Oprichting van een<em&gt; In vitro</em&gt; Systeem om Intracellular Gedrag van Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In Human THP-1 macrofagen

Samenvatting

Het huidige artikel schetst een protocol bij een in vitro celcultuur model systeem om de interactie van een facultatief intracellulaire menselijke pathogene schimmel Candida glabrata met menselijke macrofagen, die een nuttig instrument om onze kennis van schimmel virulentiemechanismen vooruit zal bestuderen vestigen.

Samenvatting

Celkweek modelsysteem het, om nabootser host omgevingsomstandigheden, kan dienen als een goedkope, reproduceerbare en gemakkelijk manipuleerbaar alternatief diermodellen voor de studie van een specifieke stap van microbiële pathogeen infectie. Een cellijn van menselijke monocyten THP-1, die na forbolester behandeling, is onderverdeeld in macrofagen, is eerder gebruikt om virulentie strategieën van vele intracellulaire pathogenen zoals Mycobacterium tuberculosis bestuderen. Hier bespreken we een protocol bij een in vitro celkweek model vaardigen systeem met THP-1 macrofagen de interactie van een opportunistische pathogeen humaan gist Candida glabrata met menselijke fagocyten bakenen. Dit model is eenvoudig, snel, ontvankelijk voor hoog-mutant schermen, en vereist geen geavanceerde apparatuur. Een typische THP-1 macrofaag infectie experiment duurt ongeveer 24 uur met een extra 24-48 uur tot herstelde intracellulaire toestaangist om te groeien op rijk medium voor kolonievormende eenheden gebaseerd levensvatbaarheid. Als andere in vitro modelsystemen, een mogelijke beperking van deze benadering moeilijk extrapolatie van de verkregen zeer complex immuuncel circuits die in de menselijke gastheer resultaten. Echter, ondanks dit, het huidige protocol is zeer nuttig om de strategieën die een pathogene schimmel kan gebruiken om te ontwijken / tegen antimicrobiële respons en te overleven, aan te passen, en zich vermenigvuldigen in de voedselarme omgeving van gastheer immune cellen op te helderen.

Inleiding

Candida-soorten zijn de belangrijkste oorzaak van levensbedreigende invasieve schimmelinfecties bij immuungecompromitteerde patiënten ^1. Candida glabrata, een opkomende nosocomiale pathogeen, is de tweede of derde meest frequent geïsoleerd Candida-soorten uit patiënten Intensive Care Unit, afhankelijk van de geografische ligging ^1-3. Fylogenetisch, C. glabrata, een haploïde gist, is nauwer verwant aan de niet-pathogene model gist Saccharomyces cerevisiae dan pathogene Candida spp. waaronder C. albicans ^4. Consistent hiermee C. glabrata mist een aantal belangrijke schimmels virulentie eigenschappen, waaronder de paring, uitgescheiden proteolytische activiteit en morfologische plasticiteit ^4-5.

Hoewel C. glabrata vormt geen schimmeldraden, het kan overleven en repliceren in muis en mens macrofagen ^6-8 suggereert dat het unieke pathogenese mechanismen heeft ontwikkeld. Beperkte informatie beschikbaar is over de strategieën die C. glabrata telt overleven voedselarme intracellulaire macrofaag milieu en het tegengaan van oxidatieve en nonoxidative gastheer responsen bevestigd door gastheer immuuncellen ^5. Een pertinente macrofaag modelsysteem is een voorwaarde om de interactie van C. af te bakenen glabrata met gastheer fagocytcellen via functionele genomics en proteomics aanpak. Perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC) en beenmerg-afgeleide macrofagen (BMDMs) van humane en muriene oorsprong respectievelijk zijn eerder gebruikt om de interactie van C. bestuderen glabrata met gastheer immuuncellen ^7,9. Echter, moeilijkheden bij het verkrijgen PBMCs en BMDMs, hun beperkte levensduur en intrinsieke variatie tussen verschillende donoren zoogdieren beperken het gebruik van deze cellen zo veelzijdig modelsystemen.

Hier beschrijven we een methode voor het opstellen van een in vitro systeem om de intracellul studerenar gedrag van C. glabrata cellen macrofagen afkomstig van menselijke monocytische cellijn THP-1. De algemene doelstelling van dit protocol was om een ​​eenvoudige, goedkope, snelle en reproduceerbare celcultuurmodel systeem dat gemakkelijk kan worden gemanipuleerd om verschillende aspecten van gastheer-pathogene schimmel interactie te bestuderen vaardigen.

THP-1-cellen zijn eerder gebruikt om de immuunrespons tegen een groot aantal pathogenen zoals bacteriën, virussen en schimmels ^10-12 ontcijferen. Monocytische THP-1 cellen zijn gemakkelijk te onderhouden en kunnen worden onderscheiden, op forbolester behandeling, tot macrofagen die-monocyten afgeleide macrofagen van de menselijke na te bootsen en te uiten passende macrofaag markers ^13. De belangrijkste voordelen van THP-1 macrofagen modelsysteem zijn het gemak-of-gebruik en het ontbreken van geavanceerde apparatuur vereiste.

De hier gepresenteerde protocol gemakkelijk aan de interactie van andere menselijke schimmels met hos bestuderent immuuncellen. De huidige procedure kan ook worden gebruikt om virulentie te identificeren voor het organisme van belang met behulp van high throughput mutant schermen. Deze proof-of-concept werd geïllustreerd door het succesvolle gebruik van THP-1 cultuur modelsysteem om een set van 56 genen die nodig zijn voor de overleving van C. glabrata in menselijke macrofagen ⁸ identificeren.

Protocol

Het wordt aanbevolen om C. te voeren glabrata infectie experimenten in een laboratorium met bioveiligheid inperkingsniveau 2 (BSL-2).

1. Bereiding van THP-1 macrofaag monolaag.
2. Bereiding van C. glabrata celsuspensie.
3. Infectie van THP-1 macrofagen met C. glabrata cellen.
4. Meting van fagocytose snelheid en intracellulaire replicatie via kolonievormende eenheid assay.
5. Monitoring van de intracellulaire replicatie via confocale laser scanning microscopie.

1. Bereiding van THP-1 macrofaag monolaag

1. THP-1 is een cellijn van menselijke monocyten afkomstig uit het perifere bloed van een 1-jarige man kind dat lijdt aan acute monocytische leukemie ^14. THP-1, een suspensie cellijn, wordt routinematig gehandhaafd op 37 ° C in bevochtigde 5% _CO2 in RPMI-1640 kweekmedium aangevuld met 10% FBS (foetaal runderserum). Behandeling met forbol 12-myristate 13-acetaat (PMA een forbolester) levert terminale differentiatie van THP-1 monocytische cellen in macrofagen. Belangrijk is dat PMA behandeling geen invloed levensvatbaarheid van de cellen en gedifferentieerde cellen niet delen.
2. Zaad ongeveer 1,5 x 10 ⁶ THP-1 monocyten in 100 mm kweekschalen in RPMI-1640 compleet medium (RPMI-1640 medium aangevuld met 10% serum, 2 mM glutamine en antibiotica 1x, 10 ml / schaal) en liet cellen groeien bij 37 ° C in 5% _CO2 gedurende 2 dagen.
3. Zodra THP-1-cellen een dichtheid van 8 x 10 ⁵ cellen / ml bereikt hebben, de overdracht van de cultuur schotel om de celkweek laminaire stroming kap en draai voorzichtig met het vaste cellen opnieuw in suspensie.
4. Pipet de celsuspensie uit, breng het in een 15 ml steriele buis en centrifugeer bij 1000 rpm (130 xg) gedurende 4 minuten. Gooi supernatant en schorten THP-1 cel pellet in 5 ml vers, voorverwarmd, RPMI-1640 compleet medium.
5. Opsommen cellen met een hemocytometer en verdun de cell suspensie tot een uiteindelijke dichtheid van 10 ⁶ cellen / ml met voorverwarmd RPMI-1640 compleet medium
6. Voeg 1 ul van 160 mM voorraad PMA (forbol 12-myristaat 13-acetaat bereid in dimethylsulfoxide) aan 10 ml THP-1 celsuspensie (eindconcentratie 16 nM) en meng. Breng 1 ml celsuspensie in elk putje van een 24-well weefselkweek plaat en incubeer plaat in de incubator op 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 12 uur.
7. Verwijder oude medium, voeg 1 ml voorverwarmd RPMI-1640 compleet medium en laat cellen herstellen gedurende 12 uur bij 37 ° C in 5% _CO2.
8. Let cellen onder een omgekeerde microscoop zodat ovale THP-1 monocytische cellen in suspensie zijn gedifferentieerd in afgeplatte, spoelvormige en hechtende macrofagen. Deze gedifferentieerde cellen zijn nu klaar om C. te voeren glabrata infectie studies.

2. Bereiding van C. glabrata & #160; Cell Suspension

C. glabrata wildtype Lg2 wordt gebruikt om THP-1 macrofagen infecteren. C. glabrata cellen worden routinematig gekweekt in vloeibaar YPD (gistextract (1%)-pepton (2%) dextrose (2%)) medium. Solid YPD medium bereid door 2% agar medium voor autoclaaf.

1. Om een cultuur van C. bereiden glabrata, kies een enkele kolonie uit de agarplaat met een steriele wegwerpspuit lus en beënt in 10 ml YPD vloeibaar medium en incubeer 14-16 uur onder schudden (200 rpm) bij 30 ° C.
2. Centrifuge deze cultuur (1 ml) bij 4.000 tpm (1.800 x g) gedurende 5 minuten in een tafelmodel microcentrifuge, cellen driemaal wassen met steriele PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing, pH 7,4) en suspendeer celpellet in 1 ml PBS.
3. Meet OD ₆₀₀ van C. glabrata celsuspensie en verdunnen met een geschikt volume steriel PBS tot een dichtheid van 2 x 10 ⁶ cellen / ml te krijgen (OD ₆₀₀= 0,1). Alternatief kan de gewenste celdichtheid bereikt door optelling gistcellen met behulp van een hemocytometer.

3. Infectie van THP-1 macrofagen met C. glabrata Cellen

1. Voeg 50 ul C. glabrata celsuspensie THP-1 macrofagen (10 ⁶ cellen per well van een 24-putjes plaat) een MOI (multipliciteit van infectie) van 0,1 te verkrijgen en incubeer plaat bij 37 ° C met 5% _CO2.
2. Levensvatbare gist tellingen te bepalen, te verdunnen 50 ul C. glabrata celsuspensie 100-voudig in steriele PBS en de plaat 100 ul op YPD vast medium. Incubeer de platen bij 30 ° C en tel handmatig het aantal gist kolonies verschijnen na 1-2 dagen. Deze aantallen zullen voortaan worden aangeduid als 0 uur C. glabrata CFU (kolonie vormende eenheden).
3. Na 2 uur coculturing van THP-1 cellen met C. glabrata cellen, verwerp kweekmedium door het omkeren van 24-well weefselkweek plaat ina reservoir en was voorzichtig driemaal met voorverwarmde steriele PBS te nonphagocytosed extracellulaire C. verwijderen glabrata cellen. Gentle wassen met PBS zijn absoluut noodzakelijk om volledige verwijdering van alle extracellulaire gist bereiken zonder schade aan de THP-1 macrofaag monolaag.

4. Meting van Fagocytose Beoordeel en intracellulaire replicatie via Colony Forming Unit Assay

1. Lyse C. glabrata geïnfecteerd THP-1 macrofagen in 1 ml steriele H ₂ O 2 min, schraap zachtjes om de macrofaag puin uit de put en vang cellysaat in een microcentrifugebuis. Microscopische verificatie van complete macrofaag lysis is cruciaal voor het herstel van alle geïnternaliseerd gist.
2. Bereid een 100-voudige verdunning van lysaat in steriele PBS, 100 ul plaat op vast medium YPD platen en incubeer bij 30 ° C.
3. Na 1-2 dagen tellen handmatig het aantal C. glabrata kolonies die apdwenen op YPD medium, te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor (2 uur CFU's) en bereken fagocytose snelheid die verwijst naar het percentage van C. glabrata cellen die worden ingenomen door THP-1 macrofagen na 2 uur co-incubatie met de volgende formule.
   Fagocytose% = [(CFU 2 h) / (KVE bij 0 h)] X 100
4. Om de snelheid van de intracellulaire replicatie van C. meten glabrata cellen in THP-1 macrofagen verzamelen intracellulaire gist op verschillende tijdstippen na infectie dwz. 4, 6, 8, 10, 12 en 24 uur, door stap 3,3-4,3.
5. Bereken vouw survival / replicatie van C. glabrata cellen in THP-1 macrofagen door de totale CFU op een bepaald tijdstip met de 2 uur (gefagocyteerd gist).

5. Monitoring van intracellulaire replicatie via confocale Laser Scanning Microscopie

1. De stappen in Deel 1 beschreven zaad PMA behandelde 5 x 10 ⁵ THP-1 cellen in elk putje van twee vier putjes kamer glijbanen en incubeer bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 12 uur.
2. Vervang oude medium met voorverwarmde RPMI-1640 compleet medium en laat de cellen te herstellen van PMA behandeling gedurende 12 uur.
3. Bereid GFP (green fluorescent protein)-tagged C. glabrata celsuspensie zoals beschreven in hoofdstuk 2 en infecteren aan THP-1 macrofagen een MOI van 1. Als C. glabrata stammen die GFP beschikbaar zijn, gistcellen gelabeld met FITC (fluoresceïne isothiocyanaat) kan worden gebruikt om na vroege gebeurtenissen na infectie weten. fagocytose tarief en phagolysosomal rijping op 2 uur.
4. Incubeer dia's voor 2 uur bij 37 ° C met 5% CO _2, keer ze zorgvuldig tot middelgrote weggooien en was 3x met steriele, voorverwarmde PBS.
5. Voeg 500 ul voorverwarmde RPMI-1640 compleet medium aan elke kamer van een dia en incubeer deze bij 37 ° C met 5% _CO2 gedurende 22 uur.
6. Om 2 uur C. repareren glabrata geïnfecteerde THP-1 macrofagen, voeg 500 ul van 3,7% formaldehyde (bereid in PBS) aan elke kamer van de andere slede en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min in het donker.
7. Was schuif driemaal met PBS, voeg 500 pl Triton-X (0,7%), en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten in het donker.
8. Wassen dia 3x met PBS, verwijder kamer van cultuur glijbaan en lucht drogen voor 3-5 minuten in het donker.
9. Monteer een dekglaasje voorzichtig met Vectashield montage medium met DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenylindool) op dia vermijden van de vorming van luchtbellen. Verwijder voorzichtig de overtollige vloeistof met Kimwipe en afdichting dekglaasje randen met nagellak. WINKEL dia in het donker bij 4 ° C tot gebruik.
10. Herhaal de stappen 5.4 en 5,6-5,9 om THP-1-cellen te verwerken 24 uur na infectie.
11. Afbeelding cellen met behulp van een laser scanning confosche microscoop (60x olie-immersie objectief, excitatie bij 405 nm en 488 nm voor GFP en DAPI kleuring, respectievelijk).

Resultaten

Infectie analyses van PMA behandelde THP-1 macrofagen met C. glabrata wildtype (wt) cellen onthulde dat wt cellen gefagocyteerd door macrofagen met een snelheid van 55-65% na 2 uur co-incubatie. Verder C. glabrata cellen konden doden weerstaan ​​door THP-1 macrofagen en onderging een matige 5 - tot 7-voudige toename in CFU's na 24 uur van coculturing met THP-1 macrofagen ^8. Intracellulaire replicatie van wildtype cellen getransformeerd met GFP expressie plasmide in THP-...

Discussie

Aangeboren immuunsysteem speelt een belangrijke rol bij de controle van opportunistische schimmelinfecties. Macrofagen bijdragen aan de verdediging antifungale door inname en verwoesting van de pathogene schimmel. Zo zal opheldering van factoren die nodig zijn voor overleving en / of tegengaan van de antimicrobiële functies van macrofagen ons begrip van schimmels virulentie strategieën bevorderen. In deze context hebben we een in vitro celkweek modelsysteem middels macrofagen afgeleid van een humane monocytisch...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
THP-1	American Type Culture Collection	TIB 202	Human acute monocytic leukemia cell line
RPMI-1640	Hyclone	SH30096.01	Voor het onderhouden van THP-1 cellen
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich	P 8139	Let op: Gevaarlijk
YPD	BD-Difco	242710	Voor het kweken van Candida glabrata cellen
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	F8775	Voor het fixeren van C. glabrata-geïnfecteerde THP-1 macrofagen
Fosfaat buffer oplossing (PBS)			Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Fosfaat, 2,7 mM KCl,  pH 7,4) voor wasbeurten
Souline-natriumcitraat (SSC)			Buffer (3 M NaCl, 0,3 M natriumcitraat voor 20x concentratie) voor wasbeurten
Prehybridisatie buffer			Buffer (50% formamide, 5x Denhardt's oplossing, 5x SSC, 1% SDS) voor hybridisatie
VECTASHIELD montage medium	Vector Labs	H-1200	Voor het monteren van slides voor confocale microscopie
32P-gelabelde α-dCTP	JONAKI-BARC	LCP-102	Voor radiolabeling van signature tags
100 mm weefselkweek schaaltjes	Corning	430167	Voor het kweken van THP-1 cellen
24-well weefselkweek plaat	Corning	3527	Om C. glabrata infectie studies in THP-1 macrofagen uit te voeren
4-kamer weefselkweek-behandelde glasplaatje	BD Falcon	REF354104	Om C. glabrata-geïnfecteerde THP-1 macrofagen te beeldvormen
Hemocytometer	Rohem India		Voor het tellen van cellen
Bureaucentrifuge	Beckman Coulter	Microfuge 18	Om cellen in microtubes te centrifugeren
Bureaucentrifuge	Remi	R-8C	Om cellen in 15 ml buisjes te centrifugeren
Spectrofotometer	Amersham Biosciences	Ultraspec 10	Om de absorptie van gistcellen te monitoren
Plate incubatiekast	Labtech	Gekoeld	Om C. glabrata cellen te kweken
Schud-incubatiekast	New Brunswick	Innova 43	Om C. glabrata cellen te kweken
Watermantel CO2  incubatiekast	Thermo Electron Corporation	Forma serie 2	Om THP-1 cellen te kweken
Confocale microscoop	Carl Ziess	Ziess LSM 510 meta	Om C. glabrata-geïnfecteerde THP-1 macrofagen te observeren
Compound microscoop	Olympus	CKX 41	Om C. glabrata en THP-1 macrofagen te observeren
PCR machine	BioRad	DNA Engine	Om unieke tags uit input en output genomisch DNA te versterken
Hybridisatie oven	Labnet	Problot 12S	Voor hybridisatie
PhosphorImager	Fujifilm	FLA-9000	Voor het scannen van gehybridiseerde membranen
Thermomixer	Eppendorf	Thermomixer Comfort	Voor denaturatie van radiogelabelde signature tags
Gel documentatie unit	Alphainnontech	Alphaimager	Om ethidium bromide-gekleurd DNA in agarose gels te visualiseren