Een Microfluïdische Chip voor de Versatile chemische analyse van enkele cellen

Samenvatting

In dit artikel presenteren we een microfluïdische chip voor single cell analyse. Het maakt de kwantificering van intracellulaire eiwitten, enzymen, cofactoren, en tweede boodschappers via fluorescentie assays of immunoassays.

Samenvatting

Wij presenteren een microfluïdische apparaat dat de kwantitatieve bepaling van intracellulaire biomoleculen in meerdere afzonderlijke cellen parallel maakt. Hiertoe worden de cellen passief gevangen in het midden van een microkamer. Na activering van de besturingslaag wordt de cel geïsoleerd van de omringende volume in een kleine kamer. De omliggende volume kan dan worden uitgewisseld zonder dat de geïsoleerde cel. Echter, bij korte openen en sluiten van de kamer, de oplossing in de kamer kan worden vervangen binnen een paar honderd milliseconden. Door de omkeerbaarheid van de kamers kunnen de cellen worden blootgesteld aan verschillende oplossingen achtereenvolgens een zeer controleerbare wijze, bijv. voor incubatie, wassen en tenslotte cellysis. De goed afgesloten microchambers staat het behoud van het lysaat, minimaliseren en de controle van de verdunning na cellysis. Aangezien lysis en analyse plaatsvinden op dezelfde locatie, is hoge gevoeligheid behouden omdat geen verdere dilution of verlies van de analyten optreedt tijdens het transport. De microkamer ontwerp maakt daarom de betrouwbare en reproduceerbare analyse van zeer kleine kopie-aantallen van intracellulaire moleculen (attomol, zeptomol) vrijgelaten uit individuele cellen. Bovendien kunnen vele microchambers worden opgesteld in een matrix format, waarbij de analyse van vele cellen tegelijk, aangezien geschikte optische instrumenten worden gebruikt voor bewaking. We hebben al gebruik van het platform voor proof-of-concept studies naar intracellulaire eiwitten, enzymen, co-factoren en second messengers in zowel relatieve of absolute meetbare wijze te analyseren.

Inleiding

Vele studies in het verleden cel tot cel verschillen binnen een grote celpopulatie ^1-3, in het bijzonder signalering verwerkt ⁴ of de hoeveelheden intracellulaire biomoleculen zoals eiwitten ^5,6, metabolieten en cofactoren ^7,8 geopenbaard. Deze heterogeniteit wordt geacht fundamenteel belang voor de aanpassing en evolutie ⁹ cellen toe, maar spelen ook een belangrijke rol bij het ​​ontstaan ​​en behandeling van ziekten zoals kanker ^10-13. Daarom studies over de eencellige niveau van groot belang in biologisch en farmacologisch onderzoek, vooral als deze studies tonen de verschillende celreacties na behandeling met bioactieve chemicaliën.

De laatste jaren zijn veel analytische platforms ontwikkeld die de analyse van afzonderlijke levende cellen of de chemische samenstelling van de celinhoud vergemakkelijken. Terwijl fluorescent geactiveerde cel sortering (FACS) is de gouden stAndard voor hoge-doorvoer analyse van afzonderlijke levende cellen, de methode niet worden toegepast voor de kwantificering van intracellulaire of uitgescheiden verbindingen. De opkomst van microfluïdische platforms heeft nieuwe analytische strategieën voor de positionering, de behandeling en observatie van enkele cellen beloofd. Een mijlpaal in microfluidics werd bereikt met de integratie van flexibele PDMS kleppen gerealiseerd door Quake en collega's ^14,15. Deze kleppen zijn nuttig omdat ze regio's kunnen isoleren op chip, bijv. scheiden twee culturen ^16. Bovendien zijn ze bijzonder toepasbaar voor single cell analyse en daarom bijdragen aan analyt verdunning te verminderen. De kracht van deze aanpak voor single-cell analyse is onlangs aangetoond door Hansen en collega's, die de genexpressie geanalyseerd uit honderden individuele cellen in parallel ^17.

Bij targeting eiwitten en metabolieten, de analyse moeilijk door het ontbreken van een geschiktemplification methoden, het grote aantal verschillende verbindingen aanwezig zijn, en de verschillen in chemische aard. Bovendien zijn de meeste intracellulaire biomoleculen verwacht aanwezig in lage kopie-aantallen in de orde van enkele tienduizenden ¹⁸ te zijn, vandaar de gebruikte analysemethode moet een hoge gevoeligheid hebben. Krachtiger testen zoals immunoassays en enzym-linked immunoassays (ELISA) zijn moeilijk te integreren in microfluïdische apparaten omdat ze vereisen een aantal wassen en incubatie stappen evenals oppervlak immobilisatie.

Als gevolg van deze uitdagingen, is het niet verwonderlijk dat slechts een paar voorbeelden zijn gemeld waar eiwitten of metabolieten werden gekwantificeerd op de single-cell niveau. Zo hebben studies naar de uitscheiding van fluorescerende verbindingen gemeld ^19,20. Onlangs heeft de uitvoering met ELISA werd voor de analyse van uitgescheiden (niet-fluorescerende) eiwitten van een celkweek (THP-1-cellen) ²¹ en single (immune) cellen ^10. Targeting intracellulaire eiwitten, Shi et al.. Ontwikkelde een microfluïdische apparaat dat de identificatie van intracellulaire eiwitten voor de analyse van signaal transductie in tumorcellen door middel van een immunoassay ¹¹ vergemakkelijkt. Slechts relatieve hoeveelheden eiwitten werden bepaald en geen enzymatische amplificatie werd gebruikt om het signaal voor lage abundantie proteïnen verhogen.

Onlangs waren we in staat om een single-cell trapping microdevice met fluorescentie-assays ⁸ en immunoassays ²² (figuur 1) te combineren. Cellen worden passief gevangen in microsized hindernis structuren, die het aanbod en (snelle) uitwisseling van middelgrote en andere chemische middelen zonder enige beweging van de cellen mogelijk te maken. Een ringvormige klep rond elke val maakt isolatie van de cel in een zeer klein volume ("de microkamer"). Deze klep wordt geactiveerd direct na de invoering van een cel-lyseren (hypoosmolar) buffer, hijNVU voorkomen intracellulaire moleculen of uitgescheiden moleculen weg te diffunderen. Het belangrijkste is, vanwege de kleine grootte van het volume (625 pl) grote verdunning van de moleculen wordt vermeden. Aangezien lysis en analyse uitgevoerd op dezelfde positie in de chip, is er geen verlies van analyten door transport. Het ontwerp van de chip hier beschreven bestaat uit 8 afwisselend rijen van 7 of 8 microchambers, in totaal 60 microchambers. De kamers worden bediend in rijen, zodat kruisbesmetting langs een lijn is uitgesloten.

Het platform kan gebruikt worden in combinatie met fluorescentie assays en immunologische assays (figuur 1d). Voor deze laatste, hebben we protocollen voor immobilisatie van de antilichamen, die met de chip productie en assemblage proces. Vandaar het platform opent de weg voor de gevoelige, betrouwbare en kwantificeerbare assays op de enkele cel niveau. Tot nu toe hebben we de inrichting voor de analyse van intracellular en uitgescheiden enzymen (relatieve kwantificatie door enzymatische assays), intracellulaire cofactoren, eiwitten en kleine moleculen (absolute kwantificatie door eindpunt assays of ELISA). Hieronder beschrijven we de werkwijze chip fabricage door middel van zachte meerlaagslithografie en protocollen voor patroonvorming van de antilichamen via microcontact printen en oppervlaktechemie. Daarnaast is een aantal voorbeelden van de chip gebruik en behandelingen worden gegeven.

Protocol

1. SU-8 master Fabrication

Bereid zowel de master vormen voor de kanalen (vloeibare en controle voor schema en afmetingen zie figuur 2) met het volgende protocol maar met verschillende maskerpatronen. Het proces is weergegeven in figuur 3a.

1. Begin met het verwarmen van een 4 inch siliciumwafel gedurende 10 minuten bij 180 ° C. Laad de gedehydrateerde wafer op een spin-coater en gebruik de volgende protocol voor spin-coating SU-8 2015:
   1. Spin wafer bij 100 rpm gedurende 20 sec (open deksel van spin-coater, afzien SU-8 tijdens deze stap, sluit het deksel na het afgeven).
   2. Spin wafer bij 500 rpm gedurende 10 seconden (dit zal verspreiden de resist over de gehele wafer).
   3. Spin wafer bij 1.750 rpm gedurende 30 seconden (definieert de hoogte van de resist tot 20 urn).
2. Verwijder weerstand van de rand van de wafel met aceton (gebruik een staafje), aangezien dit anders blijft plakken aan de warmhoudplaat in de volgende stap. Breng de wafer te ahotplate bij 95 ° C en verwarm gedurende 4 minuten. Na de softbake, bloot het weerstaan ​​door een photomask geplakt is aan glas in een masker aligner Sodalime met UV-licht (150 mJ / cm ^2, gemeten bij 365 nm).
3. Na de belichting Verhit de wafer opnieuw bij 95 ° C gedurende 5 minuten op een kookplaat. Afkoelen van de wafer tot kamertemperatuur en vervolgens ondergedompeld in een bad van SU-8 ontwikkelaar voor 4 min. Schud zachtjes om onbelicht SU-8 te verwijderen. Was de wafer met cleanroom kwaliteit isopropanol en droog blazen met stikstof. Controleer onder een microscoop als de succesvolle ontwikkeling (vooral de cel vallen) was. Als de cel vallen volledig ontwikkeld, moet de reflectie van de siliciumwafel zichtbaar. Eventueel de ontwikkeling van de wafer weer enkele minuten.
4. Bak de wafer in een oven gedurende 2 uur bij 180 ° C om alle achtergebleven oplosmiddel te verwijderen. Controleer de hoogte van de kanalen met een stap profiler. Als de hoogte afwijkt van de gewenste hoogte, herhaal dit protocol te beginnen bij stap 1.1 een nieuwe wafer ende spin-snelheid (stap 1.1.3) veranderen. Afronding van de fabricage van de meester mal door silaniseren de wafer met 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silaan in een exsiccator overnachten.

2. Master Fabrication voor Microcontact Printing

1. Om meester mallen bereiden microcontact drukken, gedehydreerd een silicium wafer gedurende 10 minuten bij 180 ° C. Spin-coat 1 ml HDMS op dit wafer bij 7.500 tpm gedurende 30 seconden (de resist hecht beter om een ​​gesilaniseerd oppervlak). Spin-coat 2 ml AZ1518 positieve weerstaan ​​met dit protocol:
   1. Statische afgifte van de resist op de wafer.
   2. Spin wafer gedurende 5 seconden bij 500 tpm.
   3. Spin wafer gedurende 60 seconden bij 4000 tpm.
2. Na 50 seconden softbake bij 100 ° C op een kookplaat, bloot de resist aan UV-licht (21 mJ / cm ² bij 365 nm) door een fotomasker en een masker aligner. Ontwikkel de resist in een bad van AZ 726 voor 75 sec. Spoel de ontwikkelde wafer met DI-water en blaas dry met stikstof. Resten oplosmiddel door verhitting van de wafer bij 115 ° C gedurende 50 sec. Silaniseren de wafer onder vacuüm gedurende de nacht.

3. Fabricage van de Microfluidic Chip

Een tweelaags apparaat ontwerp wordt gebruikt voor deze experimenten. De twee lagen worden afzonderlijk bereid en aan elkaar gehecht voordat de chip eindelijk gebonden op een glasplaatje (figuur 3b). Deze stap beschrijft de productie van de PDMS lagen en PDMS stempel voor microcontact afdrukken.

1. Bereid een 10:01 mengsel van PDMS en verharder. Bereid ongeveer 80 g PDMS in totaal (met behulp van onze ontwerpen, zal dit resulteren in 10 chips). Meng beide delen krachtig en ontgassen het PDMS tot het mengsel is luchtbel vrij (~ 30 min).
2. Plaats de wafer met de besturingslaag in een petrischaaltje tape op de bodem. Vervolgens giet ~ 50 g PDMS boven en zet de wafer gedurende minstens 2 uur in een oven bij 80 ° C volledig te verzekerenuitharden van de PDMS. Herhaal dezelfde procedure voor de microcontact afdrukken wafer, voor dit ~ 20 g PDMS nodig is.
3. Spin-coat PDMS op de wafer met de vloeibare laag bij een rotatiesnelheid van 2000 rpm tot een ongeveer 40 urn hoog PDMS laag. Hard de PDMS in een oven gedurende ten minste 1 uur bij 80 ° C.
4. Wanneer beide delen uitgehard, verwijder de laag van de wafel en in stukken gesneden met een scheermesje. Punch druk aansluiting gaten met behulp van een 1 mm biopsie puncher. Voor opslag, is het raadzaam om een ​​stuk tape over de kanalen zetten.
5. De twee lagen te binden, nemen de spin beklede wafer en het bovenste gedeelte en plaats ze in een plasma reiniger ^23. Na plasma behandeling, snel uitlijnen beide onderdelen onder een microscoop met grote werkafstand. Voeg wat extra PDMS rond de geplaatste bovenste delen. Deze stap is niet verplicht, maar het de verwijdering van de PDMS van de wafel vergemakkelijkt. Plaats de wafer in een oven bij 80 ° C gedurende ten minste 1 uur.
6. Gebruik een scalpel aan de PDMS voorzichtig uit de wafer en de microchips te snijden. Punch toegang gaten voor de vloeibare verbindingen met een 1,5 mm biopsie puncher.
7. De PDMS chip is nu klaar en kan worden opgeslagen voor maanden. Optioneel: Als de chip wordt gebruikt met een reservoir, snijd het bovenste deel van een 200 ul pipet tip en gebruik wat extra, semi-uitgeharde PDMS te lijmen op de top. Plaats de chip in de oven opnieuw bij 80 ° C gedurende tenminste 1 uur.

4. Bonding naar Glass Slide

Om het apparaat te gebruiken voor directe enzymatische assays, de enige stap vereist na hechting is het blokkeren van oppervlakken. Voor dit protocol, ga dan naar A. Echter, om de microfluïdische chip voor immunoassays of ELISA's gebruiken, verwijzen wij u naar het protocol B om de bindingsplaatsen alleen om het glaasje (dwz voor TIRF microscopie of SPR) te beperken. Als deze beperking is niet van belang, zie A, maar gebruik gebiotinyleerde conjugaten in stap 4.3 en ga verder met stap 4.8in protocol B om een ​​volledig functionele oppervlak te creëren.

Voorafgaand aan het uitvoeren van protocol A en B: Het is raadzaam om alle gebruikte eiwitoplossingen voor het inzetten in de chip filteren. Vuil en eiwitcomplexen kunnen anders cel vallen blokkeren, waardoor het aantal kamers die kunnen worden gebruikt voor analyse verminderen. Hiervoor gebruikt u een nonprotein adsorberende filterinstallatie om alle oplossingen te filteren voordat de introductie ervan in de kanalen.

Protocol A (enzymatische assays)

1. Om de microfluïdische apparaat af te ronden, bond de PDMS onderdelen op een glasplaatje. Om dit te doen, eerst te reinigen een glasplaatje met zeep, gedestilleerd water en ethanol. Droog de dia met behulp van een stikstofstroom. Reinig het PDMS deel met plakband.
2. Doe de PDMS deel en de gereinigde glazen dia in het plasma reiniger voor 45 sec bij 18 W. Om een ​​strakke binding te verzekeren, zet de chip op een hete plaat (100 ° C) gedurende 5 minuten.
3. Na het plakken, vul de chip met fLUID. Een gemakkelijke manier om dit te bereiken is de centrifugale kracht te gebruiken. Snijd het onderste deel van 200 ul pipet tip. Voor de vloeibare kanalen vullen met de blockingbuffer (runderserumalbumine (4% w / v) of poly-L-lysine) geënt polyethyleenglycol (0,05% w / v) en plaats de uiteinden in de inlaten. Vul het besturingslaag inlaten met water of met een oplossing isosmotisch, bijv. PBS. Plaats de chip in de centrifuge (800 xg) gedurende 5 minuten. De kanalen moeten nu worden gevuld met vloeistof volledig. Zo niet, herhaal deze stap.
4. Incubeer de blokkerende oplossing gedurende ten minste 30 minuten bij kamertemperatuur geroerd. Was de oplossing van de vloeistoflaag met PBS bij een stroomsnelheid van 10 pl / min met een injectiepomp. Het apparaat is nu klaar voor celexperimenten.

Protocol B (immunoassays)

Voor een compleet overzicht van de oppervlakte modificatie van stap 4.7 verder wordt verwezen naar Tabel 1.

5. Incubate PDMS postzegels voor microcontact afdrukken met een BBSA / BSA-oplossing (bijvoorbeeld 1-100). Na 30 min Reinig de stempels grondig met gedestilleerd water en droog het stempel onder een stikstofstroom. Plaats snel de stempels op een gereinigde glasplaatje (figuur 4).
6. Expose het glasplaatje met de stempel samen met het bovenste deel van de microfluïdische chip zuurstofplasma gedurende 45 seconden bij maximum vermogen (18 W) in een plasma schoner. Na plasma behandeling, verwijder de stempel en lijn de bedrukte oppervlak onder de microchambers van het apparaat. Plaats de chip gedurende 30 minuten op een hete plaat bij 50 ° C.
7. Om de resterende oppervlakte blokkeren, introduceren steriel gefiltreerde BSA-oplossing (4% (w / v) in PBS) in de chip met een centrifuge (zie stap 4.2). Incubeer gedurende 1 uur en was de oplossing uit de vloeistoflaag met PBS (zie stap 4.3). De chip kan dan rechtstreeks worden toegepast of opgeslagen tot 2 weken bij 4 ° C in een vochtige doos.
8. Voor een volledig functionele binding oppere introduceren avidine (0.025% (w / v) in PBS) in het reservoir. Gebruik een stroomsnelheid van 5 pl / min gedurende 30 min naar het avidine oplossing trekken via de fluïdumkanalen. Daarna spoelen PBS gedurende 10 minuten. Spoel het reservoir grondig.
9. Daarna voeg Proteïne G (0.0025% (w / v) in PBS) en spoel nog eens 30 minuten. Wassen met PBS gedurende nog 10 minuten daarna. Voeg vervolgens het interessante antilichaam (0,0001% (g / v) in PBS) gedurende 10 minuten. Na 10 min, stop de stroom gedurende 15 minuten om binding mogelijk. Vervolgens wassen met PBS gedurende 10 minuten.

5. Celexperimenten

Het protocol is in het algemeen vanwege de verscheidenheid van mogelijke assays. Als voorbeeld wordt de reagentia nodig voor het G6PDH toxiciteit test gegeven. De eerste cel trapping efficiëntie van het apparaat is ongeveer 2,5%, dwz 5 van de 200 cellen zullen worden opgesloten. De definitieve bezetting van de cel vallen sterk afhankelijk van de gebruikte cellijn, het protocol op te schortende cellijn en het moment dat de cellen worden gespoeld door het kanaal. Voor cellen die van nature groeien in suspensie (bijvoorbeeld U937), kunnen enkele cellen worden gevonden in ongeveer 75% van de kamers na enkele minuten. De andere kamers zijn ofwel niet gevuld of bezet door twee of meer cellen. In het algemeen, de eencellige bezetting is kleiner voor hechtende cellijnen. Bij gebruik van de eerder mild suspendeerfase protocol hier gepresenteerde, het percentage af tot ongeveer 30% (HEK, MLT-cellen). De eencellige bezetting kan worden verbeterd door trypsine behandeling van de cellen, maar dit kan ook de resultaten van de experimenten veranderen.

Afhankelijk van het doelmolecuul kan adsorptie of absorptie PDMS de resultaten beïnvloeden. Adsorptie kan worden verminderd door het blokkeren van de oppervlakken met BSA of PLL-g-PEG. Absorptie is het onwaarschijnlijk voor de meeste hydrofiele biomoleculen, maar het moet worden gecontroleerd voor (kleine) lipofiele cel componenten.

1. Bereid de cellen volgens het specifieke protocol (bijv. drugsverslaving). Verende cellen, voeg cellen direct aan de chip. Voor lijm cellijnen gebruiken enzymvrije dissociatie buffer tot een celsuspensie te produceren. Filter de cellen vóór de introductie ervan in de chip om de hoeveelheid celgroepen verminderen.
2. Plaats de cellen op de chip met behulp van een injectiepomp en forward flow, in plaats van de celsuspensie trekken. Gebruik een stroomsnelheid van 5 ul / min voor suspensie cellijnen en hogere stroomsnelheden van 10-20 pl / min voor lijm cellen aangezien niet-specifieke hechting van de cellen te verminderen op de kanaalwanden.
3. Wanneer de vallen gevuld, sluit de kamers. Als veel cellen hechten niet-specifiek aan het oppervlak, proberen ze weg te wassen met celdissociatiebuffer met een stroomsnelheid van 10-30 pl / min.

Protocol A (enzymatische assays)

4. Trekken lysebuffer door de chip. Voor dit voorbeeld, deze buffer is een hypoosmolar buffer toegevoegd Tween 20 (10 mM Tris-HCl, 10mM KCl, 1,5 mM _MgCl2, 1% (v / v) Tween 20). Voor lysis, snel open en dicht kamers (dwz 500 msec voor debieten van 10-50 pl / min ^7,21). Voor de bepaling G6PDH, voeg 2 mM glucose-6-fosfaat, 0,5 mM NADP, 0,5 U / ml diaforase en 0,3 mM resazurin de lysisbuffer. Beginnen met het monitoren van de kinetische reactie direct na lysis.

Opmerking: Kies een buffer die geschikt is voor de test, maar kaal in het achterhoofd dat sterke reinigingsmiddelen (zoals Triton, SDS) Lyse cellen onmiddellijk en zal leiden tot een verlies van analyt tijdens kamer opening.

Protocol B (immunoassays)

Voor een korte beschrijving van de ELISA celexperimenten (debieten, kamer-status, etc.) wordt verwezen naar Tabel 1.

5. Voor ELISA, voegt de gewenste detectie reagens (bijv. secundair antilichaam, gemerkt antigeen) rechtstreeks aan de lysisbuffer. De hierin toegevoegde Tween 20 vermindert de niet-specifieke adsorptie. Lyseren van de cellen volgens stap 5.4. Incubeer het mengsel gedurende 10-15 minuten binding (incubatietijd afhankelijk van het gebruikte antigeen en antilichaam) mogelijk.
6. Antilichaam enzym conjugaten die niet-specifiek geadsorbeerde de kanaalwanden kan leiden tot een omzetting van de detectiereagens reeds in het reservoir en kanalen. Om problemen te verminderen van deze adsorptie, spoelen een permanente remmer van de gebruikte detectie enzym via de chip tijdens de incubatietijd (kamers gesloten, voordat u de detectiereagens). Voor de HRP, gebruiken 20 mM HCl in water om het niet-specifiek geadsorbeerd enzymen permanent te inactiveren.
7. Na incubatietijd introduceren detectie reagens (bijv. Amplex Red en waterstofperoxide voor HRP) aan de chip. Open de kamers binnenkort weer te wassen van de niet-gebonden secundair antilichaam weg en de detectie reagens toe te voegen. Beginnen met het monitoren van de kinetische reactie onmiddellijk.
8. Kalibratie: Immobiliserenhet antilichaam tegen het doelwit van belang. Sluiten kamers. Bereid verschillende concentraties van de stof in buffer of in cellysaat off-chip. Breng een concentratie naar de chip en snel wisselen van het volume in de kamers (500 msec openingstijd). Deze opening is voldoende kort om te voorkomen dat extra ophoping van analyt spoelen slechts een bepaald aantal moleculen van het volume van de microkamer gedetecteerd. Van de bekende concentratie van het antigeen in de oplossing en het volume van de kamer (625 pl) Bereken de hoeveelheid binnen de kamer. Daarna verder met stap 5.5 en de invoering van de detectie-eenheid.

Resultaten

Het platform kan een aantal intracellulaire en afgescheiden moleculen in of geproduceerd door enkele cellen te analyseren. Hier willen we ander voorbeeld studies aan de verscheidenheid van mogelijke tests onderstrepen. We zullen een voorbeeld voor een uitgescheiden enzym (figuur 5a) en een intracellulair enzym (figuur 5b) en eiwit (Figuren 5c en d). Voor meer voorbeelden, zoals co-factoren of kleine moleculen, verwijzen wij u naar Eyer et al.. ...

Discussie

Microfluidics technologie heeft nieuwe en fascinerende mogelijkheden voor single-cell analyse. In het bijzonder, heeft de mogelijkheid te vangen en te immobiliseren cellen individueel microfluïdische gereedschappen toegestaan ​​systematische korte en lange-termijn studies over eencellige eigenschappen en de respons. Bovendien inkapselen van cellen in hoogfrequente microdruppeltjes, gegenereerd op een microchip heeft enkele cel secretie studies, die niet kan worden uitgevoerd met gebruikelijke cytometrie inrichtingen ing...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
REAGENTS:
Naam van het reagens	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
SU-8 2015	MicroChem Corp. (Netwon, MA)	n.v.t.
1H,1H,2H,2H-Perfluorodecyl-dimethylchloro-silaan	ABCR (Karlsruhe, Duitsland)	AB103608
4-Methylumbelliferyl β-D-N,N′-diacetylchitobioside hydraat	Sigma Aldrich	M9763
Aceton	Merck VWR (Darmstadt, Duitsland)	100014
Avidine	AppliChem (Axon Lab AG)	A-2568
AZ 1518	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Duitsland)	n.v.t.
AZ 726 ontwikkelaar	AZ Electronic Materials (Wiesbaden, Duitsland)	n.v.t.
Bovine serumalbumine	Sigma Aldrich	A-4503
Bovine serumalbumine, biotin	Sigma Aldrich	A-8549
Celldissociatiebuffer	Invitrogen	13151-014
Hexamethyldisilazaan (HDMS)	Sigma Aldrich	40215
Zoutzuur	Fluka	84422
Isopropanol	Merck VWR (Darmstadt, Duitsland)	109634
Magnesiumchloride hexahydraat	Fluka	63068
MR developer 600	Microresist technology GmbH (Berlijn, Duitsland)	n.v.t.
PBS	Invitrogen	10010-031
PLL-g-PEG gegraft	SuSoS, (Dübendorf, Zwitserland)	n.v.t.
PLL-g-PEG gegraft biotin	SuSoS, (Dübendorf, Zwitserland)	n.v.t.
Kaliumchloride	Fluka	60132
Proteïne G, biotin	Sigma Fine Chemicals	41624
Siliciumwafer	Si-Mat (Kaufering, Duitsland)	n.v.t.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow Corning	39100000
Tris(hydroxymethyl)-aminomethaan	Biorad	1610716
Tween 20	Biorad	1706531
APPARATUUR:
Materiaalnaam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen (optioneel)
0,22 µm PES spuitfilter	TRP	99722
1/1,5 mm biopsie puncher	Miltex, York PA	33-31AA/33-31A
Cell Trics filter 20 µm	Partec	04-004-2325
Centrifuge Sigma 3-18K	Kuehner	n.v.t.
Hotplate HP 160 III BM	Sawatec, Sax, Zwitserland	n.v.t.
MA-6 mask aligner	Karl Suess	n.v.t.
Multizoom AZ100M microscoop	Nikon Corporation	n.v.t.
Fotomasker	Microlitho, Essex, U.K.	n.v.t
Plasma Cleaner PDC-32G	Harrick	n.v.t.
Spin coater Modell WS-400 BZ-6NPP/LITE	Laurell	n.v.t.
Spin Modules SM 180 BM	Sawatec, Sax, Zwitserland	n.v.t.
Step profiler Dektak XT Advanced	Bruker	n.v.t.
Spuitpomp neMESYS	Cetoni	n.v.t.