Methodenartikel

Handmatig Isolatie van vetweefsel-afgeleide stamcellen uit menselijke Lipoaspirates

DOI:

10.3791/50585

⸱

26 september 2013

 ,  ,  ,  , 
1Cytori Therapeutics Inc, 2Division of Cardiac Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 3Division of Plastic and Reconstructive Surgery, Department of Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 4Department of Orthopedic Surgery, David Geffen School of Medicine at UCLA, 5Regenerative Bioengineering and Repair Laboratory, David Geffen School of Medicine at UCLA

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In 2001, onderzoekers van UCLA beschreef de isolatie van een populatie van volwassen stamcellen, genaamd vet-afgeleide stamcellen of ASC, uit vetweefsel. Dit artikel schetst de isolatie van ASC uit lipoaspirates behulp van een handleiding, enzymatische afbraak protocol met behulp van collagenase.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In 2001, onderzoekers van de Universiteit van Californië, Los Angeles, beschreef de isolatie van een nieuwe populatie van volwassen stamcellen uit liposuctie vetweefsel dat ze in eerste instantie genoemd Verwerkte Lipoaspirate Cells of PLA cellen. Sindsdien zijn deze stamcellen zijn hernoemd vetweefsel-afgeleide stamcellen of ASC en zijn gegaan naar een van de meest populaire volwassen stamcellen populaties op het gebied van stamcelonderzoek en regeneratieve geneeskunde geworden. Duizenden artikelen beschrijven nu het gebruik van ASC in verschillende regeneratieve diermodellen, zoals botherstel, perifere zenuwen reparatie en cardiovasculaire techniek. Recente artikelen zijn begonnen met de talloze toepassingen te beschrijven voor ASC in de kliniek. De in dit artikel protocol beschrijft de basisprocedure voor het handmatig en enzymatisch ASC isoleren van grote hoeveelheden lipoaspirates verkregen cosmetische ingrepen. Dit protocol kan gemakkelijk worden opgeschaald of omlaag om accomat de hoeveelheid lipoaspirate en kan worden aangepast aan ASC's uit vetweefsel verkregen via abdominoplasties en andere soortgelijke procedures isoleren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In 2001, een vermeende populatie van multipotente stamcellen uit vetweefsel werd beschreven in het tijdschrift Tissue Engineering 1. Deze cellen kregen de naam Verwerkte Lipoaspirate of PLA cellen als gevolg van hun afleiding van verwerkte lipoaspirate weefsel verkregen door middel van cosmetische chirurgie. De isolatiemethode in dit artikel beschreven is gebaseerd op bestaande enzymatische strategieën voor de isolatie van de stromale vasculaire fractie (SVF) uit vetweefsel 2. De SVF is gedefinieerd als een minimaal verwerkt populatie van rode bloedcellen, fibroblasten, endotheelcellen, gladde spiercellen, pericyten en pre-adipocyten die nog moeten voldoen aan een weefselkweek substraat 2, 3. Kweken van deze SVF tijd wordt voorgesteld veel van deze verontreinigende celpopulaties elimineren en resulteren in een hechtende, fibroblastische bevolking. Deze fibroblasten zijn geïdentificeerd in de literatuur voor de laatste 40 jaar als zijnde pre-adipocyten. Echter, onze onderzoeksgroep aangetoond dat deze cellen bezat mesodermale multipotent en omgedoopt tot de adherente SVF bevolking PLA cellen. Latere studies door tal van andere onderzoeksgroepen hebben toegevoegd aan dit potentieel, wat suggereert zowel endodermale en ectodermale potentials (voor review zie 4). Sindsdien talrijke extra termen voor deze cellen zijn verschenen in de literatuur. Om enige vorm van consensus te bieden, werd de term vetweefsel-afgeleide stamcellen of ASC op de 2e jaarlijkse IFATS conferentie aangenomen. Als zodanig zal de term ASC worden gebruikt in dit artikel.

De in dit artikel beschreven protocol is een betrekkelijk eenvoudige procedure die standaard laboratorium apparatuur vereist en gebruikt eenvoudige reagentia zoals fosfo-gebufferde zoutoplossing, standaard weefselkweekmedium reagentia en collagenase. Het kan grote aantallen ASC naargelang de hoeveelheid uitgangsmateriaal vetweefsel volume en vervolgens c producerenultuur tijd. Echter, de verwerking van een grote hoeveelheid vetweefsel fysieke problemen die kunnen worden verminderd tot een mate met dit protocol presenteren. Bovendien is dit protocol vereist steriele weefselkweek faciliteiten en goedgekeurd bioveiligheid kappen, waardoor het gebruik van een goedgekeurde weefselkweek faciliteit noodzakelijk. Deze eis kan verminderen de bruikbaarheid van de ASC bevolking in klinische toepassingen tenzij ze worden geïsoleerd goede fabricagepraktijken (GMP)-erkende installaties ontworpen voor de isolatie en expansie van materialen voor klinisch gebruik. Als alternatief zou geautomatiseerde systemen die ASC kunnen isoleren in een gesloten systeem in de operatiekamer deze belangrijke kwestie voorkomen, terwijl het onmiddellijke gebruik van ASC zonder enige noodzaak voor daaropvolgende in vitro expansie. Tot op heden zijn er zes geautomatiseerde systemen die commercieel beschikbaar zijn voor de isolatie van cellen uit menselijk weefsel. Deze systemen maken het mogelijk isoleren van eenaanzienlijk aantal ASC uit grote hoeveelheden vetweefsel onmiddellijk na de oogst. Deze ASC kunnen daarna opnieuw in de patiënt voor verschillende regeneratieve doelen zonder de patiënt ooit de operatiekamer verlaten. Daarnaast protocol beschrijft de handleiding isolatie van ASC, is een protocol voor isolatie van geautomatiseerde ASC met het Celution systeem eveneens in een begeleidend artikel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hier getoonde protocol beschrijft de handleiding isolatie van ASC uit lipoaspirates verkregen door middel van cosmetische procedures met behulp van enzymatische spijsvertering en differentiële centrifugatie. Dit protocol werd voor het eerst gepubliceerd in het tijdschrift Tissue Engineering in 2001 1, waarbij de resulterende cellen werden genoemd Verwerkte Lipoaspirate Cells of PLA cellen vanwege hun isolatie van lipoaspirates. Echter, de term PLA cel nu vervangen door de term vet-afgeleide stamcellen of ASC om het veld een soort van overeenstemming op het gebied van nomenclatuur geven. De cellen geïsoleerd door dit protocol is aangetoond door velen mesodermale potentiële bezitten zowel in vitro als in vivo (voor overzicht zie 4). Daarnaast hebben de ectodermale en endodermale potenties van de ASC ook onderzocht 4. De isolatie techniek is eenvoudig en duidelijk en vergt ongeveer een uur in beslag. De resulterende cels worden gekweekt onder standaard weefselkweekomstandigheden. Met cultuur tijd, de ASC bevolking wordt meer homogeen, bestaande uit fibroblastische cellen die gemakkelijk uitbreiden en vertonen een goede levensvatbaarheid op de lange termijn in de cultuur.

Opmerking: De volgende onderdelen van de uitrusting die nodig zijn worden vermeld aan het eind van dit artikel. Alle glaswerk, en reagentia moeten worden gesteriliseerd door autoclaveren of gefiltreerd door 0,22 um filters. Aseptische weefselkweek technieken moeten te allen tijde worden opgevolgd. Om dit te garanderen, moeten alle materialen geplaatst in de bioveiligheid kast worden gesteriliseerd door te besproeien met een 70% ethanol-oplossing en vegen met schone papieren handdoeken.

1. Voorafgaand aan Harvest, Bereid de volgende:

  1. Steriele 1X-fosfo-gebufferde zoutoplossing (PBS) voor het wassen van de lipoaspirates. Bereid ongeveer 1 L 1x PBS per 100 ml lipoaspirate. Autoclaveer de PBS en alleow afkoelen tot kamertemperatuur vóór gebruik. Optioneel kan antibiotische / antimycotische worden toegevoegd tot een eindconcentratie van 100 IE / ml penicilline, 100 pg / ml streptomycine en 2,50 ug / ml amfotericine B als de PBS is afgekoeld.
  2. Steriele 0,075-,1% collagenase type IA (van Clostridium histolyticum) voor enzymatische afbraak van de lipoaspirate. De concentratie zal afhangen van de kwaliteit en de bron van de collagenase - dwz ruwe versus gezuiverd. Andere collagenase types kunnen worden gebruikt (type bijvoorbeeld collagenase II of IV) bij vergelijkbare concentraties. Bereiden in 1x PBS en steriel filter met een 1000 ml filtersysteem met een 0,22 urn filter (Figuur 1A). Echter, steriele glazen flessen voorzien van een dop filter kan ook worden gebruikt. Bereiden en te gebruiken bij kamertemperatuur. Collagenase oplossingen worden opgeslagen korte termijn bij 4 ° C totdat het nodig is. Laat de collagenaseoplossing niet bevriezen omdat het de werking kan verminderen.
  3. Steriel Controle Medium (CM) voor collagenase inactivatie en het kweken van de ASC bevolking. 500 ml CM, combineren de volgende: 500 ml DMEM (4,5 g / L glucose, met L-glutamine), 50 ml foetaal runderserum (hitte geïnactiveerd), 5 ml penicilline / streptomycine (10.000 IE penicilline, 10.000 pg / ml streptomycine). Optioneel kan 5 ml amfotericine B (250 ug / ml amfotericine B) worden toegevoegd. Steriele filtratie van het medium is vereist als niet-steriele sera worden gebruikt. Plaats de CM in een 37 ° C waterbad van 30 min voorafgaand aan gebruik opwarmen het medium.
  4. Steriel uit glas en plastic voor isolatie. Autoclaaf een 1000 ml bekerglas en laat afkoelen tot kamertemperatuur vóór gebruik. Daarnaast hebben de volgende plasticware klaar: aseptische serologische pipetten (5 ml, 10 ml en 25 ml), 50 ml centrifuge buizen, en weefselkweek behandeld cultuur gerechten.

2. Isolatie van ASC uit Lipoaspirates

De meeste lipoaspirates worden verzameld in een aspiratie container (zie figuur 1B) en kunnen bestaan ​​uit drie verschillende lagen: 1) een bovenste olielaag door de lyse van mature adipocyten, 2) een middelste laag van vetweefsel, en 3) een bodem, vloeibare infranatant met zoutoplossing en verontreinigende celtypen zoals rode bloedcellen (RBC). De bovenste olielaag mag niet in significante hoeveelheden aanwezig zijn. Indien aanwezig, moet worden afgezogen olie verontreiniging van de resulterende cultuur ASC de levensvatbaarheid van de cultuur kunnen beïnvloeden. De onderste infranatant moeten worden verwijderd vóór verwerking verontreiniging van de ASC culturen met RBC minimaliseren. Dit zal het midden, vetweefsel laag, die vervolgens zal worden gewassen en enzymatisch verteerd aan zijn cellulaire, stromale vasculaire fractie (SVF) bevrijden vertrekken.

  1. Het wassen van de lipoaspirate: Open de lipoaspirate container in de weefselkweek hood en zorgvuldig decanteren de lipoaspirate in een steriele 1 L glazen beker. Laat de lipoaspirate lagen te scheiden, totdat het vetweefsel laag goed wordt gescheiden (Figuur 1B).
    1. Zuig de olie laag (indien aanwezig) in een steriel glazen pipet en de onderste zoutoplossing infranatant met een 10 ml serologische pipet. Dit zal de grote meerderheid van verontreinigende rode bloedcellen en zoutoplossing te verwijderen.
    2. Beoordeel de omvang van de resulterende vetweefsel laag en voeg steriele 1x PBS bij een gelijk volume. Roer de verzamelbak met de pipet voor aspiratie om de lipoaspirate mengen met PBS. Laat de twee lagen te vestigen. Zoals hierboven opgemerkt, kan de 1x PBS aangevuld met antibiotica / antimycotica.
    3. Zuig het infranatant met behulp van een 10 ml serologische pipet.
    4. Blijf de vetweefsel fractie wassen zoals beschreven in stappen 2.1.2. en 2.1.3. totdat de vetlaag heeft een gele / gouden kleur. Aspireren the infranatant een laatste keer, waardoor het vetweefsel fractie in het bekerglas. Om een ​​adequate verwijdering van de infranatant zorgen, zodat de lipoaspirate lagen rusten gedurende 5 minuten na de laatste wasbeurt en vóór de definitieve aspiratie.
  2. Enzymatische digestie van het lipoaspirate: Bereid steriele collagenase 1A oplossing zoals hierboven aangegeven in een filtereenheid. Bereid een hoeveelheid equivalent aan die van de vet fractie en steriele filter.
    1. Na filtratie van de collagenase oplossing, gooi de bovenste filter unit, giet de gewassen vet fractie in de collagenase oplossing en goed sluiten van de fles.
    2. Plaats de collagenase / vet mengsel in een 37 ° C waterbad en verteren 37 ° C gedurende 30 minuten. Zwenk de collagenase / vet mengsel elke 5-10 minuten en plaats terug in het waterbad. Het vetweefsel laag moet op een "soepeler" uiterlijk (Figur nemene 1B) als de vertering verloopt. Aanvullende digestietijden (dwz tot 2 uur) kan worden gebruikt wanneer het vetweefsel laag verschijnt nog zuivere stukken vet daarin.
  3. Isolatie van ASC: Plaats de verteerde collagenase / vet mengsel terug in de bioveiligheid kast. Zorg ervoor dat de filter unit met 70% ethanol steriliseren voorafgaand aan het plaatsen terug in de kast.
    1. Pipetteer 25 ml porties van de infranatant met de SVF in steriele 50 ml centrifuge buizen.
    2. Voeg 25 ml CM aan elke buis. Laat de CM op de collagenase inactiveren door incubatie bij kamertemperatuur in de kast voor 5 minuten.
    3. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1200 xg om de SVF als een pellet te verzamelen.
    4. In de bioveiligheid kast, zuig het supernatant van elke buis. Zorg ervoor dat de bovenste olielaag en een drijvend adipocyten worden opgezogen met dit supernatant ( Figuur 1B).
    5. Combineer de SVF pellets in een centrifugebuis met behulp van 30 ml CM en verdeel gelijkmatig over twee nieuwe 50 ml centrifuge buizen. Centrifuge als in stap 2.3.3. en zuig de supernatanten van de twee SVF pellets (niet in figuur).
      OPTIONEEL: Als RBC lysis gewenst, resuspendeer elk SVF pellet in 10 ml van een RBC lysis buffer (160 mM NH4Cl) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Centrifuge als in stap 2.3.3. en zuig de supernatanten de SVF pellets (niet in figuur) verkregen.
    6. Combineer de twee SVF pellets in een nieuwe centrifugebuis gebruik van 5-10 ml CM (Figuur 1B).
    7. Uit te filteren grotere weefsel deeltjes, pipet de geresuspendeerde SVF pellet op een 100 um mesh filter geplaatst op de top van een nieuwe 50 ml centrifugebuis en laten filteren door zwaartekracht.
    8. Pipetteer aliquots van geresuspendeerde(En gefilterd) SVF pellet met de ASC op weefselkweek behandeld cultuur gerechten. Supplement elk gerecht met een geschikt volume van CM.
    9. Kweek van de cellen in CM 3-4 dagen bij 37 ° C, 5% CO2 onveranderd media.

Na deze eerste kweekperiode, kan het kweekmedium worden opgezogen en elke verontreinigende rode bloedcellen voorzichtig verwijderd door wassen met steriele 1XPBS. Vervangen met CM en blijven de cultuur van de ASC's als dat nodig is. Het type weefselkweekplaat gebruikt en hoe de geresuspendeerde pellet SVF verdeeld over deze gerechten zal afhangen van het aantal cellen gewenste volgens conventionele weefselkweek.

3. Karakterisering van de ASC Bevolking: flowcytometrie en multilineage Differentiatie

Eenmaal geïsoleerd, moet karakterisering van de ASC bevolking worden uitgevoerd. Conventionele benaderingen hiervoor zijn stroom cytometrie naar het celoppervlak antigen CD profiel van de cellen te karakteriseren en in vitro differentiatie van hun multilineage differentiatie capaciteit bevestigen. Terwijl meerdere lijnen kan worden beoordeeld ASC Dit protocol beschrijft de differentiatie van ASC in cellen van de adipogene, chondrogene en osteogene geslachten als middel bevestiging multilineage mesodermale potentialen 5.

In vitro multi-lijn Differentiatie van ASC

  1. Osteogene Differentiatie van ASC: Voorafgaand aan inductie, bereiden Osteogeen Medium (OM) als volgt: Voor een fles van 500 ml DMEM (4,5 g / ml glucose) toe 25,0 ml FBS (5,0% eindconcentratie) en 5,0 ml penicilline / streptomycine (10.000 IE / ml en 10.000 mg / ml eindconcentraties respectievelijk). Voeg hieraan de volgende osteogene inductie agenten om de aangegeven eindconcentraties: dexamethason (0,1 uM finale), L-ascorbinezuur 2-fosfaat (50,0 uM finale) En β-glycerofosfaat (10,0 mm definitief).
    1. Voorafgaand aan inductie, oogsten en plaat de gekweekte ASC in de gewenste weefselkweekschaal zodat een confluentie van ongeveer 50% bereikt. Voor elke experimentele gerecht plated, plaat een extra schotel voor een niet-geïnduceerde controle. Cultuur overnachting in CM.
      Let op: 50% confluentie wordt aanbevolen om te zorgen voor voortdurende proliferatie die zich kunnen voordoen in de loop van de inductie
    2. Op de dag van inductie, verwijder het medium en voeg de volgende: OM om de gewenste osteogene experimentele putten en CM aan de controles. De hoeveelheid medium zal afhangen van de grootte van de weefselkweekplaat. Voor 12 putjes, 1,0 ml van media per put is voldoende. Voor 6 putjes, 2,0 ml van media per put is voldoende. Voor 100 mm schalen moet 10,0 ml medium per schaal worden gebruikt.
    3. Kweek van de cellen gedurende minimaal 14 dagen met veranderingen van het geschikte medium elke 3-4dagen. Sterk osteogene ASC populatie kan tekenen van extracellulaire minerale afzetting zien zo vroeg 7 dagen inductie.
    4. Osteogene differentiatie (dwz extracellulaire minerale afzetting) kan worden bevestigd met behulp van een von Kossa histologische kleuring voor calciumfosfaat. Deze kleurstof een zwart-bruine precipitaat identificeren van de aanwezigheid van extracellulair calcium fosfaat (zie figuur 2) te produceren.
      Knoeit von Kossa reagens:
      1. Verwijder de OM uit de experimentele cellen en CM van de controlecellen
      2. Fixeer de cellen gedurende 60 min in 4,0% paraformaldehyde bereid in 1x PBS.
      3. Was de cellen tweemaal met 1 x PBS.
      4. Incubeer de cellen met 2,0% zilvernitraat (bereid in water) in het donker gedurende 30 minuten.
      5. Verwijder de zilvernitraat, was twee keer met gedestilleerd water en lucht-drogen de cellen.
      6. Blootstellen van de cellen aan UV-licht gedurende 60 minuten aan de cal ontwikkelencium fosfaat neerslag.
      7. Was de cellen meerdere malen met 1XPBS.
      8. Tegenkleuring de cel met hematoxyline indien gewenst.
  1. Adipogene Differentiatie van ASC: Voorafgaand aan inductie, bereiden adipogene Medium (AM) als volgt: Voor een fles van 500 ml DMEM (4,5 g / ml glucose) toevoegen 50,0 ml FBS (10,0% uiteindelijke concentratie) en 5,0 ml penicilline / streptomycine (10.000 IE / ml tot 10.000 pg / ml eindconcentraties respectievelijk). Voeg hieraan de volgende adipogene inductie agenten om de aangegeven eindconcentraties: dexamethason (1,0 uM finale), 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX - 0,5 mM definitief), indomethacine (0,2 mM finale) en insuline (10,0 uM finale ).
    1. Voorafgaand aan inductie, oogsten en plaat de gekweekte ASC in de gewenste weefselkweekschaal zodat een confluentie van ongeveer 80% bereikt. Voor elke experimentele gerecht plated, plaat een toevoegingAl schotel voor een niet geïnduceerde controle. . Cultuur overnacht in CM Opmerking: adipogene differentiatie van ASC lijkt efficiënter met verhoogde confluentie te zijn.
    2. Op de dag van inductie, verwijder het medium en voeg de volgende: AM om de gewenste osteogene experimentele putten en CM aan de controles. De hoeveelheid medium zal afhangen van de grootte van de weefselkweekplaat. Voor 12 putjes, 1.0.ml van media per put is voldoende. Voor 6 putjes, 2,0 ml van media per put is voldoende. Voor 100 mm schalen moet 10,0 ml medium per schaal worden gebruikt.
    3. Kweek van de cellen gedurende minimaal 14 dagen met veranderingen van het geschikte medium elke 3-4 dagen. Sterk adipogene ASC populatie kan tekenen van lipide vacuole vorming zien zo vroeg 7 dagen inductie.
    4. ASC ondergaan adipogene differentiatie zal meerdere lipide vacuolen die gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd onder de lichtmicroscoop te ontwikkelen. Bovendien kan adipogene differentiatieworden bevestigd met een Oil Red O histologische vlek die zich ophopen in deze vacuolen (zie figuur 2).
      Knoeit Oil Red O:
      1. Verwijder het papier uit de experimentele en controle cellen en zet ze gedurende 60 minuten met behulp van een 10% formele calcium fixeermiddel. Om dit fixatief bereiden combineren de volgende: 1,0 g CaCl2, 25,0 ml 16% paraformaldehyde (4,0% eind) en 75,0 ml gedestilleerd water.
      2. Was de cellen twee keer met 1x PBS.
      3. Was de cellen kort met 70% ethanol.
      4. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten met Oil Red O oplossing. Om de Oil Red O oplossing te bereiden, te ontbinden 2,0 g Oil Red O poeder in 50,0 ml 70% ethanol en 50,0 ml aceton.
      5. Was de cellen met 70% ethanol en vervolgens met kraanwater.
      6. Visualiseer de cellen snel na kleuring te wijten aan het verbleken van de vlek met de tijd.
  1. Chondrogene differentiatie van ASC: chondrogene differentiatie wordt bereikt door een aangeduid als "micromassakweek" high-density kweektechniek. Vóór cultuur bereiden Chondrogenische Medium (ChM) als volgt: Aan een 500 ml fles DMEM (4,5 g / ml glucose) voeg 5,0 ml FBS (1% eindconcentratie) en 5,0 ml penicilline / streptomycine (10.000 IE / ml en 10.000 ug / ml eindconcentraties respectievelijk). Voeg hieraan de volgende chondrogenische inductie agenten om de aangegeven eindconcentraties: L-ascorbinezuur-2-fosfaat (50,0 ug / ml definitief), insuline (6,25 ug / ml definitief), transferrine (6,25 ug / ml definitief) en TGFB1 (10,0 ng / ml).
    1. Oogst de ASCs en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1200 xg om de cellen te pelleteren. Tel de cellen om de dichtheid van de celsuspensie bepalen.
    2. De micromassa pellets bereiden bereiden twee celsuspensies: een experimentele suspensie bereid in ChM bij een dichtheid van 1 x 10 7 cellens / ml en een controle suspensie bereid in CM bij een dichtheid van 1 x 10 7 cellen / ml.
      1. Plaats 10,0 gl "druppels" van de cellulaire suspensie in afzonderlijke putjes van een multi-putjes. Laat hechten gedurende 2-3 uur bij 37 ° C.
      2. Voorzichtig overlay de vergulde druppeltjes met ofwel ChM of CM zorg dat u de cellen niet te distantiëren.
      3. Kweek van de cellen tot 14 dagen ChM of CM veranderingen in medium elke 3-4 dagen. Cellen gekweekt in ChM zal condenseren in deze tijd een hoge dichtheid Micromass pellet met weinig tot geen cellen in een omringend monolaag vormen. Controle cellen gekweekt zal deze condensatie niet ondergaan en velen zullen worden gevonden als een monolaag.
      4. Om chondrogenese bevestiging, bevestig de korrels gedurende 15 min in 4,0% paraformaldehyde (bereid in 1x PBS) bij kamertemperatuur. Vlekken op de aanwezigheid van gesulfateerde proteoglycanen met een alcianblauw histologische kleuring.
        Om vlekken gebruik Alcian Blue:
        1. Was de pa-raformaldehyde vaste pellets keer in 1x PBS.
        2. Incubeer de pellets in 0,1 N HCl (pH 1,0) gedurende 5 minuten om de pH te verlagen.
        3. Verwijder de HCl en voeg 1% alcianblauw reagens (bereid in 0,1 N HCl, pH 1.0). Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd.
        4. Verwijder de alcianblauw reagens en was de pellets met 0,1 N HCl (pH 1,0) om overtollig vlek te verwijderen.
        5. Extra wassingen met leidingwater kan worden gebruikt om achtergrondkleuring te verminderen.
        6. Als alternatief kan de Micromass pellets worden geoogst nacht in 10% formaline gefixeerd, in paraffine ingebed en de secties gekleurd voor Alcian Blue.

4. Flowcytometrische Karakterisering van ASC

Karakterisering van het celoppervlak antigen CD-profiel kan worden bereikt door conventionele flowcytometrie.

  1. Voorbereiding van ASC voor flowcytometrie: Priorde analyse, bereiden een flowcytometrie Buffer (FCB) bestaat uit de volgende: 1.0% BSA, 2,0% FBS en 0,025% saponine bereid in 1x PBS.
    1. Oogst de ASCs en centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 1200 xg om een ​​pellet te produceren.
    2. Resuspendeer de cellen in steriele 1XPBS en tel de cellen met een hemocytometer. Bepaal de celdichtheid van de suspensie.
    3. Verdeel de suspensie boven in hoeveelheden van 5 x 10 5 cellen totaal en centrifugeer tot pellet.
    4. Verwijder het supernatant PBS en vast de cellen gedurende 60 minuten bij -20 ° C met een overmaat ijskoude 70% ethanol. Indien nodig kunnen deze cellen worden in deze 70% ethanol in een -20 ° C vriezer totdat het nodig is.
    5. Na fixatie voorzichtig zuigen ethanol en voorzichtig was de pellet twee keer met een overmaat FCB. Te wassen:
      1. Voeg een overmaat FCB en voorzichtig resuspendeer de pellet.
      2. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 1200 xg om de cellen te verzamelen eensa pellet.
      3. Zuig het FCB supernatant voorzichtig.
      4. Herhalen.
    6. Verwijder de laatste FCB wassen supernatant uit elke fractie en resuspendeer in 100 pl van FCB. Voeg de gewenste fluorochroom-geconjugeerde primaire antilichaam met behulp stelde verdunning van de fabrikant. Incubeer de cellen op ijs met het antilichaam gedurende 30 minuten.
      Opmerking: Als fluorochroom-geconjugeerde primaire antilichamen niet beschikbaar zijn, kunnen niet-geconjugeerde primaire antilichamen worden gebruikt.
    7. Voor elk fluorochroom (bijv. FITC, PE), incubeer een monster van cellen met 100 ml FCB met isotype-gematchte IgG als negatieve controle.
    8. Incubeer een aliquot in 100 ml FCB die geen antilichamen als extra controle.
    9. Was elk monster van cellen twee keer met FCB zoals beschreven in stap 4.1.5. Na de laatste wasbeurt, resuspendeer de fracties in 100 ml van FCB en ga verder met flow-analyse.
      Opmerking: Als niet-geconjugeerde primaire antilichamen werden gebruikt: Na deze wasstap incubeer de monsters op ijs gedurende 20 minuten met FCB aangevuld met de fluorochroom-geconjugeerde tweede antilichaam gebruikt zonder verdunning van de fabrikant. Was tweemaal zoals in stap 4.1.5.
  2. Flow analyse van ASC: Voor flow-analyse, moet een minimum van 10.000 gebeurtenissen worden geteld. Ongekleurd en isotype gematchte controles worden gebruikt om poorten instellen door voorwaartse verstrooiing (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC). Hiertoe moet het geen enkele controle antilichaam (dwz ongekleurde) van stap 4.1.8 worden gebruikt om vuil en dode ASC elimineren. De IgG-isotype-overeenkomende controles van stap 4.1.7. worden gebruikt om gebieden van positieve fluorescentie vastgesteld.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hiervoor beschreven protocol beschrijft een handleiding enzymatische methode voor het isoleren van een SVF uit een groot volume lipoaspirate monster. Binnen deze SVF zijn talrijk celpopulaties, waaronder de ASC. Talrijke studies stellen dat het kweken van deze SVF onder standaard weefselkweek voorwaarden zullen kiezen voor een aanhanger fibroblast bevolking die hoofdzakelijk bestaat uit het type ASC. Consistent hiermee hebben we aangetoond, met flowcytometrie en immunofluorescentie, dat gekweekte SVF pellets worden i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vetweefsel voor de isolatie van ASC kan komen in vele vormen: van stevige stukjes weefsel verkregen door middel van resectie of lipoplasty om kleinere stukken verkregen via ofwel spuit extractie of-zuig bijgestaan ​​lipoplasty (dwz liposuctie). Of meer SVF cellen (en daarmee ASC's) kan worden verkregen bij gereseceerde of weggezogen vet monsters is onduidelijk tegenstrijdige studies zijn gepresenteerd 16, 17. Het is mogelijk dat beide vormen van vetweefsel is meer dan geschikt voor de isolatie va...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs van dit manuscript zijn mede-uitvinders op een patent in handen van de Regenten van de Universiteit van Californië en in licentie gegeven aan Cytori Therapeutics.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen erkennen en dank die aanvullende onderzoek personeel die hebben bijgedragen aan de ontwikkeling van het protocol beschreven en de isolatie van ASC, waaronder: dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr Hiroshi Muzuno, MD, Dr Jerry Huang, MD , Dr Adam Katz, MD, Dr William Futrell, MD, Dr Rong Zhang, DDS, PhD, dr. Larissa Rodriguez, MD, Dr Zeni Alfonso, PhD, en Dr John Fraser, PhD. De gepresenteerde resultaten werden gefinancierd, voor een deel, door onderzoek subsidies van de National Institutes of Health, waaronder de NIAMS en NIDCR Instituten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Reagens
DMEM (Dulbecco’s Modificatie van Eagle’s Medium)Mediatech Cellgro10-013-CVmet 4,5 g/ml glucose, L-glutamine, natriumpyruvaat
Penicilline/StreptomycineMediatech Cellgro30-002-CI10.000 IE/ml penicilline/10.000 μg/ml streptomycine
Amphotericine BMediatech Cellgro30-003-CF250 μg/ml amphotericine B
10X PBS (Fosfaat-gebufferde zoutoplossing)Mediatech Cellgro25-053-CIzonder calcium, zonder magnesium
Trypsine/EDTAMediatech Cellgro20-031-CV0,25% trypsine/2,21mM EDTA
Collageenase type IA (van Clostridium histolyticum)SigmaC2674ruwe bereiding; <125 collageen verterings-eenheden/mg vaste stof
FBS (Foetaal Rundserum) hitte-geïnactiveerdGemini Bioproducts100106USDA-bron, hitte-geïnactiveerd
10 ml serologische pipettenGenesee Scientific12-104
25 ml serologische pipettenGenesee Scientific12-106
50 ml polypropyleen centrifugebuizenGenesee Scientific21-106
100 mm weefselkweekschotelsGenesee Scientific25-202
150 mm weefselkweekschotelsGenesee Scientific25-203
500 ml Stericup-filtereenhedenMilliporeSCGPU05REPES-membraan, 0,22 μm porie
CelsiftersFisherBrand22-363-549100 μm nylon gaas
dexamethason - wateroplosbaarSigmaD-2915
L-ascorbinezuur 2-fosfaatSigmaA-8960
β-glycerofosfaat dinatriumzoutSigmaG-9422ook bekend als glycerofosfaat
insulineSigmaI-6634gemaakt van rundse alvleesklier
indomethacineSigmaI-7378
apo-transferrineSigmaT-4382
TGFβ1R&D Systems240-B-002recombinant humaan
Oil Red OSigmaO-0625
Alcian BlauwSigmaA-5268
ZilvernitraatSigmaS-0319
ZoutzuurFisher ScientificA144
ParaformaldehydeFisher Scientific30525-89-4geleverd als een 16% stockoplossing
[header]
Benodigde apparatuur
Klasse II A/B BioveiligheidskapThermo Scientificzorg ervoor dat de kap vacuümleidingen heeft voor aspiratie
Centrifuge voor op tafelHermle LabnetZ383Zwaai-uit rotor voor 50 ml buizen vereist, geschikt voor 1200xg
WaterbadFisher Scientific IsotempS52602Q5-10L capaciteit, geschikt voor 37C
Automatische Pipet HulpmiddelenDrummond Pipet Hulp XL4-000-105
CO2 IncubatorThermo ScientificForma 310directe warmte of watermantel

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7 (2), 211-226 (2001).
  2. Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
  3. Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29 (5), 570-576 (1973).
  4. Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. , in press (2012).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
  6. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24 (2), 376-385 (2006).
  7. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16 (1), 91-104 (2007).
  8. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208 (1), 64-76 (2006).
  9. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214 (2), 413-421 (2008).
  10. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. , (2012).
  11. Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128 (3), 663-672 (2011).
  12. Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7 (1), 64-76 (2011).
  13. Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187 (4), 263-274 (2008).
  14. Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174 (5), 2041-2045 (2005).
  15. Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24 (1), 70-77 (2009).
  16. Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11 (7), 947-957 (2009).
  17. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8 (2), 166-177 (2006).
  18. Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31 (2), 214-224 (2011).
  19. Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10 (12), 1363-1369 (2012).
  20. Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18 (4-5), 193-197 (2008).
  21. Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120 (6), 1510-1517 (2007).
  22. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6 (1), 11-14 (2010).
  23. Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
  24. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45 (2), 115-120 (2008).
  25. Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
  26. Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide. Stem Cells Dev. 19 (10), 1449-1470 (2010).
  27. Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
  28. Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4 (3), 281-289 (1995).
  29. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40 (8-9), 268-277 (2004).
  30. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3 (5), 705-715 (2008).
  31. Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121 (3), 1033-1041 (2008).
  32. Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30 (5), 965-974 (2012).
  33. D'Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14 (3), 233-242 (2008).
  34. Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4 (2), 200-210 (2011).
  35. De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4 (8), e6537(2009).
  36. Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214 (5), 759-767 (2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Stromale vasculaire fractiecollagenase digestiewassen van lipoaspiraatcelisolatiecentrifugeringsprotocolweefselkweekdifferentiatie assaysadipogeneosteogene en chondrogene lineage

Gerelateerde artikelen