Drie-dimensionale confocale analyse van microglia / macrofagen Markers van Polarisatie in Experimentele Hersenletsel

Samenvatting

Een manier om nieuwe inzichten te verkrijgen in de complexiteit van de inflammatoire hersenreactie wordt gepresenteerd. We beschrijven immunofluorescence-gebaseerde protocollen gevolgd door driedimensionale confocale analyse om het patroon van co-expressie van microglia/macrofaagfenotypemarkers in een muismodel van focale ischemie te onderzoeken.

Samenvatting

Na hersenenslag microglia / macrofagen (M / M) ondergaan snelle activering met dramatische morfologische en fenotypische veranderingen die expressie van het nieuwe oppervlakte-antigenen en productie van mediatoren die de opbouw en de ontstekingsreactie te handhaven omvatten. Opkomende bewijs geeft aan dat M / M zijn zeer plastic cellen die klassieke pro-inflammatoire (M1) of een andere anti-inflammatoire (M2) activering na een acuut hersenletsel kan aannemen. Maar een volledige karakterisering van M / M fenotype markerexpressie, hun colocalization en temporele evolutie in de beschadigde brein is nog steeds vermist.

Immunofluorescentie specifiek beoordeelt kleuring relevante markers van M / M activering kan worden uitgevoerd in de ischemische hersenen. Hier presenteren we immunofluorescentie gebaseerde protocollen gevolgd door drie-dimensionale confocale analyse als een krachtige aanpak om het patroon van lokalisatie en co-expressie van M / M fenotype merkers zoals onderzoekenCD11b, CD68, Ym1, in muismodel ischemie geïnduceerd door permanente occlusie van de middelste cerebrale slagader (pMCAO). Tweedimensionale analyse van de vlek zien dat elke merker is gekoppeld aan een bepaalde M / M morfologie en een gegeven locatie in het ischemische letsel. Patronen van M / M fenotype marker co-expressie kan worden beoordeeld door driedimensionale confocale beeldvorming in het ischemische gebied. Afbeeldingen kunnen worden verkregen over een bepaald volume (10 urn z-as en een 0,23 urn stapgrootte, corresponderend met een 180 x 135 x 10 micrometer volume) met een sequentiële scan modus doorbloeding te minimaliseren en golflengte overlapping te vermijden. De beelden worden dan verwerkt tot driedimensionale renderings verkrijgen volgens Imaris software. Solid van drie dimensionale renderings maakt de definitie van markerexpressie in clusters van cellen. We zien dat M / M hebben de mogelijkheid om te differentiëren naar een veelheid van fenotypes, afhankelijk van de locatie van de laesie en time na een blessure.

Inleiding

Na een acuut hersenletsel, worden microglia snel geactiveerd en ondergaan dramatische morfologische en fenotypische veranderingen ^1-3. Deze intrinsieke reactie wordt geassocieerd met de aanwerving van bloed geboren macrofagen, die migreren naar de verwonde hersenen parenchym ^4,5. De rol van microglia en macrofagen die antigeen zijn niet te onderscheiden (hierna te noemen M / M) in hersenletsel is nog steeds gedebatteerd. Een toenemend aantal studies blijkt dat, overeenkomstig hetgeen beschreven perifere macrofagen en microglia hersenen geworven macrofagen kunnen verschillende fenotypes die extremen overeen met klassieke pro-inflammatoire toxisch (M1) of anti-inflammatoire beschermende (M2) fenotype aannemen. De verschillende activatie staten, waaronder uitscheiding van pro-of anti-inflammatoire factoren, neurotrofe afgifte van moleculen en lysosomale activiteit worden gekenmerkt door een specifiek patroon van fenotypische merkers, waarvan de expressie afhankelijk is van de temporeleontwikkeling van de omgeving. De karakterisatie van deze M / M fenotypes in de verwonde hersenen is nog steeds schaars. We gebruikten een gevestigde muizenmodel van pMCAo naar M / M expressie en evolutie na een beroerte te analyseren. Immunofluorescentie gebaseerde protocollen hier gepresenteerd gericht op het verkrijgen van inzicht in het optreden van de specifieke M / M fenotype markers, hun lokalisatie en cellulaire co-expressie in het ischemische gebied. We onderzochten een paar moleculen gekoppeld aan verschillende activering staat of fenotype, namelijk CD11b, een oppervlakte marker door leukocyten en een veel gebruikte marker van M / M activering / recruitment ^6-8 uitgedrukt, CD68 een marker van lysosomen ^6,7 en Ym1 een secretoire eiwit door alternatief geactiveerde (M2) macrofagen tot expressie gebracht en gekoppeld aan herstel en functieherstel ^9-10.

Wanneer twee markers worden uitgedrukt door dezelfde cel, maar in verschillende subcellulaire compartimenten kan colocalization alleen veel inf nietormative. In dit geval kan de analyse van co-expressie worden uitgevoerd door een enkele bovenaanzicht en driedimensionale weergaven. We hier een protocol beschrijven aan een grondige driedimensionale analyse van de marker co-expressie te verkrijgen.

Protocol

1. Immunofluorescentie

Het volgende protocol wordt uitgevoerd op vriescoupes coronale hersenen verkregen transcardiale perfusie muizen (20 ml PBS, 0,1 mol / l, pH 7,4, gevolgd door 50 ml koud 4% paraformaldehyde in PBS). Na perfusie worden hersenen zorgvuldig verwijderd en overgebracht naar 30% sucrose in PBS bij 4 ° C overnacht voor cryobescherming. De hersenen worden vervolgens snel bevroren door onderdompeling in isopentaan bij - 45 ° C gedurende 3 min voordat ze verzegeld in flesjes en opgeslagen bij -70 ° C tot gebruik. Coronale hersenen cryosecties (20 micrometer) worden serieel gesneden en onderworpen aan immunofluorescentie protocol ^{11, 6.}

Breng alle reagentia en monsters op kamertemperatuur voor gebruik. Houd er rekening mee dat de gepresenteerde werken verdunningen van antilichamen en het serum het gevolg van proeven gedaan om de beste prestatie te verkrijgen. Wanneer verschillende antilichamen en serum wordt gebruikt, dit protocol moet worden gevalideerd.

Merk op dat omdat zowel anti-CD11b en anti-CD68 primaire antilichamen worden gemaakt in de rat, om cross-signaal te voorkomen door anti-rat Alexa 546, gebruikten we een sterke verdunning van anti-CD11 b gevolgd door fluorescerend signaalversterking met TSA kit (Cy5 tyramide). Wij hebben opgezet optimaal werkverdunning voor anti-CD 11 b na door de protocol behalve stap 1,17 en met ten minste 7 verschillende verdunningen van anti-CD 11 b volgens tabel 1. Hierdoor is 1:30.000 gekozen als enige verdunning bereiken: 1) zichtbaar signaal met Cy5 aan excitatiegolflengte 646 nm, 2) geen signaal met Alexa 546 in excitatiegolflengte 532 nm. Zo wordt Alexa 546 fluorescentiesignaal selectief verbonden CD68 expressie.

De optimale verdunningen voor anti-CD 11 en anti-CD68 antilichamen kunnen variëren afhankelijk van het soort weefsel en moeten vóór de co-labeling protocol beginnen gedefinieerd.

1. Was hersenen vriescoupes tweemaal met PBS.
2. Incubate cryosecties gedurende 5 min in PBS met 1% H ₂ O ₂ (stap nodig omdat de fluorescerende versterking nodig heeft incubatie met mierikswortelperoxidase, streptavidine-HRP, zie stap 1.12).
3. Was vriescoupes 2x met PBS.
4. Incubeer cryosecties gedurende 60 min in PBS bevattende 10% NGS en 0,3% Triton.
5. Incubeer vriescoupes bij 4 ° C geïncubeerd in PBS die primaire Ab Rat anti-CD 11 b [1:30.000], 10% NGS en 0,3% Triton.
6. Wash vriescoupes 2x (5 min) met PBS.
7. Incubeer cryosecties gedurende 60 min in PBS met gebiotinyleerde secundaire anti-rat Ab [1:200] en 1% NGS.
8. Was vriescoupes 2x met PBS.
9. Was cryosecties met TNT (Tris-HCl, NaCl, Tween: 0.1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20).
10. Incubeer cryosecties gedurende 1,5 uur in TNB (Tris-HCl-NaCl-Blocking buffer: 0,1 M TRIS-HCl, pH 7,4, 0,15 M NaCl, 0,5% blokkeren van geschikte reagens kit (zie tabel reagentia)).
11. Wassen cryosecties 3x keer met TNT.
12. Incubeer cryosecties in TNB met streptavidine-HRP [1:100].
13. Wassen cryosecties 3x met TNT.
14. Incubeer cryosecties gedurende 8 min in Amplification Diluent met Cyanine 5 tyramide [1:300].
15. Wassen cryosecties 3x met PBS.
16. Incubeer cryosecties gedurende 60 min in PBS bevattende 10% NGS en 0,1% Triton.
17. Incubeer vriescoupes bij 4 ° C geïncubeerd in PBS die primaire Ab Rat anti-CD68 [1:200], 3% NGS en 0,3% Triton.
18. Wassen cryosecties 3x met PBS.
19. Incubeer cryosecties gedurende 60 min in PBS met fluorconjugated secundaire Ab Alexa 546 anti-rat [1:500] en 1% NGS.
20. Wassen cryosecties 3x met PBS.
21. Incubeer cryosecties gedurende 10 min in PBS bevattende Hoechst 1 ug / ml.
22. Wassen cryosecties 3x met PBS.
23. Monteer cryosecties in Prolong Gold.

2. Overname van driedimensionale beelden door confocale microscopie

De microscoop hier gebruikte was een IX81 microscoop uitgerust met een confocale scan unit FV500 met 3 laserlijnen: Ar-Kr (488nm), He-Ne rood (646nm), en He-Ne groen (532nm) en UV diode.

1. Selecteer de excitatie lasers afhankelijk van de golflengte van de fluorescente kleurstoffen te worden opgewekt (He-Ne rood voor Cy5, CD 11 b, He-Ne groen voor Alexa546, CD68 en UV diode Hoechst, kernen).
2. Selecteer de beste dichroïsche spiegel combinatie voor lichte collectie signaal.
3. Opgezet beeldresolutie met een minimum van 800 x 600 pixels.
4. Identificeer een gebied van belang met behulp van epi-fluorescentie en geleidelijk verhogen van de vergroting van de 40X doelstelling.
5. Schakel over naar laser scanning microscopie (LSM) modaliteit.
6. Run herhaalde scans om de photomultiplier (PMT) en de versterking voor elk kanaal. Lasers kunnen afzonderlijk worden ingeschakeld om de set-up te vergemakkelijken. Houd versterking zo laag mogelijk ongewenste niet-specifieke signalen te voorkomen.
7. Met Repeonderhevige scan uitgevoerd, verplaats de focusbesturing lagere en hogere uitersten van de z-as (totale lengte z-as = 10 pm) te definiëren.
8. Stop repetitieve scan.
9. Definieer stapgrootte. Het moet zo dicht mogelijk bij pixelgrootte (0.225 urn) een standaard formaat 01:01 verhouding te verkrijgen over de z-as zijn.
10. Activeer Kalman filter minstens 2 keer.
11. Activeer sequentiële scan mode te bloeden-through effecten te vermijden.
12. Ga halverwege langs de z-as en uitvoeren van een xy sequentiële scan. Controleer de set-up van PMT en versterking (goede signaal / ruisverhouding). Zo niet bevredigend is, herhaal dan stap 2.6.
13. Run xyz overname.
14. Gegevens als multitiff bestand exporteren. Elke multitiff bestand bevat meestal 3 kleurkanalen (blauw, groen en rood) en 44 focale vliegtuigen.

3. Drie-dimensionaal beeld van confocale Acquisities en Driedimensionale Rendering

Upload multitiff bestanden naar Imaris software en verwerken ze als volgt:

1. Open software.
2. Selecteer het overtreffen uitzicht.
3. Upload het multitiff bestand.
4. Selecteer de gewenste kleur voor elk kanaal.
5. Verwijder ruis uit de achtergrond door het verhogen van de minimale waarde op het scherm aanpassen. Stel elk kanaal afzonderlijk.
6. Ga naar de doorsnede. Bewegen langs de z-as zoekt co-lokalisatie (geel pixels).
7. Klik op een geel gebied te zien of de colocalization onderhavige langs de z-as (dus behoort tot een voorwerp) is. Z-as projecties zijn zichtbaar in de rechter-en onderkant van de figuur.
8. Neem een ​​momentopname.
9. Ga terug naar de weergave overtreffen.
10. Gewas 3D een cel of een cluster van cellen te isoleren.
11. Selecteer een kanaal op het scherm aanpassen.
12. Selecteer het overtreffen / oppervlakken algoritme bouwer. Algoritme stappen:
    1. Selecteer kanaal.
    2. Definieer drempel (gebruik van dezelfde minimale waarde in thij aanpassing paneel weer te geven).
    3. Definieer resizen.
    4. Definieer smoothing (best = 0,200).
    5. Definieer kleurweergave.
    6. Eindigen algoritme.
13. Herhaal stap 3.12 voor elk kanaal.
14. Deselecteer fluorescentie kanalen op het scherm aanpassen en selecteer alle drie vlakken.
15. Beweeg de volumeregelaar om het beste uitzicht te vinden.
16. Neem een ​​momentopname.

Resultaten

Een voorbeeld van de resultaten verkregen bij het labelen van protocollen en confocale acquisities die worden uitgevoerd in het ischemische gebied, wordt geïllustreerd in Figuur 1A en 1B. Een tweedimensionale weergave van verworven beelden toont dat op vierentwintig uur na ischemie (A), de lysosomale marker CD68 (groen) wordt tot expressie gebracht in hypertrofische amoboïd CD11b cellen (rood) aanwezig in het ischemische kerngebied. In de grenszone (B) v...

Discussie

We presenteren hier immunofluorescence-gebaseerde protocollen gevolgd door driedimensionale confocale analyse als een krachtige benadering om lokalisatie en co-expressie van M/M fenomenmarkers in het ischemische gebied te onderzoeken (zie ref ⁶ voor een meer gedetailleerde analyse). Deze methode combineert specifieke kleuring van relevante marker van M/M activering met driedimensionale confocale beeldvorming. De fijne afstemming van antilichamen, serum en geconjugeerde werkverdunningen fluor laat een optimaa...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Materialen
Rat Anti-muis CD11b	Vriendelijk verstrekt door Dr. A. Doni, Istituto Clinico Humanitas, Milaan, Italië
Rat Anti-muis CD68	AbD Serotec	MCA 1957
Konijn Anti-muis Ym1	Stem Cell Technologies	1404
H–chst 33342	Life Technologies	H21492
Muis Anti-Neural Nuclei (NeuN)	CHEMICON	MAB377
Biotinyleren Geit Anti-Rat antilichaam	Jackson Immuno Research	112-065-143
TSA Cyanine 5 Systeem	Perkin Elmer	NEL705A001KT
Prolong Gold	Invitrogen	P36930
Anti-rat alexa 546	Invitrogen	A-11081
Anti muis Alexa 488	Invitrogen	A-21121
Anti-konijn Alexa 594	Invitrogen	A-11037
Normaal Geit Serum	Vectors Laboratories	S-1000
Triton X-100	Sigma	T8787
Fosfaat Buffered Saline	Sigma	P4417-100
Apparatuur
Cryostat CM1850	Leica
Olympus IX81 confocal microscoop	Olympus
AnalySIS software	Olympus
Imaris software 5.0	Bitplane
Photoshop cs2	Adobe Systems
Softwarepakketten GraphPad Prism versie 4.0	GraphPad Software Inc.