Methodenartikel

Een Computer-assisted Multi-elektrode Patch-clamp System

DOI:

10.3791/50630

⸱

18 oktober 2013

 , 
1Laboratory of Neural Microcircuitry - Brain Mind Institute, Ecole Polytechnique Federale de Lausanne

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Multi-elektrode patch-clamp vormen een complexe taak. Hier laten we zien hoe, door het automatiseren van veel van de experimentele stappen is het mogelijk om het proces dat tot kwalitatieve verbetering van de prestaties en het aantal opnamen versnellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De patch-clamp techniek is vandaag de dag de meest bekende methode voor het opnemen van elektrische activiteit van individuele neuronen of de subcellulaire compartimenten. Toch een stabiele opnamen, zelfs individuele cellen, blijft een tijdrovende procedure bijzonder complex. Automatisering van de vele stappen in combinatie met een efficiënte informatiedisplay kan sterk experimentalisten bij het uitvoeren van een groter aantal opnames met grotere betrouwbaarheid en in minder tijd. Om grootschalige opnames realiseren concludeerde we de meest efficiënte aanpak is niet om volledig te automatiseren het proces, maar om de experimentele stappen te vereenvoudigen en verminderen de kans op menselijke fouten tijdens het efficiënt opnemen van de ervaring van de experimentator en visuele feedback. Met deze doelstellingen in het achterhoofd een computerondersteund systeem dat alle noodzakelijke controles centraliseert voor een multi-elektrode patch-clamp experiment in een enkele interface, een commerc ontwikkelden weially beschikbare draadloze gamepad, tijdens het weergeven van experiment gerelateerde informatie en begeleiding aanwijzingen op het computerscherm. Hier beschrijven we de verschillende onderdelen van het systeem die ons toeliet om de tijd die nodig is voor het bereiken van de opname configuratie verlagen en aanzienlijk verhogen de kans op grote aantallen neuronen tegelijk met succes opnemen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het vermogen opnemen en stimuleren meerdere sites met micrometer precisie is uitermate geschikt voor experimenteel een beter begrip van neuronale systemen. Vele technieken zijn ontwikkeld om dit doel maar niemand kan de submillivolt resolutie bereikt door de patch-clamp techniek, essentieel voor het bestuderen subklinische activiteit en individuele postsynaptische potentialen. Hier bespreken we de ontwikkeling van een twaalf-elektrode computerondersteunde patch-clamp systeem gericht op het gelijktijdig opnemen en stimuleren een groot aantal individuele cellen met voldoende nauwkeurigheid voor de studie van neuronale connectiviteit. Terwijl vele andere toepassingen denkbaar voor een dergelijk systeem leent zich bijzonder goed voor de studie van synaptische connectiviteit aangezien het aantal mogelijke verbindingen binnen een groep van neuronen groeit evenredig met het kwadraat van het aantal neuronen betrokken. Daarom, terwijl een systeem met drie elektroden maakt het testenoptreden van maximaal zes verbindingen en meestal een enkele opname, opname twaalf neuronen kan het testen van de aanwezigheid van maximaal 132 verbindingen en vaak observeren dan een dozijn (figuur 1). De waarneming van tientallen verbindingen tegelijkertijd maakt het mogelijk om de inrichting van kleine netwerken te analyseren en afleiden statistische eigenschappen van de netwerkstructuur die anders 1 kan worden gesondeerd. Bovendien precieze stimulatie van talrijke cellen maakt het ook mogelijk de kwantificering van de aanwerving van postsynaptische cellen 2.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Uitrusting Voorbereiding

  1. Controle manipulatoren van een computer
    1. Sluit elke micromanipulator controller doos op een computer via de seriële poort (RS-232).
    2. Implementeren van de commando's voor het positioneren, bevragen en instellingen aanpassen via de seriële poort worden gestuurd. Bepaalde snelheid en hardware compatibiliteitsproblemen C / C + + wordt aanbevolen als de programmeertaal.
    3. Standaardisering van het referentiesysteem van de manipulatoren, zodat nul ligt het dichtst mogelijke positie ten opzichte van de motoren en positieve beweging wordt weggeleid van de motoren.
    4. Plaats de microscoop op zijn centrale positie 2 mm boven het monster focal plane (coördinaten [0, 0, 2000]).
    5. Store voor elke manipulator, de lokale coördinaten waarmee de punt van een pipet wordt waargenomen in het midden van het gezichtsveld van de microscoop. Dit is het eerste referentiepunt voor elke elektrode.
  2. Visualize elektrodepositie. Het is erg handig om de positie van elke elektrode volgen tijdens een experiment. Een grafische weergave is de meest intuïtieve manier om dit te verwezenlijken. Daartoe de referentiesystemen van elke elektrode en die van de microscoop moet worden afgestemd. Een eenvoudige manier om dit te bereiken is:
    1. Breng de punt van een elektrode naar het midden van het gezichtsveld.
    2. Sla de positie op elke as van de manipulator en elke as van de microscoop.
    3. Voer de x-as van de manipulator een relatief grote beweging (1 mm).
    4. Zoek de tip eens te meer het verplaatsen van alleen de microscoop.
    5. Bereken het verschil in de microscoop functie sinds het laatst gemeten. Dit zijn de projecties van de elektrode asbeweging op de microscoop assen.
    6. Herhaal stap 2,3-2,5 voor de Y-en Z-assen van de elektrode manipulator. Hierdoor kan een matrix van projecties op de microscoop assen te bepalen ( Figuur 2) ook wel cosinus matrix:
      figure-protocol-1
    7. Inverteer de matrix mogelijk maken de bewegingen in drie dimensies, die door de elektrode manipulator naar een bepaalde positie in de microscoop coördinatensysteem bereikt berekenen:
      figure-protocol-2
    8. De eerste referentiepunt en de cosinus matrix bepaalt de positie van elke elektrode in microscoop coördinaten.
    9. Grafisch weergeven, gebaseerd op de microscoop, de plaats van elke elektrode regelmatig. We kozen voor een C / C + + tekening bibliotheken (GDI +) gebruiken om de elektrode posities elke 40 msec trekken.
    10. Herhaal stap 1.2.1 - 1.2.7 telkens manipulator hoeken wordt gewijzigd of positieveranderingen van enkele millimeters nodig, bijvoorbeeld wanneer het type elektrode wordt veranderd.
  3. Enable opslaan van de positions van relevante kenmerken in het weefsel, zoals cellen of anatomische referentiepunten, microscoop coördinaten.
  4. Verwerven video en overlay relevante informatie.
    1. Mechanisch lijn de x-as van beweging van de microscoop met de horizontale as van de microscoop camera.
    2. Installeren op de computer een framegrabber met live video en overlay mogelijkheden en een software development kit (SDK).
    3. Implementeer live video weergave in bedrijf met de SDK.
    4. Zetten de microscoop assenstelsel met de referentie camerasysteem door de juiste vertaling en scaling.
    5. Teken de relevante kenmerken in camera coördinaten en overlay op de live video het resulterende beeld met regelmatige tussenpozen van ongeveer 40 msec (figuur 3).
  5. Controle Versterkers.
    1. Gebruik de versterker software om de versterker instellingen van de interface.
  6. Control oscilloscopen.
    1. Sluit de oscilloscoop aan op de PC met behulp van seriële poorten.
    2. Bepaal de oscilloscoop schaal, koppeling en temporele resolutie voor de verschillende stappen van de patch-clamp procedure in voltage-clamp (bijv. elektrode in bad, seal vorming, whole-cell configuratie) en de huidige-klem.
    3. Stuur het juiste oscilloscoop instelling commando wanneer versterker opdrachten worden afgegeven vanaf de interface.
  7. Controle pipet druk.
    1. Monteer een drukregelinrichting volgens figuur 4.
      1. Gebruik een 12 V / 5 V voeding aan elke elektronische component op de juiste wijze te leveren.
      2. Verbind de uitgang van een membraan pomp naar de positieve druk buffer (een 100 ml verpakking).
      3. Sluit de ingang van een membraan pomp naar de negatieve druk buffer (een 100 ml verpakking).
      4. Sluit de pipet houder buis een druksensor in het drukniveaure controlesysteem en een pneumatische klep die aansluit op de belangrijkste druk compartiment.
      5. Sluit elk van de drukbuffers een klep aangesloten op het drukruimte.
      6. Sluit een klep tussen de belangrijkste druk compartiment en de sfeer.
      7. Sluit een druksensor naar de belangrijkste druk compartiment.
      8. Sluit een druksensor voor elke buffer.
      9. Sluit de druk controlesysteem om een ​​data-acquisitie board.
      10. Sluit elke druksensor aan een analoge ingang.
      11. Sluit elke klep op een digitale uitgang.
    2. Verwijder luchtdruk opzichte van alle sensoren door het openen alle afsluiters behalve die aansluiten op het membraan pompen en aftrekken van de gemeten druk.
    3. Implementeer drukregeling
      1. Definieer in de interface een controle met betrekking tot positieve drukregeling voor elke pipet activeren of de-activeren.
      2. Definieer een minimale positieve druk de pipets van ongeveer 70 mbar.
      3. Periodiek (om de 0,5 sec) op te sporen wanneer druk in pipetten onder actieve drukregeling onder de ingestelde drempel.
      4. Bij het overschrijden van de drempel open de positieve druk buffer naar de belangrijkste druk compartiment en dit compartiment naar het pipet in kwestie gedurende korte periodes (20 msec) totdat de druk in de pipetten is boven de drempel. Sluit alle andere kleppen.
      5. De-activeren verder drukregeling als de uiteindelijke aanpak van een cel van belang wordt geïnitieerd.
    4. Solliciteer negatieve druk voor afdichting vorming
      1. Sluit alle kleppen en open de negatieve druk bufferklep richting van de belangrijkste druk compartiment en dit compartiment naar het pipet in kwestie voor de duur van de onderzoeker vereist door het houden van een knop ingedrukt.
  8. Centraliseren commando's op een human interface device.
    1. Sluit een in de handel verkrijgbare wireless gamepad op de PC.
    2. Implementeer uitlezing van de joystick-status. Gebruik bijvoorbeeld de DirectX bibliotheken voor C / C + + te readouts elke 5 msec voeren.
    3. Vergelijk huidige status met vorige toestand om te detecteren welke toets wordt ingedrukt, vrijgelaten of ingedrukt gehouden sinds de laatste keer stap.
    4. Functies toewijzen aan elke knop op de gamepad. Een voorbeeld van deze afbeelding is getoond in figuur 5.

2. Patch-clamp Procedure

  1. Bereid de hersenen plakjes van de regio van belang.
  2. Leg een plakje hersenen van belang, met het gebied van belang in het centrum van verplaatsing bereik van de microscoop.
  3. Cell Selection
    1. Identificeer cellen van belang door te bladeren met de microscoop. Bewaar de positie van de cellen op basis van de microscoop assenstelsel met een rechter muisklik op de live video display bovenop de cel van belang.
    2. De grafische interface wordt het geselecteerde cellen alsmede de micropipetten voor een globaal overzicht en software weer een marker op de celpositie die worden gevuld op de beelden. Bovendien een beeld van de cel wordt vastgelegd voor toekomstig gebruik in het bestand 'Cell #. Jpg'.
  4. Toewijzing van cellen aan pipetten
    1. Na het selecteren van de cellen van belang, toe te wijzen die pipet elke cel zal opnemen. De grafische interface biedt opdracht controles die moeten worden ingesteld. Visualiseer een voorbeeld van het uiteindelijke configuratie door het selectievakje 'Show Final Positions'.
    2. Selecteer elke pipet, waarvan de definitieve positie voorvertoning gewenst of vink dan de 'Alles selecteren'. Schakel de huidige positie-display voor een betere visualisatie indien nodig.
  5. Bereid de pipetten
    1. Vul de pipetten (6-8 MQ zijn meestal het beste als vele pipetten worden gebruikt) with intracellulaire oplossing en uploaden deze in de houders. Plaats de headstages in hun fixaties, maar ze niet naar voren schuiven om te voorkomen dat het aanraken van het bad met de pipet tip.
    2. De overdruk in te schakelen en selecteren pipetten dat de uiteinden schoon blijft. Schuif elke headstage op zijn plaats.
  6. Het lokaliseren van de pipet tips
    1. Plaats de microscoop naar een centrale positie met focus 3 mm boven het schijfje met de toets R2 terwijl knop 'A'. Gebruik de overeenkomstige positie voor elke manipulator zoals opgeslagen van de vorige experiment door te drukken op de knop L2 terwijl knop A.
      NB: Op dit punt moet er ofwel een onderscheidend schaduw van een pipet in het oog of een kleine beweging langs de as van de pipet is genoeg om het te observeren in de meeste gevallen moeten zijn. Compensatie voor de kleine verschillen in pipet vorm moet handmatig worden uitgevoerd.
    2. Breng de pipet tip in beeld. Plaats de tip op de rode punt in het midden van het beeldscherm, zonder het verplaatsen van de microscoop (het moet nog steeds op positie [0, 0, 2000]).
    3. Informeer de software die de pipet is in het midden van het scherm door op de knop Z terwijl knop C. Na elke pipet tip is gevestigd, stuur die pipet naar achteren zodat de volgende kan worden gelokaliseerd door op L1-toets terwijl u de knop A.
  7. Het naderen van de cellen
    1. Zodra alle pipet tips zijn nauwkeurig gelokaliseerd en elke pipet wordt toegeschreven aan een cel, automatisch de positie van de pipetten dicht bij hun respectievelijke cellen. Klik met de rechtermuisknop in het centrum van de groep cellen en selecteer de optie 'Cluster' in het popup-menu. Op het cluster opties venster dat verschijnt, selecteert u alle pipetten die u wilt positioneren op dit moment en klik op 'Ga door met alle geselecteerde pipetten'. Herhaal deze handeling voor elke cluster van cellen van belang.
    2. Pehandmatig rform de eindnadering. De positie van de pipetten opzichte van de cellen anders gespecificeerd, maar meestal is gewoon 200 urn afstand van de cel in de as van de pipet en 200 micrometer boven het in de verticale richting, wat genoeg is om de punt van de pipet buiten het weefsel behouden . Wacht tot de positionering van de pipetten is afgewerkt en verplaats de microscoop naar een pipet door te drukken op de knop R1 terwijl knop C.
    3. Herijken elke pipet positie door te focussen de microscoop op de punt ergens in het beeldscherm en toets B, terwijl u de knop C. Een vierkant rooster moeten kort de melding dat de vastgestelde positie van de pipet. Als de positie niet juist is, de positie van de tip op het centrale punt van het beeldscherm en druk op de knop Z terwijl knop C.
  8. Bepaal de configuratie-cel bevestigd
    1. Bevestigen dat de cel van belang zijn voor de huidige pipet is correctgemarkeerd. Anders gaan de microscoop om de cel van belang met de centrale rode stip overeenkomen. Markeer de cel door op Y knop terwijl u de knop C. Druk op de knop L2 terwijl u knop C om de pipet 200 urn uit de buurt van haar toegewezen cel te positioneren, wordt de microscoop automatisch naar de corresponderende positie.
    2. Pas de pipet positie, zodat het overeenkomt met de rode stip. Pas de pipet gecompenseerd door op de knop R1 terwijl knop X.
    3. Activeer de test puls door op L1-toets, terwijl u de knop X. Langzaam naderen de pipet om haar toegeschreven cel.
    4. Bij het observeren van de vorming van een kuiltje op het oppervlak van de cel membraan passen een korte puls van negatieve druk door knop Y terwijl knop Z om de toegepaste druk op de cel te bereiken. Een bedrijf potentieel van ongeveer-65mV moet op dit punt vastgesteld door op de knop L2 terwijl knop X.
  9. Whole-cell configuratie
    1. Zodra een Giga-afdichting wordt gevormd voor elke cel, beginnen scheuren de membranen door het toepassen van negatieve druk.
  10. Voer opnames
    1. Gebruik de stimulatie / acquisitie systeem om uw opnamen te voeren. Breng pulsen of reeksen pulsen aan een individuele cel tegelijk en acht reacties van de resterende cellen connectiviteit kaart van de opgenomen cellen.
  11. Achteruitgaan pipetten
    1. Zodra opnames klaar zijn, wijken pipetten langzaam uit het weefsel door rechts te klikken op de Lijst radio-knop. Selecteer 'ebben-> pipetten 500 urn' om de pipetten wijken op korte afstand langs hun assen. Let op de drift in het potentieel van de cellen (het opruimen van de tips door het toepassen van een aantal positieve druk kan helpen).
    2. Om pipetten wijken helemaal terug, zet de positionering snelheid 'Fast' en herhaal dezelfde handeling, maar kiezen voor de 'All' optie. Verwijder de gebruiktepipetten door voorzichtig uitschuiven van het headstages en losschroeven van de pipetten van de houders. Het is nuttig om te voorkomen draaien de houders in hun voeten omdat dit sterk storende pipetpunt positie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na de hierboven beschreven werkwijzen het gelukt uitvoeren whole-cell opname van maximaal twaalf neuronen gelijktijdig bijna verdubbeling van het grootste aantal neuronen tegelijk-patch geklemd tot nu toe. Voorbeelden van netwerken van directe synaptische verbindingen tussen piramidale neuronen die in laag V van de somatosensorische cortex van ratten zijn weergegeven in figuur 6.

De bepaling van de verbinding waarschijnlijkheid profielen als functie van inter-somatische afst...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een onmiddellijke vraag ontstaat meestal over de mate van succes van de procedure die wij beschreven. Voor hoge slagingspercentages voorbereiding is essentieel. Pipetten moeten hebben tip openingen die geschikt zijn voor de cellen wezens opgenomen zijn. Filtreren van de intracellulaire oplossing verstopte pipetten voorkomen is ook belangrijk. Zeer schoon, vers getapt pipetten zijn een andere eis. Een binomiale verdeling is het eenvoudigste model dat kan worden gebruikt om te begrijpen hoe deze problemen beïnvloeden de u...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij willen Gilad Silberberg, Michele Pignatelli, Thomas K. Berger, Luca Gambazzi en Sonia Garcia bedanken voor waardevolle adviezen over verbeteringen voor de patch-clamp procedure automatisering. Wij danken Rajnish Ranjan voor waardevolle adviezen en assistentie software implementatie. Dit werk werd deels gefinancierd door de EU Synapse-project en deels door het Human Frontier Science Program.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
MicroscopeOlympusBX51WI40X Immersion Objective
ManipulatorsLuigs NeumannSM-5Serial protocol used
AmplifiersAxon InstrumentsMultiClamp 700BSDK used
CameraTill PhotonicsVS 55BNC analog output
FramegrabberData TranslationDT3120SDK used
OscilloscopesTektronixTDS 2014Serial communication
Data acquisitionInstruTECHITC 1600
Data acquisitionNational InstrumentsPCI-6221Library used (.dll)
Pressure valveSMCSMC070C-6BG-32
Pressure sensorHoneywell24PCDFA6G
Membrane pumpSchegoOptimal

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perin, R., Berger, T. K., Markram, H. A synaptic organizing principle for cortical neuronal groups. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 5419-5424 (2011).
  2. Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief Bursts Self-Inhibit and Correlate the Pyramidal Network. PLoS Biol. 8, e1000473(2010).
  3. Fino, E., Yuste, R. Dense inhibitory connectivity in neocortex. Neuron. 69, 1188-1203 (2011).
  4. Packer, A. M., Yuste, R. Dense, Unspecific Connectivity of Neocortical Parvalbumin-Positive Interneurons: A Canonical Microcircuit for Inhibition. J. Neurosci. 31, 13260-13271 (2011).
  5. Berger, T. K., Perin, R., Silberberg, G., Markram, H. Frequency-dependent disynaptic inhibition in the pyramidal network: a ubiquitous pathway in the developing rat neocortex. J. Physiol. 587, 5411-5425 (2009).
  6. Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo. Nat. Methods. 9, 585-587 (2012).
  7. Anastassiou, C. A., Perin, R., Markram, H., Koch, C. Ephaptic coupling of cortical neurons. Nat. Neurosci. 14, 217-223 (2011).
  8. Prakash, R., et al. Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation. Nat. Methods. 9, 1171-1179 (2012).
  9. Papagiakoumou, E., et al. Scanless two-photon excitation of channelrhodopsin-2. Nat Methods. 7, 848-854 (2010).
  10. Ko, H., et al. Functional specificity of local synaptic connections in neocortical networks. Nature. 473, 87-91 (2011).
  11. Wickersham, I. R., et al. Monosynaptic Restriction of Transsynaptic Tracing from Single, Genetically Targeted Neurons. Neuron. 53, 639-647 (2007).
  12. Liang, C. W., Mohammadi, M., Santos, M. D., Tang, C. -M. Patterned Photostimulation with Digital Micromirror Devices to Investigate Dendritic Integration Across Branch Points. J. Vis. Exp. (49), e2003(2011).
  13. Nikolenko, V., et al. SLM Microscopy: Scanless Two-Photon Imaging and Photostimulation with Spatial Light Modulators. Front Neural Circuits. 2, (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Multi elektrode registratiecomputerondersteund systeemwhole cell modusanalyse van neuronale netwerkenpositionering van pipettenvorming van giga sealsmapping van synaptische connectiviteitdraadloze gamepad besturingvisuele feedbackinterface

Gerelateerde artikelen