtergrond is zeer hoge of knippert niet erg helder, dus de signaal-ruisverhouding is slecht, het reconstructie-algoritme niet in staat om de posities nauwkeurig lokaliseren. Naast maximaliseren van de lokalisatie precisie, dus de nauwkeurigheid elk molecuul positie kan worden gemeten, de beeldkwaliteit ook afhankelijk van een groot aantal lokalisaties. Indien het aantal van de moleculen van belang zijn afgebeeld, hetzij als gevolg van slechte labelingsefficiëntie, overmatige fotobleking of een inadequate framenummer beeld om vervolgens de resulterende super-resolutie zal punctata en discontinue als Nyquist criteria niet zal zijn voldaan ^14,27 .

En ten derde stap beeldverwerking is vooral belangrijk in vergelijking met conventionele fluorescentiemicroscopie technieken. Er is een reeks van vrij en commercieel beschikbare algoritmen, die zowel een voordeel in termen van keuze, en een nadeel, omdat het kan verwarrend weten waarin het meest geschikt is om te gebruiken. Als bijvoorbeeld de ruwe data is goed gespreid ruimtelijk onderscheiden knippert dan een single-molecule fitting algoritme kan zeer nauwkeurig en efficiënt, bijvoorbeeld door de spaarzame montage algoritmes beschikbaar in Stortbui ²⁷ rapidSTORM ^24,25, palm3d ¹² en QuickPALM ²⁶ software . Als de ruwe gegevens bevat veel overlappende signalen dan algoritmes geschikter kunnen zijn omvatten DAOSTORM ^34, 3B en ³⁵ deconSTORM ^36. Bovendien zijn deze algoritmen bevatten drempels voor verschillende criteria zoals signaal telt of fotonen per knipperen, alsmede diverse beeldweergaveopties zoals visualiseren met afgevlakte Gaussische functies of histogrammen met pixel roosters, waarbij de superresolutie pixelgrootte kan geselecteerd door de gebruiker. Al deze opties veranderen het uiterlijk van het uiteindelijke beeld en hebben gevolgen voor het interpretatie en analyse.

Daarom presenteren we 3 proefmonsters die de nieuwe gebruiker zal voorzien van een uitgangspunt voor dye-based-lokalisatie gebaseerde super-resolutie experimenten, die ter wille van de duidelijkheid zullen we aanduiden als STORM, en meer ervaren gebruikers de mogelijkheid om verder optimaliseren hun experimenten. Ten eerste is het mogelijk te bekleden glazen oppervlak met een fluorescerende laag dextran-kleurstof-conjugaat. Dit zorgt voor een snelle en eenvoudige manier om vast te stellen dat de microscoop, kleurstof en buffer werken aan het genereren van knipperende tl-signaal. De methode kan dan worden verlengd door het vergelijken van de gemiddelde lokalisatie precisie en het aantal metrics gegenereerd door regenbui om buffer te optimaliseren, beeldacquisitie instellingen en test verschillende kleurstoffen. Ten tweede presenteren we een eenvoudig protocol voor het bereiden van actine filamenten op glas dat gemakkelijk kan worden geëtiketteerd met phalloidin-kleurstof conjugaten. Deze bieden de ideale structuren om metingen van resolutie ²⁷ en meestal de volle breedte half maximum (FWHM) nemenvan een gloeidraad wordt gegeven als een empirische schatting van resolutie ^37. Opgemerkt zij dat de oplossing varieert tussen monsters en tussen afbeeldingen in hetzelfde monster omdat resolutie-gebaseerde lokalisatie superresolutietechnieken is een functie van fluorofoor helderheid achtergrondruis en lokalisatie dichtheid ²⁷ en deze zijn niet noodzakelijk constant gedurende het monster. Actinefilamenten worden gebruikt om potentiële artefacten zoals mislocalizations demonstreren en drift en hoe ze kunnen worden geïdentificeerd met software functies binnen regenbui. Verder beschrijven we het gebruik van fluorescente markeerders zowel meten en corrigeren drift. En ten derde, de kleuring van cellen met epidermale groeifactor (EGF)-kleurstof-conjugaten beschreven. EGF een nuttige indicator van super-resolutie afbeelding prestaties, omdat een deel van de receptor op het celoppervlak ondergaat endocytose via vesicles, welke sub-diffractie gerangschikte structuren van ongeveer 50-150 nm in diameter ^27,38,39.

Protocol

Opmerking: In dit protocol, worden tips en suggesties gevonden volgen van bepaalde stappen. De notatie "* 1" geeft aan dat aantekening 1 is deze specifieke stap relevant, enzovoort.

1. Fluorescerende Dextraan Coating van Glas

1. Voeg 200 ul van 0,01% poly-L-lysine oplossing in elk putje van een 8-kamer dekglaasje en incubeer gedurende 10 minuten. Verwijder met een pipet om ervoor te zorgen dat er geen vloeistof is overgebleven.
2. Reconstitutie dextran-Alexa 647 ^{* 1} volgens de instructies van een 2 mg / ml voorraad oplossing. Hieruit verdunnen 0,25 pi in 25 ui gedeïoniseerd water om een ​​20 ug / ml oplossing.
3. Een hoge dichtheid bekleding van dextran-Alexa 647 verdunde oplossing te maken 20 pl van de 20 ug / ml oplossing in een totaal van 200 pl gedeïoniseerd water. Voor een gemiddelde dichtheid oplossing verdund 2 pl in 200 pl gedeïoniseerd water (1:10.000 verdunning van de oorspronkelijke voorraadoplossing). Voor een lagedichtheid oplossing verdund in 0,2 pl 200 pl gedeïoniseerd water (1:100.000 verdunning van de oorspronkelijke voorraadoplossing).
4. Voeg 200 ul van de verdunde dextran-Alexa 647 oplossing in elk putje en incubeer gedurende 10 minuten. Langere incubatietijden worden gebruikt die kan resulteren in een dichtere coating dextran. Verwijder en was met _H2O driemaal ^{* 2}

Noot 1: Andere dextran kleurstof conjugaten kunnen worden gebruikt. Geconjugeerde dextran kan ook worden geconjugeerd aan kleurstoffen desgewenst combinaties zijn niet commercieel beschikbaar.

Noot 2: Dezelfde dextran kamers kunnen reimaged gedurende weken, hoewel de uniformiteit van de fluorescentie kan afnemen. Opslag bij 4 ° C in afwezigheid van een buffer aanbevolen.

2. Fluorescerende actinefilamenten op glas

1. Voeg 200 ul van 0,01% poly-L-lysine oplossing in elk putje van de kamer en incubeer gedurende 10 min ^{* 3.} Rebewegen met een pipet om ervoor te zorgen dat er geen vloeistof is overgebleven.
2. Voeg 90 ul van algemene actine buffer (gereconstitueerd volgens instructies van de fabrikant) aan elke kamer. Voeg 10 ul van 10 uM voorgevormde actine filament oplossing en 1 pi phalloidin-Alexa 647 (0,2 eenheden, wanneer opgelost in 1,5 ml methanol volgens instructies van de fabrikant) en voorzichtig pipet op en neer te mengen. Incubeer gedurende 30 min ^{* 4.}

Noot 3: verhoging van de gloeidraad oplossing in de kamer hoe minder filamenten binding aan de poly-L-lysine gecoate glas.

Opmerking 4: incubatietijden tot 48 uur bij 4 ° C werden getest met goede resultaten. Image actinefilamenten kwaliteit verslechtert zodra een kamer is blootgesteld aan het schakelen buffer dus het is niet aan te raden om hetzelfde monster te gebruiken voor meer dan een dag.

3. Microsphere Fluorescent Beads als ijkmarkeringen

1. Verdun 1 ul van TetraSpeck kralen in 200 ul PBS en meng.
2. Voeg de verdunde kralen in een beeldvorming kamer en wacht u 15 min ^{* 5.} Verwijder de oplossing en was 3 maal met PBS voorafgaand aan beeldvorming.

Toelichting 5 - de verdunning en incubatietijd kan worden aangepast aan verschillende dichtheden van kralen te verkrijgen. Dit protocol resulteert typisch in tussen 3-10 kralen per 20,5 micrometer x 20.5 micrometer field-of-view.

4. Epidermale groeifactor celkleuring

1. Kweek HeLa cellen beeldvorming kamers tot ongeveer 80% confluentie in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine-oplossing.
2. Verwijder het kweekmedium en was met PBS. Voeg vervolgens 500 ui 4% formaldehyde-oplossing (4 ml 10% formaldehyde-oplossing, 1 ml 10X PBS, 5 ml water) gedurende 10 minuten. Verwijder de formaldehyde en was 3 maal met PBS. Sta niet toe dat de cellen om d blijvenry en gebruik altijd PBS gebufferde oplossingen voor hypotonic stress te vermijden.

LET OP - formaldehyde is uiterst giftig. Zorg ervoor dat de juiste handschoenen, oogbescherming en lab jassen zijn versleten. Controleer de lokale richtlijnen voor het verwijderen van formaldehyde.

3. Reconstitutie EGF-Alexa 647 volgens de instructies van een 50 ug / ml voorraad oplossing. Voeg 2 pi van deze voorraadoplossing aan 200 gl 0,1% BSA-oplossing (in PBS). Verwijder de PBS uit de cellen, voeg de EGF-oplossing en incubeer gedurende 30 minuten.
4. Verwijder de oplossing en was 3 maal met PBS voor het toevoegen van een blokkerende oplossing van 0,1% BSA (in PBS) gedurende 15 minuten. Verwijder deze en was nog eens 3 maal met PBS voorafgaand aan beeldvorming.

5. Schakelen Buffer Voorbereiding

1. Een enzym voorraadoplossing (A) met 10 pl catalase (20 ug / ml), 20 pl 1 M Tris (2-carboxyelthyl) fosfine hydrochloride (4 mM), 2,5 ml glycerol (50%), 125 glvan 1 M KCl (25 mM), 100 ul 1 M pH 7,5 Tris-HCl (20 mM), 5 mg glucose oxidase (1 mg / ml) en vul tot 5 ml volume met diH20. Dit is voldoende om 100 x 50 ul aliquots, die kan worden opgeslagen bij -20 ° C en gebruikt voor maximaal 1 jaar.
2. ) Voeg een glucose-voorraadoplossing (B) met 4 g glucose (100 mg / ml), 4 ml glycerol (10%) en 36 ml diH20. Dit is voldoende voor 100 x 400 ul aliquots die worden bewaard bij maken - 20 ° C en gebruikt voor maximaal 1 jaar.
3. Voeg een reductiemiddel voorraadoplossing (C) met 113,6 mg MEA-HCl (1M) en 1 ml DiH ₂ 0. Gebruik verse of maak 10 x 100 ul aliquots die worden bewaard bij -20 ° C en gebruikt voor maximaal 1 maand (niet porties invriezen).
4. Net voor imaging, meng het enzym (A), glucose (B) en reductiemiddel (C) voorraad oplossingen samen in de verhouding 50 pi, 400 ul, 100 ul en vul aan met PBS ^{* 6} 1 ml. Deze buffer zal nu scharrelen zuurstof en hebben een reducerende omgeving (100 mM MEA-HCl) ^{* 7.} De uiteindelijke pH moet in het bereik 6,0-8,5 (aanpassing is niet vereist) ^{* 8.}

Noot 6 - deze buffer is geschikt voor carbocyanine-gebaseerde kleurstoffen zoals Cy5 en Alexa 647.

Opmerking 7 - de uiteindelijke enzympreparaat concentraties 50 ug / ml (5 eenheden / ml) glucose oxidase en 1 ug / ml (40-60 eenheden / ml) van katalase. De enzymatische activiteit (eenheden) wordt gegeven door de leveranciers en kan variëren. De berekeningen voor catalase nemen dat 1 ug / ml eindconcentratie na stap 5.4 50 eenheden enzym bevat. Diverse buffer samenstellingen die vergelijkbaar zuurstofwegvangende componenten kunnen worden gevonden ^21,30,40. Voor een overzicht van buffer en kleurstof combinaties zie referenties ^28,29. Glycerine en TCEP vereist voor langdurige opslag bij -20 ° C.

Toelichting 8 - als beeldvorming actinefilamenten voeg 2 mM _MgCl2 en 0,2 mM ATP te helpen stabiliseren thij gloeidraden.

6. Microscoop Overname van STORM gegevens (met behulp van Alexa 647 kleurstof)

1. Schakel de STORM / PALM microscoop, bij voorkeur ten minste 3 uur voor beeldvorming om een ​​thermisch evenwicht te bereiken. Imaging voordat deze heeft een verhoogde kans op drift.
2. Plaats de beeldvorming kamer in de microscoop podium monsterhouder. Zorg ervoor dat het monster stevig in de houder en is vlak.
3. Verwijder de PBS uit de beeldvorming kamer en vul aan de top met het schakelen buffer. Plaats voorzichtig een dekglaasje over de bovenkant van de kamer, zorg ervoor dat er geen luchtbellen bij allen en dat de hele kamer wordt behandeld. Bijvullen met extra buffer of PBS eventuele luchtbellen worden gezien anders buffer prestaties kunnen dalen.

VOORZICHTIG - de kans op laterale en axiale afwijking van het monster ten opzichte van de objectieflens minimaliseren wordt aanbevolen het monster en de buffer worden overgelaten equilibrerentot kamertemperatuur gedurende ten minste 15 min voor beeldvorming.

4. Zoek een fluorescerende structuur van belang af te beelden. Selecteer de gewenste belichtingshoek, in dit geval, een TIRF of sterk hellende hoek wordt aanbevolen, omdat dit verbetert de signaal-ruisverhouding door het minimaliseren out-of-focus licht, wat vooral van voordeel voor celmonsters. Neem een ​​referentie buigingsbegrensde beeld van de structuur voorafgaand aan STORM beeldvorming.
5. Verhoog de ​​excitatie laser (met een geschikte golflengte van ongeveer 640 nm) een hoog vermogen, overeenkomend met ongeveer 2 kW / cm ² tijdens beeldvorming instelmogelijkheden van 10 msec positie en een cyclustijd van ongeveer 50 Hz (frames per seconde) . Zodra de fluoroforen zijn overgegaan in een schaars knipperpatroon (waarschijnlijk binnen 10 seconden voor de meeste monsters) verzamelen 10.000 frames ^{* 9.}

Opmerking 9 - 10.000 frames voor de hier beschreven voorbeeldenmaar het kan nodig zijn om het framenummer verhogen tot 50.000 of meer andere monsters.

7. Reconstructie van Super-Resolution Beelden uit onbewerkte gegevens (met behulp regenbui)

1. Open het rainSTORM.m bestand vanuit MATLAB en uitvoeren (figuur 1A).
2. In de Rainstorm venster (Figuur 1B) selecteert u het beeldbestand te analyseren met behulp van de knop Bladeren. Dit moet een. Tif-bestand (ImageJ kan worden gebruikt om andere bestandstypen converteren naar een tif) zijn. Verander de pixelbreedte de ruwe gegevens van de microscoop wordt gebruikt om de gegevens te verkrijgen ^{* 10} passen. De andere waarden op standaard.

Toelichting 10 - Een typische EMCCD camera heeft een pixelgrootte van 16 micrometer dus op een systeem met een 100x objectief de pixelgrootte op de afbeelding 160 nm zal zijn. Op commerciële systemen de pixelgrootte wordt meestal weergegeven in de software. Pixelgroottes variëren tussen 100 nm en 160 nm voor de meeste lokalisatie microscopen.

3. Druk op de knop 'Proces Images' en wacht tot een voorlopige afbeelding verschijnt. De duur van de behandeling is afhankelijk van de bestandsgrootte, computer specificaties en het aantal kandidaat knippert in de ruwe gegevens ^{* 11.}

Toelichting 11 - 10.000 framereeksen van actine en EGF gegevens duurde 23 sec en 25 sec tot respectievelijk te verwerken met behulp van een PC met een Intel Xeon E5420 CPU. Met behulp van dezelfde computer zonder een parallelle verwerking toolbox in MATLAB, of met een computer zonder multiple core processing, tijden waren 66 sec en 81 sec respectievelijk.

4. Om een bijgewerkte super-resolutie afbeelding drukt u op de knop 'Openen Recensent' genereren en een tweede venster verschijnt (figuur 1C). Druk op de knop 'Aanpassen Contrast' om de beeldweergave te wijzigen naar wens (figuur 1D). In sommige gevallen, waar het beeld is erg donker de maximale waarde worden verlaagd.
5. Gebruik de reviewer venster (figuur 1C) naar bruikbare beeldkwaliteit metrics genereren en het imago van de super-resolutie verder verfijnen. Stel de eerste drie parameters voor kwaliteitscontrole te waarden van 4000, 0,1 en 0,8-2,0 respectievelijk ^{* 12.} Werk de tellingen per foton waarde die moet ofwel gebaseerd op een foton ijkmeting of met foton-curve ijkkromme waarden door de fabrikant voor een bepaalde camera EM versterkingsinstelling. Dit is essentieel voor het verkrijgen van nauwkeurige precisie en resolutie metingen ^{* 13.}

Toelichting 12 - Signaal Tellingen verwerpt knippert op basis van helderheid criteria. Hoe hoger de waarde, hoe helderder het knipperen moet zijn aanvaard als een lokalisatie in het uiteindelijke beeld geworden. Dit kan nodig worden aangepast afhankelijk van de foton uitgang van de kleurstof en belichtingstijd en de gevoeligheid van de camera. Tolerantie verwerpt knippert als er significante kwadratische fout tussen het signaal en de gemonteerde Gauss ie double pieken. PSF Sigma Range verwerpt knippert als de gemonteerde breedte van de PSF ligt buiten deze zone, kan dus een kleiner bereik worden gebruikt om out-of-focus signalen en grote geaggregeerde klodders constante fluorescentie verwerpen. Met een breder bereik kan resulteren in mislocalization artefacten verschijnen in het uiteindelijke beeld. In de praktijk is het raadzaam om de eerste kwaliteitscontrole uit te voeren met behulp van de parameter lokalisatie precisie cutoff.

Toelichting 13 - voor meer informatie over resolutie metrics zie referenties ^23,27. Kortom door te weten het aantal fotonen die door elk knipperen is het mogelijk om de lokalisatie nauwkeurigheid van elke lokalisatie berekenen en daardoor afleiden algehele gemiddelde betrouwbaarheidsschattingen voor het hele beeld. Met behulp van een Andor ixon DU-897E met een gain-instelling van 200 de graven per Photon waarde is 9,04.

6. Verander de lokalisatie precisie cutoff (figuur 1C) te afweging tussen het optimaliseren van de gemiddelde lokalisatie precision tegen lokalisatie nummer in het uiteindelijke beeld. Waarden van 30-50 nm aanbevolen afhankelijk van de kwaliteit van de gegevens en het monster. Zowel de histogrammen en de info.txt bestanden kunnen worden gebruikt om deze beslissing (figuren 1F en 1G) informeren.
7. De reconstructie schaalfactor (figuur 1C) standaard is 5, wat zal leiden tot super-resolutie pixels van 32 nm in de veronderstelling dat de pixel breedte in de originele beelden is 160 nm. Als de ruwe beelden hebben een pixelgrootte van 100 nm dit zal produceren super-resolutie beelden met pixels van 20 nm. Verhoog de ​​schaalfactor om kleinere super-resolution pixels te produceren in het uiteindelijke beeld ^{* 14.}

Opmerking 14 - Resolutie van lokalisatie microscopie afhankelijk van het vloeiend vereist voor visualisatie (dwz de pixelgrootte van een eenvoudige histogram reconstructie) en de lokalisatie precisie. In de praktijk zou de reconstructie pixelgrootte algemeen kleiner dan de lokalisatieprecisie (zie de Mean Precision Schatting metriek in de info tekstbestand - stappen 6.11 en 6.12). In dit geval is het verlies van de resolutie toe te schrijven aan de wederopbouw pixelgrootte zal klein ^23,27 zijn. Bijvoorbeeld de gemiddelde betrouwbaarheidsschattingen in de rij-en kolomrichting van fig. 4E is 16,1 nm en 16,2 nm. Een pixelgrootte van 16 nm werd gebruikt om deze gegevens te visualiseren (reconstructie schaalfactor van 10 met een oorspronkelijke pixel breedte van 160 nm).

8. Wijzig de limiet reeks beelden (figuur 1C) aan de wederopbouw te beperken tot subsets van de ruwe data, bijvoorbeeld [2001-inf] zou de eerste 2000 frames van ruwe data uit te sluiten.
9. Op de knop 'bijdrager' knop (figuur 1C) een geactualiseerd beeld super-resolutie (figuur 1E) te genereren.
10. Druk op de knop 'Bekijk Histograms' (figuur 1C), met het oog op de beeldkwaliteit metrics (Figuur 1F) ^{* 15} weer te geven.

Toelichting 15 - De grafiek rechtsboven beeltenis van het aantal aanvaarde lokalisaties tegen camera framenummer en de Thompson Lokalisatie Precisions histogram in de rechterbenedenhoek (Figuur 1F) kan worden gebruikt om de lokalisatie precisie cutoff beoordeling optie informeren. Bijvoorbeeld met behulp van een 50 nm cutoff zou uitsluiten alle lokalisaties met slechtere precisie van wordt opgenomen in het uiteindelijke super-resolutie.

11. Druk op de 'Afbeelding opslaan' knop in de reviewer (figuur 1C) om al deze gegevens ^{* 16} slaan.

Toelichting 16 - Tussen 3 en 5 bestanden kunnen worden opgeslagen, afhankelijk van de gekozen (afbeelding som, STORMdataImage, STORMprocessed, info & hists) opties, zie figuur 1G. De STORM bewerkte beeld wordt weergegeven met een aangepaste contrast en kleur kaarten. De STORMdataImage is een beeld in grijstinten, waarbij de grijswaarde van elke pixel gelijk aan het verdovener van lokalisaties die werden geïdentificeerd binnen het.

12. Na bestudering van de gegevens (bijvoorbeeld Info.txt bestand en histogrammen) terug naar stap 7.6 en herhaal de volgende stappen met verschillende recensent parameters indien gewenst. Door op 'Afbeelding opslaan' in stap 7.11 zal de eerder opgeslagen gegevens te overschrijven.

8. Box Tracking en Tijdafwijkingscorrectie (met behulp regenbui)

1. Volg de stappen 7,1-7,9 om een ​​beeld te genereren op de normale manier.
2. Druk op de knop 'Box Tracking' in de reviewer (figuur 1C) en klik en sleep een vak over de referentiemerkteken of de structuur van de rente op de afbeelding beoordeeld.
3. Wacht tot een nieuw beeld verschijnt, waarin de 'Boxed Positions' (zie de figuren 6B, 6C en 6F voor voorbeelden) wordt weergegeven. Sla deze afbeelding indien gewenst.
4. Als het object van belang is een referentiemerkteken dan drift correctie kan worden uitgevoerd door te klikken op de 'Set Anker' knop, gevolgd door de 'Subdarmkanaal Drift 'te klikken. Tenslotte klikt u nogmaals op 'Uitvoeren Recensent' om een ​​nieuw plaatje STORM, die nu zal moeten alle lokalisaties gecorrigeerd volgens de referentiemerkteken posities te genereren. De kraal posities uit de laatste beoordeeld afbeelding verwijderd.
5. Als er andere ijkmarkeringen binnen het beeld laatste drift gecorrigeerd, kan deze worden verwijderd door op 'Box Tracking', 'Verwijder Boxed' en vervolgens zo vaak 'Run Recensent' zoals gewenst.

Results

Dextran

Een succesvolle bekleding van dextran zou een fluorescerende monolaag te produceren. Bij de hoge concentratie deze relatief uniforme verschijnen. Bij lagere concentraties wordt het schaarser (Figuur 2A) verschijnen. Veel STORM / PALM microscopen hebben de mogelijkheid om de hoek van de verlichting te veranderen van epifluorescentie naar TIRF. Wanneer een volledige lijst camerabeeld, bijvoorbeeld bij 512 x 512 pixels op een typische EMCCD camera dient een gelijkmatige verlichting worden waargenomen. Als er sprake is van strepen of out-of-focus gebieden kan dit erop wijzen dat het monster in de monsterhouder met verse olie moet worden teruggeplaatst op het objectief. Alternatief kan het een probleem met de microscoop geven.

Bij het ​​verwerven van ruwe data super-resolutie van de beeldvorming laser moet worden verhoogd aan de macht tot ongeveer 2 kW / cm ^2. Er zal een initiële uitbarsting van fluorescentie gevolgd door knipperen als de fluoroforen worden aangedreventijdelijke donkere staten. Bij hoge dichtheden dextran knippert waarschijnlijk overlappen, vooral bij het ​​begin van de beeldopname (Video 1). Bij middelgrote en lage dichtheden deze knippert schaars zijn, dus ruimtelijk gescheiden, en in focus, zonder duidelijke achtergrond (zie kaders 2000, 5000 en 8000, figuur 2A, Video's 2 en 3). Tijdens deze afbeelding acquisitie fase, bij constante laser verlichting, het aantal knipperingen zal afnemen met de tijd (vergelijk kader 2.000 met frame 8.000 in de hoge dichtheid monster, figuur 2A). Het belangrijkste verschil tussen de verschillende super-resolutie afbeeldingen van de verschillende dextran concentraties (hoog, gemiddeld en laag) is het dalende aantal lokalisaties (Figuren 2A en 2B). Met andere woorden, de concentratie van de fluorescerende moleculen, aantal knippert de ruwe gegevens en het aantal lokalisaties een evenredige verhouding. Deze relatie,echter niet eenvoudig lineair als bij zeer hoge dichtheden molecuul de software geen moleculen succesvol lokaliseren (vergelijk de rode en blauwe lijnen, figuur 2C). De reden hiervoor is dat op de hoge concentratie is niet mogelijk de bewerkingssoftware om de posities die met de Gauss fitting algoritme waar knippert niet-schaars. Zoals de knippert verlagen door de overname fase vanwege photobleaching de software kan meer en meer van de knippert passen als ze schaars (figuren 2A en 2C). Bovendien kunnen individuele kleurstofmoleculen knipperen, en daarom worden gelokaliseerd meer dan eens ^28,41,42.

Een veelvoorkomend probleem bij het afbeelden van een van deze monsters, maar vooral de hoge dichtheid dextran een, kan de aanwezigheid van lichte maar ongericht fluorescerende waas dat lijkt snel te diffunderen tijdens de storm beeldopname fase. Dit is verschillend van het hoge contrast fluoroforen ophet oppervlak van het glas, wat te zien knipperen (fig. 3A, Video 5). Deze vrijstaande fluorescerende moleculen kan worden voorkomen of worden verwijderd door het verhogen van het aantal wasstappen met PBS voorafgaand aan het toevoegen van de schakeling buffer of door toevoegen van verse buffer schakelen naar de kamer (figuur 3B, Video 6). Verwerking en de gegevens van elke afbeelding sequentie resulteert in zeer verschillende super-resolutie beelden met een afname van zowel het aantal lokalisaties en de precisie waarmee zij kunnen worden aangebracht van de software knippert lokaliseren (fig. 3C, 3D, 3E hebben vergeleken en 3F).

Actinefilamenten

Voorgevormde actine filamenten zichtbaar geplakt op het oppervlak van de glasplaat buigingsbegrensde beeldvorming (fig. 4A-4C). Wanneer het aantal filamenten lijkt zeer laag kan dan een langere incubatietijd worden gebruikt of een afname van het volume van het actinefilament oplossing helpt ook. Het selecteren van enkele relatief lichte filamenten (Figuur 4D) in plaats van verstrikt gebieden resulteert in een betere kwaliteit foto's. Tijdens de acquisitie fase moeten helder knippert scherpgesteld worden gezien langs de lengte van het filament (Video 7). Schaars knipperen moet worden gezien tijdens de acquisitie fase en dan vervolgens in de verwerkte gegevens is er een dunne continu filament (figuur 4E) moet zijn en de lokalisatie per frame moet een geleidelijke daling (Figuur 4F), in tegenstelling tot in figuur 3E.

Als knippert is niet dun, of als de software niet in staat om de moleculen te lokaliseren, een subtielere artefact, zogenaamde mislocalization ³² kan leiden. Dit ontstaat wanneer de software middelt de positie van twee overlappende moleculen en de lokalisatie positie halverwege daartussen. Een indicatie dat er een aanzienlijk aantal overlappende bli niet zijnNKS en bijgevolg mislocalizations, dat de gemiddelde betrouwbaarheidsschattingen hetzelfde in de rij en kolom richtingen en dus horizontaal en verticaal moet zijn, waar mislocalizations deze zou hebben plaatsgevonden over de lengte van het filament, produceerde een groter dan normaal knipperen ( dus verdeeld over meer pixels), hetgeen vervolgens zou zijn gelokaliseerd minder nauwkeurig in een van de richtingen. Dit is het meest gemakkelijk te zien waar sprake is van een enkele actine filament in de imaging-gebied en het is horizontaal of verticaal liggen. In dit geval, de STORM microscoop, bereikte een gemiddelde nauwkeurigheid van 16 nm in beide richtingen. Dit resulteert in een precisiegrens, een maat voor effectieve beeldresolutie van ongeveer 34 nm. Deze statistieken worden geleverd door regenbui ^27, echter, zoals we hebben een draderige structuur van uniforme diameter, 7 nm met de zeer kleine phalloidin-Alexa 647 label kunnen we een zekere mate van FWHM nemen om een schatting van de resolutie van het beeld. Door dravleugel een rechte lijn door de gloeidraad van super-resolutie afbeelding in ImageJ (figuur 4G) de, met behulp van het perceel profiel functie (figuur 4H) en vervolgens uitvoeren van een Gauss-fit (Figuur 4I) de FWHM wordt berekend als 43,2 nm. Als u probeert deze meting adviseren wij de pixelgrootte moet overeenkomen of zijn iets kleiner dan de gemiddelde schatting precisie voor het beeld (zie info.txt bestand figuur 1G). In dit geval werden 16 nm pixels gebruikt om een ​​beeld te reconstrueren.

Twee verwante problemen kunnen optreden met STORM, waarbij het ​​knipperen fluoroforen worden niet-sparse, dwz individuele moleculen in ongeveer 250 nm knipperen tegelijkertijd en derhalve de signalen overlappen. De eerste is dat afhankelijk van het algoritme en de kwaliteitscontrole criteria voor haar, knippert mogelijk niet helemaal gelokaliseerd. Dit resulteert in een super-resolutie beelden met weinig of geen gelokaliseerde versies. Het tweede probleem vanmislocalizations treedt op wanneer de twee knippert voorgedaan voldoende dicht bij elkaar om te verschijnen als een enkele knipperen. In dit geval is de positie in het uiteindelijke beeld vertegenwoordigt een gemiddelde van de twee. Zie referentie ³² voor meer details over dit. In beide gevallen kan dit gebeuren met een zeer hoge dichtheid monsters, onvoldoende laservermogen of met geschakelde buffer problemen. Dit probleem blijkt waar een aantal actine filamenten vertakking en / of elkaar kruisen (Figuren 5A-D Video 9). Bij verwerking subsets frames en vergelijken van de eerste en laatste frames 5000 kunnen we een ander beeld verkregen bekijken. Beeld In de super-resolutie met behulp van de eerste 5000 frames (figuur 5C) kunnen we zien dat er veel lokalisatie in het midden van het beeld, maar bij gebruik van de laatste 5000 frames, zeer weinig van deze zijn duidelijk en we zijn vertrokken met slechts de filamenten, zij het iets discontinue schuldenaar van de lage aantal lokalisaties in het IMAGe (Figuur 5D). Als een te hoge knipperen dichtheid wordt verdacht vergelijking van de beelden met de lokalisatie per frame gegevens kan er sterk op dat dit probleem zich voordoet, tijdens de eerste set frames is er een gemiddeld aantal lokalisaties per frame van meer dan 10 vergeleken met de laatste set frames waar het ongeveer 4 (figuur 5E). Om de waarschijnlijkheid van optreden mislocalizations is ideaal zo weinig lokalisaties per frame als mogelijk is, maar als er een groot aantal moleculen te beelden, dat wil zeggen een hoge dichtheid monster, vereist dit klein is dat een groot aantal verwerving lijsten worden waardoor een probleem STORM microscopie die drift.

Lateral Drift - actinefilamenten en ijkmarkeringen

Drift optreedt wanneer het monster beweegt ten opzichte van de objectieflens door de data-acquisitie-fase. Dit is niet of nauwelijks te zien During de beeldacquisitie fase, vooral als het laterale dan axiaal, of tenzij deze uitdrukkelijk wordt gemeten, aangezien het gewoonlijk minder dan 50 nm in de loop van enkele minuten in de relatief stabiele microscoop systemen. In gereconstrueerde beelden van bekende structuren zoals actine filamenten met goed gedefinieerde structuur, kan worden gedetecteerd in de super-resolutie beelden. Het eerste teken dat zijdelingse drift heeft plaatsgevonden is dat de structuur groter is dan verwacht (figuur 6A, Video 8) bijvoorbeeld met een relatief grote FWHM opzichte van de precisiegrens gegevens regenbui in dit geval 90 nm tegen 67 nm. Echter, een betere manier om drift te detecteren is door vergelijking van de lokalisatie als functie van de tijd, dat wil zeggen kijken of de lokalisatie in de latere frames verplaatst vergeleken met die begin frames. Dit is duidelijk te zien in het geval van actine filamenten, die erg klein en uniforme structuur, wanneerweergegeven met een kleurcode met behulp van het vak bijhouden functie in regenbui (figuren 6B en 6C).

Drift is een goed erkend probleem en er zijn een aantal strategieën die gebruikt kunnen worden om het te minimaliseren ¹⁹ of te corrigeren na de overname, hetzij met behulp ijkmarkeringen ^21,43 of kruiscorrelaties ^44. Met het oog op drift en correct voor het meten, kan fluorescerende kralen van 100 nm diameter worden gebruikt als ijkmarkeringen (Figuur 6D). Omdat ze klein en licht hun positie nauwkeurig kan worden gemeten met behulp van Gauss montage algoritmes, zoals regenbui. In een voorbeeld waarin er relatief ernstige afwijking heeft van ongeveer 100 nm in de loop van 3 min 10 sec in de acquisitiefase (figuur 6E), hetzelfde vak tracking-functie kan worden gebruikt om kleur en bevestig dat drift opgetreden (Figuur 6F ). Als alle vier kralen in dit voorbeeld tonen bijna-identieke drift is tOGELIJKE een van hen, in dit geval kraal 2 selecteert, te gebruiken als referentie en aftrekken van de drift van de andere kralen (figuur 6G). Door het toevoegen van de vaste markeringen om een ​​biologisch monster van belang wordt het dan mogelijk om te meten en te corrigeren drift waar de onderliggende structuur is onbekend of veel meer variabel dan een actine filament of een fluorescerende kraal.

Epidermale groeifactor

Tenslotte kan EGF-gekleurde HeLa cellen worden gebruikt om een realistisch voorbeeld van beeldresolutie in cellen (figuur 7A, Video 10) werd verkregen. Deze cellen zijn relatief eenvoudig te beeld omdat zij de meeste EGF-fluorescentie in de focus-vlak van het celoppervlak in de nabijheid van het dekglaasje moet hebben. De minder helder gebied in het midden overeen met de positie van de kern. TIRF verlichting kunt de beeldkwaliteit verbeteren door het elimineren van out-of-focus fluorescentie afkomstig uit delen van de cel membrane niet in de nabijheid van het glas (circa 150 nm penetratie in cellen). ingezoomd gebieden van belang in beeld buigingsbegrensde doorgaans onduidelijk (figuren 7B en 7C), maar in de super-resolutie beelden moet er een mengsel zijn van clusters en af en toe enkele, geïsoleerde pixels (figuren 7D-7F). Deze zullen ofwel geïsoleerd EGF receptoren vertegenwoordigen op het celoppervlak of mogelijk een kleine hoeveelheid niet-specifieke binding. De clusters ongeveer 100 nm in diameter en zijn wellicht overeenkomen met vorming putten en vesicles, de route via welke EGF overwegend down-gereguleerd en endocytose. Typische gemiddelde betrouwbaarheidsschattingen zijn ongeveer 20 nm voor dit soort monster met een precisiegrens van ongeveer 45 nm. Opgemerkt zij dat deze precisiegrens maat voor daadwerkelijke beslissing geen rekening labelgrootte, of een afwijking, die kan worden gemeten met de vaste markers, maar blijft noticeable door "komeetstaarten" op de clusters of met behulp van het vak bijhouden functie zoals geschetst in figuur 6 en in protocol hoofdstuk 8 beschreven.

Bestanddeel	Eindconcentratie
Katalase	1 ug / ml (50 eenheden)
Glucose	40 mg / ml
Glucose oxidase	50 ug / ml
Glycerine	12.50%
KCl	1.25 mM
MEA-HCl	100 mM
TCEP	200 uM
Tris	1 mM

Tabel 3. Schakelen buffer

Typische Acquisitie Instellingen	Waarde
Pixelgrootte (nm)	160
Belichtingstijd (msec)	10
Winst	200
Frame (pixels)	128 x 128
Cyclus tijd (fps)	52.5
Framenummer	10.000
640 nm laser vermogensdichtheid (kW / cm 2)	2

Tabel 4. Acquisitie instellingen

Figuur 1. STORM beeldreconstructie behulp regenbui. (A) openen regenbui vanuit MATLAB. (B) regenbui grafische gebruikersinterface (GUI). (C) regenbui Reviewer GUI. (D) Het contrast aanpassen venster. (E) STORM image na nazicht en contrast aanpassen. (F) Zijngrammen van beeldkwaliteit metrics. (G) Bestanden gegenereerd nadat save image-knop in te drukken recensent GUI. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2. (A) buigingsbegrensd (DL) beelden tonen verschillende concentraties van dextran voorafgaand aan STORM beeldvorming. Super-resolution (SR) image reconstructies hebben een pixelgrootte van 25 nm. 10.000 beelden werden verzameld met een 128 x 128 pixel framemaat en individuele frames worden getoond van die sequentie (2000, 5000, 8000). Overgenomen met 10 msec belichtingstijd op 52,5 frames per seconde. Beelden hebben een pixelgrootte van 160 nm. Voor de duidelijkheid van het bekijken van een 0,1% pixel verzadiging contrast enhancement is toegepast met behulp van ImageJ. De gemiddelde precisieschattingen zijn 28 nm (hoog), 24 nm (gemiddeld) en 16 nm (laag) voor de verschillende dextran afbeeldingen. De lokalisatie dichtheden zijn 724 per micrometer ² (hoog), 526 per micrometer ² (gemiddeld) en 13 per um ² (laag). (B) Grafiek van gemiddeld drie 10.000 framereeksen van elke concentratie van dextran. Foutbalken tonen standaarddeviatie. (C) Grafiek plotten het aantal aanvaarde lokalisaties per frame met behulp van een rollende 100 montuur gemiddelde. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 3. Slechte Kwaliteit Dextraan gegevens. (A) diffractie beperkte frame uit een 15.000 kader STORM reeks. Let op de diffuse fluorescerende waas over het beeld. Dit wordt veroorzaakt door fluoropho res diffunderen door het medium. 128 x 128 pixels framemaat, een 10 msec belichtingstijd en verworven op 52,5 frames per seconde. (B) Hetzelfde als (A) na de buffer werd veranderd. Let op de verbeterde contrast als ongebonden fluoroforen zijn weggespoeld. (C) Een super-resolutie afbeelding reconstructie overeenstemmen met de in (A) verzamelde gegevens. Identieke afbeelding grootte, maar met pixels van 25 nm. De gemiddelde precisie schatting is 35 nm. (D) Een super-resolutie afbeelding reconstructie overeenstemmen met de in (B) verzamelde gegevens. Identieke afbeelding grootte, maar met pixels van 25 nm. De gemiddelde precisie schatting is 30 nm. (E) Grafiek plotten van het aantal aanvaarde lokalisaties per frame, met behulp van een rollende 100 montuur gemiddelde. De rode lijn komt overeen met STORM volgorde (A & C) waar er een hoge achtergrond. De blauwe lijn geeft de gegevens die overeenkomen met (B & D), waar de achtergrond laag. (F) Grafiek van het geaccepteerde lokalisatie nummer van de beelden overeenkomen met een zeer (C) en lage (D) achtergrondgegevens.href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/50579/50579fig3large.jpg" target = "_blank"> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.

Figuur 4. Typische actine gegevens. (AC) buigingsbegrensd beelden van actine filamenten voor de toevoeging van het schakelen buffer en STORM beeldvorming. Verschillende lengten filamenten zichtbaar. Zeer helder filamenten zijn vaak meerdere filamenten verstrikt samen. Pixelgrootte is 160 nm. (D) A-diffractie begrensde beeld van een actine filament. (E) image STORM (0,1% contrast enhancement toegepast ImageJ). Van een 10.000 framereeks met een 128 x 128 pixel framemaat, een 10 msec belichtingstijd en verworven op 52,5 frames per seconde. De pixelgrootte is 16 nm. De gemiddelde precisie schatting is 16 nm. (F) grafiek waarin het aantal aanvaarde lokalisaties per frame, met behulp van een rollende 100 montuur gemiddelde. (G) Een ingezoomd regio van het actine filament uit (E) voorafgaand aan enhancement contrasteren met een gele lijn profiel opgesteld over. (H) Een perceel profiel te bekijken van de gele lijn over het actine filament. Gegenereerd in ImageJ. (I) Een Gaussische fit van de plot profiel met behulp van de curve fitting gereedschap in ImageJ. De standaarddeviatie, d, werd vermenigvuldigd met 2,35 om een FWHM meting van 43,2 nm krijgen. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 5. Mislocalized actinefilamenten. (A) buigingsbegrensd actine filament. 160 nm pixels. (B) STORM beeld van actine filament getoond in (A). Van een 20.000 framereeks met een 128 x 128 pixel frame grootte, een 10 msec belichtingstijd en verworven op 52,5 frames per seconde. De STORM pixelgrootte is 16 nm. Alle 20.000 frames werden verwerkt. De gemiddelde precisie schatting is 17 nm. (C) As (B), maar met alleen de eerste 5000 frames van de 20.000 framereeks verwerkt. De gemiddelde precisie schatting is 18 nm. (D) As (B), maar met alleen de laatste 5000 frames van de 20.000 framereeks verwerkt. De gemiddelde precisie schatting is 17 nm. (E) Grafiek van lokalisaties per frame gegevens van volledige 128 x 128 pixel kaderweergave.

Figuur 6. Lateral (A) STORM beeld van een actine filament gereconstrueerd uit een 10.000 framereeks met een 64 x 64 pixel framemaat, een 10 msec belichtingstijd en genomen op 64,6 frames per seconde Drift.. De STORM pixelgrootte is 32 nm. De gemiddelde precisie schatting is32 nm. (B) Een beeld STORM weergegeven met behulp van de functie 'Box Tracking' in regenbui. Lokalisaties worden weergegeven met een kleur die overeenkomt met het framenummer van toen ze werden verworven, bijvoorbeeld lokalisaties van vroeg in de overname volgorde zijn blauw; lokalisatie van laat in de overname volgorde zijn rood. De verplaatste kleuren geven aan dat drift heeft plaatsgevonden. (C) Een ingezoomd regio (A) weergegeven met behulp van de functie Box Tracking in regenbui. De verplaatste kleuren geven drift opgetreden. (D) Een diffractie begrensde beeld van vier 100 nm fluorescerende kralen, die gebruikt kan worden als markeerders. Pixelgrootte 160 nm. Nummers 1-4 tonen bijgesneden en ingezoomd kralen individueel. (E) Elk fluorescerende kraal die overeenkomt met (D) gereconstrueerd in regenbui van een 10.000 framereeks met een 128 x 128 pixel framemaat, een 10 msec belichtingstijd en verworven op 52,5 frames per seconde. De STORM pixelgrootte is 5 nm. De gemiddelde precisie schatting is 7 nm. (F) Beads overeenkomt met (D) en (E),weergegeven met behulp van de functie 'Box Tracking'. De verplaatste kleuren geven drift opgetreden. (G) Met behulp van kraal nummer 2 als de referentie, kralen 1, 3 en 4 worden weergegeven nadat de functie 'Aftrekken Drift' wordt gebruikt in de regenbui. Vergelijking met (E) laat zien dat de laterale afwijking is gecorrigeerd. De STORM pixelgrootte is 5 nm. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 7. Typische (A) diffractie begrensde beeld van een deel van een HeLa cel gericht op basale celoppervlak EGF gegevens.. Gele vakjes geven ingezoomd regio's van belang weergegeven in (B) & (C). (B) ingezoomd diffractie begrensde beeld van het gebied nabij de rand van de cel (vak B). (C) Ingezoomd buigingsbegrensd afbeelding uit de regio onder de nucleus (vak C). (D) STORM afbeelding overeenkomt met (A). Van een 10.000 framereeks met een 128 x 128 pixel framemaat, een 10 msec belichtingstijd en verworven op 52,5 frames per seconde. De STORM pixelgrootte is 25 nm. De gemiddelde precisie schatting is 21 nm. (E) STORM afbeelding overeenkomt met vak E (D). (F) STORM afbeelding overeenkomt met vak F (D). (G) Localizations per frame gegevens van (D). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

. Videos 1-4 Video overeen met 2A figuur met verschillende dextran concentraties: 1 = hoog, 2 = gemiddeld, 3 = laag, 4 = geen). 10.000 framereeksen met 128 x 128 pixel bouwgroottes, overgenomen met een 10 msec belichtingstijd op 52,5 frames per seconde. Klik hier om de video te bekijken 1 ,load/50579/50579video2.mov "target =" _blank "> video 2, video 3 , video 4

Video 5-6.'s Komen overeen met figuur 3 A & B. Video 5 is voorwas en Video 6 is post-wassen na ongebonden fluorophores zijn verwijderd. 15.000 framereeksen met een 128 x 128 pixel framemaat, een 10 msec belichtingstijd en verworven op 52,5 frames per seconde. Klik hier om de video te bekijken 5 , video 6 .

Video 7. Video toont de rauwe framereeks dat werd verwerkt om de STORM afbeelding in figuur 4E genereren. 10.000 kader SequeNVU met een 128 x 128 pixel framemaat, een 10 msec belichtingstijd en verworven op 52,5 frames per seconde. Klik hier om de video te bekijken 7 .

Video 8. Video toont de rauwe framereeks dat werd verwerkt om de STORM afbeelding in figuur 5B genereren. 20.000 framereeks met een 128 x 128 pixel framemaat, een 10 msec belichtingstijd en verworven op 52,5 frames per seconde. Klik hier om de video te bekijken 8 .

Video 9. Video waarin de rauwe framereeks dat werd verwerkt om de STORM afbeelding in figuur 6A te genereren. 10.000 framereeks met een 64 x 64 pixel framemaat, een 10 msec belichtingstijd en genomen op 64,6 frames per seconde. Click hier om video te bekijken 9.

Video 10. Video waarin de rauwe framereeks dat werd verwerkt om de STORM afbeelding in figuur 7D genereren. 10.000 framereeks met een 128 x 128 pixel framemaat, een 10 msec belichtingstijd en verworven op 52,5 frames per seconde. Klik hier om video te bekijken 10 .

Discussion

We tonen met een aantal eenvoudige proefmonsters en de vrij verkrijgbare grafische software regenbui is het mogelijk om STORM super-resolutie beeldvorming te optimaliseren. Deze tools en methoden zullen bruikbare aanknopingspunten voor nieuwe gebruikers en manieren voor ervaren gebruikers om het vertrouwen in hun microscopen en hun gebruik van hen om biologische en cellulaire structuren bestuderen met ongekend detail te verhogen. Door een combinatie van monsters met bekende of welbegrepen structuren en een algoritme dat een aantal nuttige beeldkwaliteit statistieken, zoals gemiddelde betrouwbaarheidsschattingen, lokalisatie nummer en histogrammen tonen is het mogelijk om de beeldkwaliteit te verbeteren en meer vertrouwen hebben produceren in het STORM imaging proces. Er is geen one size fits all benadering verwerven van de gegevens als er een aantal verschillende commerciële en zelfgebouwde microscoop configuraties die kunnen worden gebruikt. Bovendien zijn er vele monstervoorbereiding en beeldaanwinst stappen die kunnen beïnlingen het uiteindelijke beeld dat zij daarom softwaretools en proefmonsters is van cruciaal belang voor het begrijpen en optimaliseren van STORM beeldkwaliteit.

Daarnaast kunnen deze protocollen nuttige en minder dubbelzinnige manier van het oplossen van eventuele problemen die zich kunnen voordoen. Bijvoorbeeld de dextran monster een zeer nuttige manier om te identificeren of er een laserstraal uitlijning of ongelijkmatige verlichting van het monster. Als er bezorgdheid dat de omschakeling buffer niet kan werken een zeer eenvoudige visuele test om te zien of er sprake is van 'knipperen' zal helpen. Actinefilamenten zijn een nuttige manier van meten resolutie met behulp FWHM vergelijkingen evenals markeren drift en mislocalization artefacten. Er dient echter te worden opgemerkt dat als-lokalisatie gebaseerd super-resolutie methoden fluorofoor dichtheid gevoelig kan zijn, niettegenstaande de andere factoren, zoals blootstelling tijden, frame rates, laser bevoegdheden en de manier waarop de afbeelding wordt verwerkt, is het onmogelijk om te wijzen een besluit totbijzondere microscoop en gaan ervan uit dat alle afbeeldingen die resolutie zal hebben. Wat echter wel mogelijk is om verschillende aspecten van de resolutie als gemiddelde lokalisatie precisie, lokalisatie aantal meten en drift ^27. Zelfs als markeerders niet in elk experiment ze kunnen worden opgenomen, tenminste, worden gebruikt om een ​​microscoop systeem zijn omgeving karakteriseren en beter begrip operationele overwegingen zoals hoeveel tijd nodig is om thermisch evenwicht te bereiken na het opstarten. Naast het corrigeren van laterale afwijking kunnen markeerders worden gebruikt karakteriseren en correcte axiale afwijking, maar dit vereist het gebruik van een astigmatische lens en een feedbackmechanisme om het monster te corrigeren terwijl de beelden worden verkregen ^43. Commerciële super-resolutie systemen omvat meestal een soort van stabiliteit controle of focus-lock mechanisme, dat een meer praktische oplossing voor het corrigeren nadruk drift kan zijn.

Er eenre alternatieven voor niet specifiek coating het glas met dextran, zoals het gebruik van kleurstoffen rechtstreeks of andere geconjugeerde moleculen, zoals secundaire antilichamen. Een beperking van deze benadering is dat het aantal moleculen gebonden aan het glas niet bekend. Alternatieve draadvormige structuren die zijn gebruikt omvatten microtubuli ²⁸ en DNA ^21. De combinatie van zeer kleine omvang en handige handel verkrijgbare middelen maken actine een aantrekkelijk alternatief, vooral omdat de afstand van uiteenlopende of vertakte filamenten ook een bruikbare meting van de systeemprestaties ²⁷ kan zijn.

Er is ruimte voor verdere ontwikkeling van de monsters, ondanks recente vooruitgang op dit gebied ^28,29,46,47. In het bijzonder, multi-color beeldvorming presenteert een aantal uitdagingen in alle 3 belangrijke aspecten van de beeldvorming, monster etikettering, beeldopname (hardware) en software (beeldverwerking en uitlijning). Er zijn een geweesteen aantal publicaties het aanpakken van deze aspecten ^4-6 en het is dus duidelijk dat geschikte test samples en methoden zijn cruciaal voor het genereren en betrouwbaar interpreteren van dit soort beelden. Inderdaad, onlangs werd aangetoond dat dSTORM kunnen worden gebruikt om twee kleurenbeelden aannemen en lossen de zeer symmetrische aard van de nucleaire porie complex en de auteurs gesuggereerd dat dit een ideale manier om de prestaties van chromatische aberratie correctie ⁴⁵ beoordelen zijn. Een andere interessante benadering is het gebruik van DNA origami een nanoruler, waarbij de mogelijkheid van plaatsing fluoroforen creëert op specifieke sub-diffractie afstand van elkaar ⁴⁶ maken. Dit biedt een manier van beoordelen van de resolutie en het doen van metingen op afstand. Echter, het uiteindelijke doel is om deze super-resolutie technieken toe te passen op niet-geïdealiseerde monsters, zoals cellen, die complexe driedimensionale structuren. In dit geval, een combinatie van beter begrip van de thij techniek in combinatie met software tools die de gebruiker te helpen bij het ​​verwerven van gegevens, verwerken op passende wijze, en het verstrekken van imago metrics is waarschijnlijk het ultieme antwoord. ^28,29,47,48

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Labtek Imaging chamberglass	Fisher	CBR-166-390E	Sample preparation
Inverted Microscope	Olympus	IX71	* See below for alternatives
100 X TIRF Objective Lens	Olympus	UAPON 100XOTIRF	* See below for alternatives
EMCCD Camera	Andor	iXon 897	* See below for alternatives
640 nm laser	Toptica	iBEAM-SMART-640-S	*150 mW - for imaging Alexa 647 or Cy5 dyes
LabVIEW	National Instruments		*Acquisition software (controlling hardware)
PC	Dell		Windows XP (64 bit), Intel Xeon E5420 CPU, 16 GB RAM *Instrument control and image processing
ImageJ			Image analysis and processing http://rsbweb.nih.gov/ij
rainSTORM	Laser Analytics Group (Cambridge) software		http://laser.cheng.cam.ac.uk/wiki/index.php/Resources
MATLAB	Running rainSTORM		http://www.mathworks.co.uk/products/matlab/
*Example of self-built STORM/PALM microscopes			Also see reference 29 http://code.google.com/p/quickpalm/wiki/Tutorial_CustomMicroscope
*Commercial STORM/PALM super-resolution microscopes			Leica SR GSD, Nikon N-STORM, Vutara SR-200, Zeiss Elyra P.1, DeltaVision OMX Blaze (Monet Localization) Alternatives to self-built microscopes
Table 1. Materials & Equipment
[header]
PBS (10X)	Fisher	VX70013065	1; 2; 3; 4
Poly-L-Lysine	Sigma	P4707	1.1; 2.1
Dextran-Alexa fluor 647	Invitrogen	D-22914	1.2
General actin buffer	Cytoskeleton Inc	BSA01	2.2
Preformed-actin filaments	Cytoskeleton Inc	AKF99	2.2
Phallodin-Alexa fluor 647	Invitrogen	A22287	2.2
TetraSpeck Microspheres (0.1 micron)	Invitrogen	T-7279	3.1
HeLa cells	ATCC	CCL-2	4.1
DMEM	Fisher	VX31966021	4.1
FBS	Fisher	VX10500064	4.1
Pen/Step	Invitrogen	15070063	4.1
Plastic dishes	Invitrogen	734-0006	4.1
EGF - Alexa fluor 647	Invitrogen	E35351	4.3
BSA	Sigma	A7906	4.3, 4.4
Formaldehyde - 10 % solution EM grade	Polysciences	04018-1	4.2
Catalase	Sigma	C100	5.1
Glucose oxidase	Sigma	G2133	5.1
KCl	Sigma	P9541	5.1
TCEP	Sigma	C4706	5.1
Tris	Sigma	93352	5.1
Glucose	Sigma	C7528	5.2
MEA-HCl	Sigma	M6500	5.3
Glycerin	Sigma	G2289	5.1; 5.2
Table 2. Reagents