Het huidige artikel schetst een protocol bij een in vitro celcultuur model systeem om de interactie van een facultatief intracellulaire menselijke pathogene schimmel Candida glabrata met menselijke macrofagen, die een nuttig instrument om onze kennis van schimmel virulentiemechanismen vooruit zal bestuderen vestigen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Oprichting van een
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Celkweek modelsysteem het, om nabootser host omgevingsomstandigheden, kan dienen als een goedkope, reproduceerbare en gemakkelijk manipuleerbaar alternatief diermodellen voor de studie van een specifieke stap van microbiële pathogeen infectie. Een cellijn van menselijke monocyten THP-1, die na forbolester behandeling, is onderverdeeld in macrofagen, is eerder gebruikt om virulentie strategieën van vele intracellulaire pathogenen zoals Mycobacterium tuberculosis bestuderen. Hier bespreken we een protocol bij een in vitro celkweek model vaardigen systeem met THP-1 macrofagen de interactie van een opportunistische pathogeen humaan gist Candida glabrata met menselijke fagocyten bakenen. Dit model is eenvoudig, snel, ontvankelijk voor hoog-mutant schermen, en vereist geen geavanceerde apparatuur. Een typische THP-1 macrofaag infectie experiment duurt ongeveer 24 uur met een extra 24-48 uur tot herstelde intracellulaire toestaangist om te groeien op rijk medium voor kolonievormende eenheden gebaseerd levensvatbaarheid. Als andere in vitro modelsystemen, een mogelijke beperking van deze benadering moeilijk extrapolatie van de verkregen zeer complex immuuncel circuits die in de menselijke gastheer resultaten. Echter, ondanks dit, het huidige protocol is zeer nuttig om de strategieën die een pathogene schimmel kan gebruiken om te ontwijken / tegen antimicrobiële respons en te overleven, aan te passen, en zich vermenigvuldigen in de voedselarme omgeving van gastheer immune cellen op te helderen.
Inleiding
Candida-soorten zijn de belangrijkste oorzaak van levensbedreigende invasieve schimmelinfecties bij immuungecompromitteerde patiënten 1. Candida glabrata, een opkomende nosocomiale pathogeen, is de tweede of derde meest frequent geïsoleerd Candida-soorten uit patiënten Intensive Care Unit, afhankelijk van de geografische ligging 1-3. Fylogenetisch, C. glabrata, een haploïde gist, is nauwer verwant aan de niet-pathogene model gist Saccharomyces cerevisiae dan pathogene Candida spp. waaronder C. albicans 4. Consistent hiermee C. glabrata mist een aantal belangrijke schimmels virulent....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Het wordt aanbevolen om C. te voeren glabrata infectie experimenten in een laboratorium met bioveiligheid inperkingsniveau 2 (BSL-2).
- Bereiding van THP-1 macrofaag monolaag.
- Bereiding van C. glabrata celsuspensie.
- Infectie van THP-1 macrofagen met C. glabrata cellen.
- Meting van fagocytose snelheid en intracellulaire replicatie via kolonievormende eenheid assay.
- Monitoring van de intracellulaire replicatie via confocale laser scanning microscopie.
1. Bereiding van THP-1 macrofaag monolaag
- THP-1 is een cellijn van menselijke monocyten a....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Infectie analyses van PMA behandelde THP-1 macrofagen met C. glabrata wildtype (wt) cellen onthulde dat wt cellen gefagocyteerd door macrofagen met een snelheid van 55-65% na 2 uur co-incubatie. Verder C. glabrata cellen konden doden weerstaan door THP-1 macrofagen en onderging een matige 5 - tot 7-voudige toename in CFU's na 24 uur van coculturing met THP-1 macrofagen 8. Intracellulaire replicatie van wildtype cellen getransformeerd met GFP expressie plasmide in THP-.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Aangeboren immuunsysteem speelt een belangrijke rol bij de controle van opportunistische schimmelinfecties. Macrofagen bijdragen aan de verdediging antifungale door inname en verwoesting van de pathogene schimmel. Zo zal opheldering van factoren die nodig zijn voor overleving en / of tegengaan van de antimicrobiële functies van macrofagen ons begrip van schimmels virulentie strategieën bevorderen. In deze context hebben we een in vitro celkweek modelsysteem middels macrofagen afgeleid van een humane monocytisch.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door Innovative Young Biotechnologist Award BT/BI/12/040/2005 en BT/PR13289/BRB/10/745/2009 subsidie van de afdeling Biotechnologie, de regering van India en de kern fondsen van Centrum voor DNA-vingerafdrukken en Diagnostics, Hyderabad. MNR en GB zijn de ontvangers van de Junior en Senior Research Fellowships van de Raad voor Wetenschappelijk en Industrieel Onderzoek naar het nastreven van een doctoraat van de Manipal University. SB is de ontvanger van Junior en Senior Research Fellowship van de afdeling Biotechnologie, op het voeren van een doctoraat van de Manipal University.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| THP-1 | American Type Culture Collection | TIB 202 | Human acute monocytic leukemia cell line |
| RPMI-1640 | Hyclone | SH30096.01 | Voor het onderhouden van THP-1 cellen |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma-Aldrich | P 8139 | Let op: Gevaarlijk |
| YPD | BD-Difco | 242710 | Voor het kweken van Candida glabrata cellen |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | Voor het fixeren van C. glabrata-geïnfecteerde THP-1 macrofagen |
| Fosfaat buffer oplossing (PBS) | Buffer (137 mM NaCl, 10 mM Fosfaat, 2,7 mM KCl, pH 7,4) voor wasbeurten | ||
| Souline-natriumcitraat (SSC) | Buffer (3 M NaCl, 0,3 M natriumcitraat voor 20x concentratie) voor wasbeurten | ||
| Prehybridisatie buffer | Buffer (50% formamide, 5x Denhardt's oplossing, 5x SSC, 1% SDS) voor hybridisatie | ||
| VECTASHIELD montage medium | Vector Labs | H-1200 | Voor het monteren van slides voor confocale microscopie |
| 32P-gelabelde α-dCTP | JONAKI-BARC | LCP-102 | Voor radiolabeling van signature tags |
| 100 mm weefselkweek schaaltjes | Corning | 430167 | Voor het kweken van THP-1 cellen |
| 24-well weefselkweek plaat | Corning | 3527 | Om C. glabrata infectie studies in THP-1 macrofagen uit te voeren |
| 4-kamer weefselkweek-behandelde glasplaatje | BD Falcon | REF354104 | Om C. glabrata-geïnfecteerde THP-1 macrofagen te beeldvormen |
| Hemocytometer | Rohem India | Voor het tellen van cellen | |
| Bureaucentrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 18 | Om cellen in microtubes te centrifugeren |
| Bureaucentrifuge | Remi | R-8C | Om cellen in 15 ml buisjes te centrifugeren |
| Spectrofotometer | Amersham Biosciences | Ultraspec 10 | Om de absorptie van gistcellen te monitoren |
| Plate incubatiekast | Labtech | Gekoeld | Om C. glabrata cellen te kweken |
| Schud-incubatiekast | New Brunswick | Innova 43 | Om C. glabrata cellen te kweken |
| Watermantel CO2 incubatiekast | Thermo Electron Corporation | Forma serie 2 | Om THP-1 cellen te kweken |
| Confocale microscoop | Carl Ziess | Ziess LSM 510 meta | Om C. glabrata-geïnfecteerde THP-1 macrofagen te observeren |
| Compound microscoop | Olympus | CKX 41 | Om C. glabrata en THP-1 macrofagen te observeren |
| PCR machine | BioRad | DNA Engine | Om unieke tags uit input en output genomisch DNA te versterken |
| Hybridisatie oven | Labnet | Problot 12S | Voor hybridisatie |
| PhosphorImager | Fujifilm | FLA-9000 | Voor het scannen van gehybridiseerde membranen |
| Thermomixer | Eppendorf | Thermomixer Comfort | Voor denaturatie van radiogelabelde signature tags |
| Gel documentatie unit | Alphainnontech | Alphaimager | Om ethidium bromide-gekleurd DNA in agarose gels te visualiseren |
Referenties
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J. Epidemiology of Invasive Candidiasis: a Persistent Public Health Problem. Clin. Microbiol. Rev. 20 (1), 133-163 (2007).
- Pfaller, M. A., Diekema, D. J., et al. Results from the ARTEMIS DISK global antifungal surveillance stu....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
