Genetisch gecodeerde Molecular Probes aan G-eiwit gekoppelde receptoren Studie

Samenvatting

We genetisch coderen natuurlijk aminozuur, p-azido-L-fenylalanine op verschillende gerichte posities in GPCRs en tonen de veelzijdigheid van de azidogroep in verschillende toepassingen. Deze omvatten een gerichte fotoverknoping technologie om resten in de ligand-bindingsplaats van een GPCR te identificeren, en de site-specifieke bioorthogonal modificatie van GPCR's met een peptide-epitoopmerker of fluorescente probe.

Samenvatting

Structurele en dynamische studies van G-eiwit gekoppelde receptor (GPCR) signalering complexen te vergemakkelijken, zijn nieuwe benaderingen nodig zijn om informatieve probes of labels introduceren in uitgedrukt receptoren die geen receptor functie niet verstoren. We gebruikten amber codon suppressie technologie genetisch coderen van het niet-natuurlijke aminozuur, p-azido-L-fenylalanine (azf) bij verschillende gerichte posities in GPCRs heteroloog tot expressie gebracht in zoogdiercellen. De veelzijdigheid van de azidogroep is hier weergegeven in verschillende toepassingen GPCR bestuderen in hun natieve cellulaire omgeving of in detergens gesolubiliseerde omstandigheden. Ten eerste tonen we een cel-gebaseerde gerichte fotoverknoping technologie aan de residuen in de ligand-bindingsplaats van GPCR wanneer een tritium-gelabeld kleine moleculen ligand verknoopt een genetisch gecodeerd aminozuur azido identificeren. We tonen dan plaatsspecifieke modificatie van GPCR's door de bioorthogonal Staudinger-Bertozzi ligatie reactiestie dat de azidogroep richt met behulp van fosfine derivaten. We bespreken een algemene strategie voor gerichte peptide-epitoop tagging van uitgedrukt membraaneiwitten in-cultuur en de detectie met behulp van een whole-cell-gebaseerde ELISA aanpak. Tot slot laten we AZF-GPCR selectief kan worden gelabeld met fluorescente probes. De methoden besproken algemeen, aangezien zij kunnen in beginsel worden toegepast op elk aminozuur positie in een GPCR tot expressie actieve signalering complexen ondervragen.

Inleiding

Heptahelical G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR's) omvatten een superfamilie van zeer dynamische membraaneiwitten die belangrijk en diverse extracellulaire signalen mediëren. In het klassieke paradigma wordt receptoractivering gekoppeld ligand geïnduceerde conformatieveranderingen. ^{1, 2} hebben recente ontwikkelingen in de structurele biologie van GPCRs belangrijke inzicht in de moleculaire mechanismen van transmembraan signalering ontvangen. ^3-5 echter te begrijpen met een grotere nauwkeurigheid de chemische werkingsmechanisme en structurele dynamica van GPCR-signalering, is een toolkit van benaderingen nodig zijn om informatieve molecul....

Protocol

1. Site-specifieke genetische Oprichting van natuurlijke aminozuren in GPCR

1. Handhaaf HEK293T cellen in DMEM (4,5 g / l glucose, 2 mM glutamine), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in een 5% _CO2 atmosfeer.
2. Transfecteren de cellen gekweekt tot 60-80% confluentie in een 10 cm plaat met behulp van Lipofectamine Plus reagens.
   1. Aan 750 ul DMEM, voeg 10 ul Plus reagens, 3,5 ug GPCR cDNA (pMT4. Rho of pcDNA 3.1. CCR5) bevattende amber stopcodon op een gewenste positie, 3,5 ug tRNA cDNA (pSVB.Yam) en 0,35 ug van mutante amino-acyl tRNA synthetase cDNA voor p-azido-L-fenylalanine (pcDNA.RS). Incubeer bij kame....

Resultaten

We gebruikten het onnatuurlijke aminozuur mutagenese methode voor plaatsspecifiek moleculaire probes introduceren in een GPCR volgens de amber codon onderdrukking technologie. De regeling in Figuur 1 schetst de voornaamste stappen van de methodologie en de verschillende toepassingen van het opnemen van de veelzijdige UAA, p-azido-L-fenylalanine (AZF), in GPCR's. Expressie van AZF-GPCR's in zoogdiercellen maakt het mogelijk gerichte fotoverknoping aan liganden, en gerichte peptide-epitoo.......

Discussie

We beschrijven hier een robuuste methode voor plaatsspecifieke integratie van een reactieve probe, AZF, in GPCRs en tonen drie nuttige toepassingen van dit hulpmiddel om de structuur en dynamiek van GPCR bestuderen. Onze methode naar site-specifiek te nemen UAAs omzeilt een fundamenteel probleem met een alternatieve strategie op basis van chemisch labelen ^{32, 33} of vastmaken fotocrosslinkers ³⁴ tot een enkel toegankelijk cysteïne mutant. Hoewel chemische dat cysteïne thiol doelgroepen zijn gebruikt.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Plasmid pSVB. Yam			(Ye et al., 2008)
Plasmid pcDNA.RS voor azF			(Ye et al., 2009)
Plasmids pMT4.Rho en pcDNA 3.1.CCR5			Bevatten optioneel de amber stopcodon (TAG) op een gewenste positie
HEK 293T-cellen			Aderente cellen
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle-medium (DMEM)	Gibco	10566
Fosfaatbufferoplossing	Gibco	14200
Foetaal bovien serum	Gemini Bio-products	100-106
Lipofectamine Plus	Invitrogen	Lipofectamine: 18324-012 Plus: 11514-015
p-azido-L-fenylalanine	Chem-Impex International	6162
			Tabel 1. Specifieke genetische incorporatie van onnatuurlijke aminozuren in GPCR's materialen
Maxima ML-3500S UV-A lamp	Spectronics Corporation		azF wordt geactiveerd door 365-nm licht
Hank's Gebufferde Zout Oplossing (HBSS)	Gibco	14065
HEPES	Irvine Scientific	9319
Bovien serumalbumine	Roche	3117405001
Tritium-gelabelde ligand			Van medewerker (Grunbeck et al., 2012)
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb geïmmobiliseerd op CNBr-geactiveerde sepharose 2B resin
1% (w/v) natriumdodecylsulfaat (SDS)	Fisher Scientific	BP166
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE uitgevoerd op NuPAGE apparaat
Trans-Blot SD apparaat	Biorad		Apparaat voor semi-droge overdracht
Immobilon polyvinylideen difluoride (PVDF) membraan	Millipore	IPVH00010
Vetvrij melkpoeder	Fisher Scientific	NC9934262
Tween-20	Aldrich	274348
Ecoscint A	National Diagnostics	LS-273	Scintillatievloeistof
Scintillatiebuisjes	Fisher Scientific	333726
LKB Wallac 1209 Rackbeta Liquid Scintillatieteller	Perkin Elmer		Beta-Scintillatieteller
Anti-rhodopsine 1D4 mAb	National Cell Culture Center	op maat
Horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd anti-muis IgG	KPL, Inc.	474-1806
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substraat	Thermo Scientific	34080
Hyblot CL AR film	Denville	E3018
			Tabel 2. Materiaal voor gerichte fotocrosslinking
0.25% Trypsine	Invitrogen	15050065
FLAG-triarylfosfine	Sigma	GPHOS1
M2 FLAG mAb	Sigma	F1804
anti-CCR5 2D7 mAb	BD Biosciences	555990
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
96-well plate	Costar	3601	Duidelijk bodem, hoge binding EIA/RIA
Fosfaatbufferoplossing (Calcium, Magnesium)	Gibco	14040
16% Paraformaldehyd	EMS	28908
HRP-geconjugeerd	KPL, Inc.	474-1516
anti-konijn IgG	KPL, Inc.	474-1516
Amplex Red	Invitrogen	A12222
Waterstofperoxide	DE Healthcare Products	97-93399
CytoFluor II fluorescentie multi-well plate reader	Perseptive Biosystems
			Tabel 3. Materiaal voor gerichte peptide-epitope tagging en ELISA op celoppervlak
Fluoresceïne-fosfine			(Huber et al., ingediend 2012)
Nonapeptide (C9 peptide)	AnaSpec	62190	Peptid dat de 1D4-epitoop nabootst NH2-TETSQVAPA-COOH
1% (w/v) n-dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310LA
1D4-sepharose resin			1D4 mAb geïmmobiliseerd op CNBr-geactiveerde sepharose 2B resin
NuPAGE Novex 4 - 12% SDS gels	Invitrogen	NP0322BOX	SDS-PAGE uitgevoerd op NuPAGE apparaat
Confocal Typhoon 9400 fluorescentiescanner	GE Healthcare	discontinue	Scanner met 488-nm golflengtelaser
			Tabel 4. Materiaal voor fluorescente labeling