Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Summary

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Abstract

Wij presenteren een microfluïdische apparaat dat de kwantitatieve bepaling van intracellulaire biomoleculen in meerdere afzonderlijke cellen parallel maakt. Hiertoe worden de cellen passief gevangen in het midden van een microkamer. Na activering van de besturingslaag wordt de cel geïsoleerd van de omringende volume in een kleine kamer. De omliggende volume kan dan worden uitgewisseld zonder dat de geïsoleerde cel. Echter, bij korte openen en sluiten van de kamer, de oplossing in de kamer kan worden vervangen binnen een paar honderd milliseconden. Door de omkeerbaarheid van de kamers kunnen de cellen worden blootgesteld aan verschillende oplossingen achtereenvolgens een zeer controleerbare wijze, bijv. voor incubatie, wassen en tenslotte cellysis. De goed afgesloten microchambers staat het behoud van het lysaat, minimaliseren en de controle van de verdunning na cellysis. Aangezien lysis en analyse plaatsvinden op dezelfde locatie, is hoge gevoeligheid behouden omdat geen verdere dilution of verlies van de analyten optreedt tijdens het transport. De microkamer ontwerp maakt daarom de betrouwbare en reproduceerbare analyse van zeer kleine kopie-aantallen van intracellulaire moleculen (attomol, zeptomol) vrijgelaten uit individuele cellen. Bovendien kunnen vele microchambers worden opgesteld in een matrix format, waarbij de analyse van vele cellen tegelijk, aangezien geschikte optische instrumenten worden gebruikt voor bewaking. We hebben al gebruik van het platform voor proof-of-concept studies naar intracellulaire eiwitten, enzymen, co-factoren en second messengers in zowel relatieve of absolute meetbare wijze te analyseren.

Introduction

Vele studies in het verleden cel tot cel verschillen binnen een grote celpopulatie ^1-3, in het bijzonder signalering verwerkt ⁴ of de hoeveelheden intracellulaire biomoleculen zoals eiwitten ^5,6, metabolieten en cofactoren ^7,8 geopenbaard. Deze heterogeniteit wordt geacht fundamenteel belang voor de aanpassing en evolutie ⁹ cellen toe, maar spelen ook een belangrijke rol bij het ​​ontstaan ​​en behandeling van ziekten zoals kanker ^10-13. Daarom studies over de eencellige niveau van groot belang in biologisch en farmacologisch onderzoek, vooral als deze studies tonen de verschillende celreacties na beha....

Protocol

1. SU-8 master Fabrication

Bereid zowel de master vormen voor de kanalen (vloeibare en controle voor schema en afmetingen zie figuur 2) met het volgende protocol maar met verschillende maskerpatronen. Het proces is weergegeven in figuur 3a.

1. Begin met het verwarmen van een 4 inch siliciumwafel gedurende 10 minuten bij 180 ° C. Laad de gedehydrateerde wafer op een spin-coater en gebruik de volgende protocol voor spin-coating SU-8 2015:
   1. Spin wafer bij 100 rpm gedurende 20 sec (open deksel van spin-coater, afzien SU-8 tijdens deze stap, sluit het deksel na het afgeven).
   2. Spin wafer b....

Results

Het platform kan een aantal intracellulaire en afgescheiden moleculen in of geproduceerd door enkele cellen te analyseren. Hier willen we ander voorbeeld studies aan de verscheidenheid van mogelijke tests onderstrepen. We zullen een voorbeeld voor een uitgescheiden enzym (figuur 5a) en een intracellulair enzym (figuur 5b) en eiwit (Figuren 5c en d). Voor meer voorbeelden, zoals co-factoren of kleine moleculen, verwijzen wij u naar Eyer et al.. .......

Discussion

Microfluidics technologie heeft nieuwe en fascinerende mogelijkheden voor single-cell analyse. In het bijzonder, heeft de mogelijkheid te vangen en te immobiliseren cellen individueel microfluïdische gereedschappen toegestaan ​​systematische korte en lange-termijn studies over eencellige eigenschappen en de respons. Bovendien inkapselen van cellen in hoogfrequente microdruppeltjes, gegenereerd op een microchip heeft enkele cel secretie studies, die niet kan worden uitgevoerd met gebruikelijke cytometrie inrichtingen ing.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
REAGENTS:
Name of the Reagent	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Netwon, MA)	n.a.
1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silane	ABCR (Karlsruhe, Germany)	AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydrate	Sigma Aldrich	M9763
Acetone	Merck VWR (Darmstadt, Germany)	100014
Avidin	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)	n.a.
AZ 726 developer	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Germany)	n.a.
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A-4503
Bovine serum albumin, biotin	Sigma Aldrich	A-8549
Cell dissociation buffer	Invitrogen	13151-014
Hexamethyldisilazane (HDMS)	Sigma Aldrich	40215
Hydrochloric acid	Fluka	84422
Isopropanol	Merck VWR (Darmstadt, Germany)	109634
Magnesium chloride hexahydrate	Fluka	63068
MR developer 600	Microresist technology GmbH (Berlin, Germany)	n.a.
PBS	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG grafted	SuSoS, (Dübendorf, Switzerland)	n.a.
PLL-g-PEG grafted biotin	SuSoS, (Dübendorf, Switzerland)	n.a.
Potassium chloride	Fluka	60132
Protein G, biotin	Sigma Fine Chemicals	41624
Silicon wafer	Si-Mat (Kaufering, Germany)	n.a.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow Corning	39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	Biorad	1610716
Tween 20	Biorad	1706531
EQUIPMENT:
Material Name	Company	Catalogue Number	Comments (optional)
0.22 µm PES syringe filter	TRP	99722
1/1.5 mm biopsy puncher	Miltex, York PA	33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µm	Partec	04-004-2325
Centrifuge Sigma 3-18K	Kuehner	n.a.
Hotplate HP 160 III BM	Sawatec, Sax, Switzerland	n.a.
MA-6 mask aligner	Karl Suess	n.a.
Multizoom AZ100M microscope	Nikon Corporation	n.a.
Photomask	Microlitho, Essex, U.K.	n.a
Plasma Cleaner PDC-32G	Harrick	n.a.
Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell	n.a.
Spin Modules SM 180 BM	Sawatec, Sax, Switzerland	n.a.
Step profiler Dektak XT Advanced	Bruker	n.a.
Syringe pump neMESYS	Cetoni	n.a.