Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

Samenvatting

We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR's met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.

Samenvatting

Structurele en dynamische studies van G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) signalering complexen te vergemakkelijken, zijn nieuwe benaderingen nodig zijn om informatieve probes of labels introduceren in uitgedrukt receptoren die geen receptor functie niet verstoren. We gebruikten amber codon suppressie technologie genetisch coderen van het niet-natuurlijke aminozuur, p-azido-L-fenylalanine (azf) bij verschillende gerichte posities in GPCRs heteroloog tot expressie gebracht in zoogdiercellen. De veelzijdigheid van de azidogroep is hier weergegeven in verschillende toepassingen GPCR bestuderen in hun natieve cellulaire omgeving of in detergens gesolubiliseerde omstandigheden. Ten eerste tonen we een cel-gebaseerde gerichte fotoverknoping technologie aan de residuen in de ligand-bindingsplaats van GPCR wanneer een tritium-gelabeld kleine moleculen ligand verknoopt een genetisch gecodeerd aminozuur azido identificeren. We tonen dan plaatsspecifieke modificatie van GPCR's door de bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligatie reactiestie dat de azidogroep richt met behulp van fosfine derivaten. We bespreken een algemene strategie voor gerichte peptide-epitoop tagging van uitgedrukt membraaneiwitten in-cultuur en de detectie met behulp van een whole-cell-gebaseerde ELISA aanpak. Tot slot laten we AZF-GPCR selectief kan worden gelabeld met fluorescente probes. De methoden besproken algemeen, aangezien zij kunnen in beginsel worden toegepast op elk aminozuur positie in een GPCR tot expressie actieve signalering complexen ondervragen.

Inleiding

Heptahelical G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR's) omvatten een superfamilie van zeer dynamische membraaneiwitten die belangrijk en diverse extracellulaire signalen mediëren. In het klassieke paradigma wordt receptoractivering gekoppeld ligand geïnduceerde conformatieveranderingen. ^{1, 2} hebben recente ontwikkelingen in de structurele biologie van GPCRs belangrijke inzicht in de moleculaire mechanismen van transmembraan signalering ontvangen. ^3-5 echter te begrijpen met een grotere nauwkeurigheid de chemische werkingsmechanisme en structurele dynamica van GPCR-signalering, is een toolkit van benaderingen nodig zijn om informatieve moleculaire en chemische probes te nemen aan actieve signalering complexen ondervragen.

Daarom passen wij een methode om plaatsspecifiek voeren niet of minimaal storende sondes in expressie receptoren gebaseerd op natuurlijk aminozuur (UAA) mutagenese met amber codon suppressie technologie eerder ontwikkeld door Schultz en coworkers. ⁶ We geoptimaliseerd de UAA mutagenese methode om een high-yield expressie en mutagenesesysteem voor eiwitten zoals GPCR's, die moeilijk uit te drukken in een andere dan de zoogdiercellen meeste heterologe systemen zijn te bereiken. Met behulp van een orthogonale gemanipuleerde suppressor tRNA en evolueerde aminoacyl-tRNA synthetase paar voor een specifiek UAA, we plaatsspecifiek geïntroduceerd UAAs in uitgedrukt doel GPCR's. De succesvolle integratie van UAAs, p-acetyl-L-fenylalanine (ACF), p-benzoyl-L-fenylalanine (BZF), en p-azido-L-fenylalanine (azf) is aangetoond in ons model GPCRs - rhodopsine en menselijke CC chemokine receptor CCR5. ^{7, 8}

In beginsel kan een UAA genetisch gecodeerd op elke positie in het eiwit sequentie en deze woning is een waardevol biochemische instrument omdat het zorgt voor single-codon scannen van een doel GPCR. We richten ons hier specifiek op de veelzijdigheid van de UAA, AZF, die een reactieve Azi heeftdo groep. Naast het dienen als een uniek infrarood (IR) sensor, ^{8, 9} azf kan ook dienen als een fotoactiveerbare verknoper door reactie met naburige primaire aminen of alifatische waterstofatomen. Bovendien kan het biologisch inerte azidogroep nemen als een selectief chemisch handvat bioorthogonal labelingsreacties. Hier laten we voorbeelden illustreren de nuttige toepassingen van plaats-specifieke incorporatie van AZF in GPCRs, zoals gerichte fotoverknoping te controleren een receptor-ligand-complex en modificatie van GPCR door bioorthogonal epitoop tagging en fluorescente labeling strategieën.

Fotoactiveerbare reagentia zijn gebruikt om biologische systemen te bestuderen sinds 1960. ¹⁰ In deze periode zijn een overvloed aan receptor-ligand verknoping experimenten gerapporteerd dat GPCR complexen studie, waarvan de meeste betrekking het gebruik van foto-affiniteit liganden. ^{11, 12} Echter, deze toepassingen zijn technisch beperkt, aangezien zij require synthese van liganden richting een verknopende groep. ^13-15 bovendien de crosslinker deel in het ligand, is het een uitdaging om de locatie van de verknoping bepalen de GPCR. Plaatsspecifiek introduceren fotoverknopende groepen UAAs in eiwitten met het amber codon onderdrukking technologie is een waardevolle vooruitgang. ^{16 17} We ontwikkelden een fotoverknoping techniek om de binding interface op een receptor die betrokken is bij de vorming van een receptor-ligand-complex te identificeren levende cellen door de invoering fotolabiele groepen in GPCR's. ^{18, 19} Hier beschrijven we de experimentele protocol en de wijze van data-analyse voor de toepassing van deze gerichte fotoverknoping technologie om de bindingsplaats van een klein-molecule ligand, tritiumhoudend maraviroc, op CCR5 identificeren. Deze werkwijze in op de precieze kwantificering van de radioactieve handvat op het ligand, naast behoud van de natuurlijke chemische structuur van het ligand.

Fluorescentie-gebaseerde technieken ondersteunen juist begrip van de structurele basis van receptoractivering door direct sonderen van de conformationele toestand van de receptor. ^{20, 21} echter technieken bezit de flexibiliteit om fluorescerende labels introduceren in GPCRs plaatsspecifiek beperkt. Wij zijn geïnteresseerd in het gebruik van bioorthogonal chemische modificatie strategieën om single-molecule detectie (SMD) van GPCR signalering complexen te vergemakkelijken. ²² De azidogroep kan deelnemen aan bioorthogonal chemicaliën zoals Staudinger-Bertozzi ligatie, ^{23, 24} kopervrije-stam bevorderd azide- alkyne cycloadditie (SpAAC) ²⁵ en-koper-gekatalyseerde azide-alkyn cycloadditie (CuAAC). ²⁶ Wij richten ons hier op de Staudinger-Bertozzi ligatie reactie die de specifieke reactie tussen een azide en een fosfine gaat. We demonstreren het gebruik van twee verschillende fosfine derivaten geconjugeerd aan een peptide epitoop (FLAG peptide) of een fluorescerend label(Fluoresceïne) naar plaatsspecifieke modificatie van GPCR's te bereiken.

We hebben eerder geoptimaliseerd voorwaarden voor plaats-specifieke labeling van rhodopsine AZF varianten met de röntgenbron kristalstructuur en dynamische simulaties doelplaatsen die aan oplosmiddel blootgestelde zijn kiezen. ^{27 28} We geïllustreerd tevens de mogelijkheid om zonder achtergrond labeling bereiken door Staudinger- Bertozzi ligatie. ²⁹ We tonen hier de algemene procedure gebruikt voor fluorescente labeling van een detergens gesolubiliseerde receptor die is geïmmobiliseerd op een matrix immuno vervolgens gevisualiseerd door in-gel fluorescentie bereiken. Daarnaast tonen we een nuttige uitbreiding op deze etikettering strategie om posities ontvankelijk voor etikettering op een receptor van onbekende structuur, CCR5 identificeren. Dit wordt uitgevoerd met een gerichte peptide-epitoop tagging strategie die is gebaseerd op bioorthogonal modificatie van AZF-GPCR varianten in een celgebaseerde semi-high throughput format. ³⁰ Ditmethode maakt gebruik van de multi-step detectie eigenschappen van een cel-oppervlak ELISA etikettering gebeurtenissen volgen.

De methoden die we hier besproken zijn algemeen en kunnen in principe worden toegepast op elk GPCR opgenomen met AZF met het amber codon onderdrukking technologie. In de hier gepresenteerde gedetailleerde weergave van de stappen die in zoogdiercellen expressie van receptoren opgenomen met UAAs zoals AZF met het onnatuurlijke aminozuur mutagenese werkwijze en de latere toepassingen structurele en dynamische studies van GPCRs vergemakkelijken protocollen.

Protocol

1. Site-specifieke genetische Oprichting van natuurlijke aminozuren in GPCR

1. Handhaaf HEK293T cellen in DMEM (4,5 g / l glucose, 2 mM glutamine), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in een 5% _CO2 atmosfeer.
2. Transfecteren de cellen gekweekt tot 60-80% confluentie in een 10 cm plaat met behulp van Lipofectamine Plus reagens.
   1. Aan 750 ul DMEM, voeg 10 ul Plus reagens, 3,5 ug GPCR cDNA (pMT4. Rho of pcDNA 3.1. CCR5) bevattende amber stopcodon op een gewenste positie, 3,5 ug tRNA cDNA (pSVB.Yam) en 0,35 ug van mutante amino-acyl tRNA synthetase cDNA voor p-azido-L-fenylalanine (pcDNA.RS). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Ook voeren soortgelijke transfectie met de wt GPCR cDNA (een amber stopcodon bevatten) dienen als controle. Voeg dit mengsel aan 750 ul DMEM met 17 ul lipofectamine. Na equilibreren 15 minuten bij kamertemperatuur, breng detotale volume 4 ml.
   2. Zuig media 10-cm plaat, gelden transfectie mengsel aan cellen en terug naar 37 ° C in 5% _CO2 atmosfeer. Na 4-6 uur, vullen cellen met 4 ml DMEM met 20% FBS en 1 mM azf.
3. De volgende dag, vervang de groeimedia met DMEM met 10% FBS en 0,5 mM AZF.
4. Oogst cellen 48 uur na transfectie, om uitdrukking te analyseren of zich naar fotoverknoping of etikettering procedures in de volgende paragrafen beschreven.
   1. Bevestig expressie van de GPCR amber mutant in aanwezigheid van de UAA van de groeimedia. We doen dit door Westerse immunoblot detectie. Lyse de celpellet in 1% (w / v) dodecyl-β-D-maltoside (DDM) in 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl gedurende 1 uur bij 4 ° C. Centrifugeer het lysaat bij 16.000 xg en de supernatant oplossing onder reducerende omstandigheden door SDS-PAGE. Transfer naar een PVDF membraan en uitvoeren immunoblotanalyse volledige lengte receptor expressie te detecteren met behulp van ee 1D4 mAb (Nationale Cell Culture Center), die een aangelegde epitoop aan het C-uiteinde van de receptor herkent. ³¹

2. Het toewijzen van een ligandbindingsplaats Met behulp van gerichte fotoverknopende

1. 48 uur na transfectie, zuig media uit cellen en vervangen door 4 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Terug naar 37 ° C gedurende 15 minuten.
2. Resuspendeer de cellen met 1 x PBS en overbrengen in een Falcon buis. Centrifugeer bij 1.500 rpm gedurende 2 minuten om de cellen te pelleteren en zuig de supernatant.
3. Resuspendeer de celpellet in 1x Hank's gebufferde zoutoplossing bevattende 20 mM HEPES, pH 7,5, 0,2% BSA en getritieerd ligand binding aan verzadigende concentratie de vereiste tijd en temperatuur receptor-ligand complexvorming te waarborgen.
4. Breng de celsuspensie op een 24-well of 96-well plaat voor fotoactivatie van de AZF bij 365 nm (bijv. gebruik van een UV-A lamp) gedurende 15 min bij 4 ° C. Maintain de plaat op het ijs om te voorkomen dat monster verwarming en cellysis.
5. Breng de cellen aan een Eppendorf buis, centrifuge de cellen neer te slaan, de bovenstaande vloeistof en overgaan tot analyse. De pellets kunnen worden bewaard bij -20 ° C voor toekomstig gebruik.
6. Resuspendeer de celpellets in lysisbuffer die 1% (w / v) DDM, 20 mM Tris-HCl, pH 7,5 en proteaseremmers. Na 1 uur incubatie bij 4 ° C, centrifugeer het cellysaat gedurende 10 minuten bij 16.000 xg en breng het supernatant naar een nieuwe buis.
7. Add mAb 1D4-Sepharose 2B hars aan het supernatant en incubeer overnacht bij 4 ° C aan de GPCR op immunologische met de gemanipuleerde C-terminus mAb 1D4 epitoop. De volgende dag was de kralen meerdere malen met lysisbuffer. Elueer monsters met 1% SDS bij 37 ° C gedurende 1 uur onder schudden.
8. Breng een gedeelte van de elutievloeistof een 15 ml flacon met scintillatievloeistof en tellen op een beta-scintillatieteller om de hoeveelheid specifieke binding van getritieerd ligand kwantificeren ee receptor.
9. Het oplossen van de resterende 1D4 mAb gezuiverd eluens door standaard gel-elektroforese. We gebruiken een 4-12% SDS-PAGE gel en vervolgens semi-droge overdracht naar een PVDF membraan voor immunoblotting. We hebben ook een laan met standaard eiwit ladder naar visuele aanpassing van moleculair gewicht te begeleiden.
   1. Blokkeer de PVDF membraan met 5% melk in TBS buffer die 0,05% Tween-20. Probe het membraan volledige lengte receptor expressie te bevestigen met mAb 1D4 gevolgd door HRP-geconjugeerd anti-muis IgG secundair antilichaam.
   2. Behandel met verbeterde chemiluminescentie (ECL) reagens en bloot membraan film autoradiografie om bands te visualiseren.
10. Knip het membraan met een scheermesje aan elk monster laan scheiden, gevolgd door het snijden op bepaalde molecuulgewicht merkers. Transfer membraan segmenten flesjes met scintillatievloeistof. Kwantificeren van de hoeveelheid tritium in elk membraan segment door te tellen op een beta-scintillatieteller.
11. Identificeer de positievephotocrosslink de detectie van tritium in de schijnbare molecuulmassa gelijk aan de som van dat van de GPCR en de ligand.

3. Gerichte Epitoop Tagging en celoppervlak Enzymgekoppelde Immunosorbent Assay (ELISA)

1. 24 uur na transfectie, was cellen met 1x PBS en 1 ml trypsinize met 1 ml 0,25% trypsine gedurende 3 minuten. Aan te vullen met 9 ml DMEM met 10% FBS en 0,5 mM AZF. Resuspendeer cellen en tel de celdichtheid. We maken gebruik van een standaard hemocytometer.
2. Pre-behandeling van een hoog-bindende, heldere bodem 96-well plaat met 100 ml 0,01 mg / ml poly-D-lysine per putje. Incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur herhaaldelijk wassen met 1 x PBS en drogen.
3. Plaat 200 ul van de getransfecteerde cellen bij een dichtheid van 6 x ^04-08 oktober x 10 ⁴ cellen / putje aan de 96-well plaat en terug naar 37 ° C in 5% _CO2 atmosfeer.
4. Volgende dag voor te bereiden cellen voor etikettering. Was voorzichtig drie keer met 100 pl / well 1x PBS to verwijder AZF met groeimedia. Zorg cellen blijven gehecht, bijvoorbeeld door PBS dat ^{Ca2 +} en ^{Mg2 +.}
5. Bereid 50-200 uM FLAG-triarylfosfine labelingsreagens in 1x HBSS / PBS uit een voorraad gehandhaafd op 5-20 mM in PBS. Breng 60 ml aan elk putje (in drievoud voor elke amber mutant) en terugkeer naar 37 ° C gedurende 30 minuten tot 4 uur. Handhaven van een reeks putten zonder label behandeling in 1x HBSS / PBS. Ook een gew GPCR controle te vergelijken met AZF-GPCR varianten.
6. Was de cellen 3 maal met 100 ul / putje blokkerende buffer, BB (1x PBS, 0,5% BSA), om niet-omgezette label volledig te verwijderen.
7. Breng 100 ul / putje van 4% paraformaldehyde (bereid uit een 16% voorraad in 1x PBS) aan de cellen. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Was driemaal uit met BB.
8. Voer standaard celoppervlak ELISA-protocol om het label receptor en receptor expressie te detecteren. Incubeer met primair antilichaam gedurende 1,5 uur op het ijs gevolgd door secundaire eentibody incubatie bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
   1. Voeg 100 ul van anti-FLAG M2 antilichaam (bijv. 1:2000 verdunning van antilichamen in BB) tot FLAG-peptide epitoop van de FLAG-triarylfosfine labelingsreagens detecteren. Ook probe niet-behandelde putjes label als een negatieve controle. Voeg anti-CCR5 2D7 (we gebruiken een 1:500 verdunning) antilichaam aan een aparte reeks putten om te bepalen gew of AZF-GPCR expressie op het celoppervlak.
   2. Was de cellen drie maal met BB en incubeer met 100 ul HRP-geconjugeerd anti-muis IgG secundair antilichaam (1:2000 verdunning).
   3. Wassen zorgvuldig cellen vijf keer met BB. Voeg 50 ul buffer detectie: Amplex Red, 20 mM H ₂ O _2, 1x PBS (1:10:90 verhouding) en incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur. Verzamel spectrale gegevens op fluorescentie multi-well plaatlezer bij λ = 530 _af en λ _em = 590.

4. Bioorthogonal Fluorescerende Labeling van een GPCR

1. Lyse10 ⁷ geoogste cellen die wt of AZF-Rhodopsin varianten in 1 ml solubilisatie-buffer bevattende 1% (w / v) DM, 50 mM HEPES en Tris-HCl, pH 6,8, 100 mM NaCl, 1 mM _CaCl2 en proteaseremmers 1 uur bij 4 ° C. Centrifugeer het cellysaat bij 15.000 xg gedurende 10 minuten en verzamel de supernatant fractie.
2. Voeg 100 ul 1D4-mAb sepharose 2B hars receptor vast te leggen met behulp van de gemanipuleerde C terminus 1D4 epitoop. Incubeer 12 uur bij 4 ° C. Was de hars driemaal met 0,1% (w / v) DDM in 0,1 M natriumfosfaatbuffer, pH 7,3.
3. Voeg 0,1 mM fluoresceïne-fosfine in een totaal volume van 0,3-0,5 ml receptor geïmmobiliseerd op de immuno matrix (1D4-mAb Sepharose 2B) label. Incubeer 12 uur bij kamertemperatuur geroerd. Centrifuge en verwijder supernatant. Was de hars gereageerde label te verwijderen.
4. Elueer het gemerkte receptor met 100 ml elutiebuffer die 0,1% (w / v) DDM en 0,33 mg / ml nonapeptide (C9 peptide tegen de epitoop 1D4)in 2 mM fosfaatbuffer, pH 6,0 door incubatie op ijs gedurende 1 uur.
5. Los gelabelde monsters met SDS-PAGE onder reducerende omstandigheden. Wassen gels kort in PBS en vervolgens visualiseren etikettering van AZF-GPCR door in-gel fluorescentie. Gebruik bijvoorbeeld een confocale fluorescentie-scanner met een 488-nm laser om receptor gemodificeerd met fluoresceïne detecteren.

Resultaten

We gebruikten het onnatuurlijke aminozuur mutagenese methode voor plaatsspecifiek moleculaire probes introduceren in een GPCR volgens de amber codon onderdrukking technologie. De regeling in Figuur 1 schetst de voornaamste stappen van de methodologie en de verschillende toepassingen van het opnemen van de veelzijdige UAA, p-azido-L-fenylalanine (AZF), in GPCR's. Expressie van AZF-GPCR's in zoogdiercellen maakt het mogelijk gerichte fotoverknoping aan liganden, en gerichte peptide-epitoo...

Discussie

We beschrijven hier een robuuste methode voor plaatsspecifieke integratie van een reactieve probe, AZF, in GPCRs en tonen drie nuttige toepassingen van dit hulpmiddel om de structuur en dynamiek van GPCR bestuderen. Onze methode naar site-specifiek te nemen UAAs omzeilt een fundamenteel probleem met een alternatieve strategie op basis van chemisch labelen ^{32, 33} of vastmaken fotocrosslinkers ³⁴ tot een enkel toegankelijk cysteïne mutant. Hoewel chemische dat cysteïne thiol doelgroepen zijn gebruikt...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS voor azF			(Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho en pcDNA 3.1.CCR5			Bevatten optioneel de amber stopcodon (TAG) op een gewenste positie
HEK 293T-cellen			Aderente cellen
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle-medium (DMEM)	Gibco	10566
Fosfaatbufferoplossing	Gibco	14200
Foetaal bovien serum	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-fenylalanine	Chem-Impex International	6162
			Tabel 1. Specifieke genetische incorporatie van onnatuurlijke aminozuren in GPCR's materialen
Maxima ML-3500S UV-A lamp	Spectronics Corporation		azF wordt geactiveerd door 365-nm licht
Hank's Gebufferde Zout Oplossing (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Bovien serumalbumine	Roche	3117405001
Tritium-gelabelde ligand			Van medewerker (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb geïmmobiliseerd op CNBr-geactiveerde sepharose 2B resin
1% (w/v) natriumdodecylsulfaat (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE uitgevoerd op NuPAGE apparaat
Trans-Blot SD apparaat	Biorad		Apparaat voor semi-droge overdracht
Immobilon polyvinylideen difluoride (PVDF) membraan	Millipore	IPVH00010
Vetvrij melkpoeder	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Scintillatievloeistof
Scintillatiebuisjes	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillatieteller	Perkin Elmer		Beta-Scintillatieteller
Anti-rhodopsine 1D4 mAb	National Cell Culture Center	op maat
Horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd anti-muis IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substraat	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR film	Denville	E3018
			Tabel 2. Materiaal voor gerichte fotocrosslinking
0.25% Trypsine	Invitrogen	15050065
FLAG-triarylfosfine	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
96-well plate	Costar	3601	Duidelijk bodem, hoge binding EIA/RIA
Fosfaatbufferoplossing (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyd	EMS	28908
HRP-geconjugeerd	KPL, Inc.	474-1516
anti-konijn IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Waterstofperoxide	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II fluorescentie multi-well plate reader	Perseptive Biosystems
			Tabel 3. Materiaal voor gerichte peptide-epitope tagging en ELISA op celoppervlak
Fluoresceïne-fosfine			(Huber et al., ingediend 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptid dat de 1D4-epitoop nabootst NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb geïmmobiliseerd op CNBr-geactiveerde sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE uitgevoerd op NuPAGE apparaat
Confocal Typhoon 9400 fluorescentiescanner	GE Healthcare	discontinue	Scanner met 488-nm golflengtelaser
			Tabel 4. Materiaal voor fluorescente labeling