Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen

Summary

Twee aanvullende methoden op basis van flowcytometrie en microscopie gepresenteerd die de kwantificering van de enkele cel, de dynamiek van genexpressie geïnduceerd door de activering van MAPK route in gist mogelijk.

Abstract

De kwantificering van genexpressie op het eencellige niveau onthult nieuwe regulerende mechanismen verduisterd in de metingen uitgevoerd op populatieniveau. Twee methoden op basis van microscopie en flowcytometrie worden aangetoond hoe dergelijke gegevens kunnen worden verkregen. De expressie van een fluorescerende reporter geïnduceerd na activering van de hoge osmolariteit glycerol MAPK route in gist wordt gebruikt als een voorbeeld. De specifieke voordelen van elke methode worden gemarkeerd. Flowcytometrie meet een groot aantal cellen (10.000) en een directe maat voor de dynamiek van eiwitexpressie onafhankelijk van de langzame rijping kinetiek van het fluorescerende eiwit. Beeldvorming van levende cellen door microscopie is daarentegen beperkt tot het meten van de gerijpte vorm van de reporter in minder cellen. Echter, de datasets gegenereerd door deze techniek zeer rijk dankzij de combinatie van meerdere reporters en de ruimtelijke en temporele informatieverkregen van individuele cellen. De combinatie van deze twee meetmethoden kunnen nieuwe inzichten in de regulatie van eiwitexpressie leveren door signaalwegen.

Introduction

Signalering via transductie cascades vaak culmineert in de expressie van eiwitten. De karakterisering van deze expressieprofiel is een belangrijk element in het begrijpen van de functie van biologische wegen. De identificatie van het spectrum van up-gereguleerde eiwitten en de dynamiek van hun activering kan worden bereikt door verschillende technieken, zoals micro-arrays, Northern blots en Western-blots ^1-3. Echter, deze technieken gemiddelde van de respons van een gehele celpopulatie. De fijne regeling van de expressie van eiwitten te begrijpen, is het wenselijk om metingen te verzamelen op enkele cel. Idealiter zouden deze metingen ook kwantitatieve geg....

Protocol

1. Microscopie Metingen

1. Inoculeer 5 ml synthetisch medium met gist.
2. Groeien cellen bij 30 ° C gedurende de nacht.
3. Meet de OD ₆₀₀ van de overnacht cultuur de volgende ochtend.
4. Verdunnen overnacht cultuur in 5 ml synthetisch medium om _OD600 0,05.
5. Groeien de verdunde cultuur bij 30 ° C gedurende ten minste 4 uur.
6. Bereid 3-voudig geconcentreerd (0,6 M) NaCl-oplossing in synthetisch medium.
7. Bereid een 1 mg / ml oplossing van Concanavaline A (ConA) in PBS.
8. Het filtraat -200 pl ConA oplossing in de put dia.
9. Laat staan ​​voor 30 minuten.
10. Verwijder ConA o....

Results

Microscopie

Gist cellen die de expressie reporter p STL1-qV (ySP9 ⁷⁾ zijn bevestigd aan de bodem van de put-glijbaan en onder de microscoop geplaatst. De cellen werden gestimuleerd door toevoeging van stress medium direct in de put tijdens de opnamesessie. Dit stelt ons in staat om een ​​paar beelden van de cellen te verwerven voor pathway inductie en volg hun lot na de stimulatie. In het onderhavige geval werden de cellen gevolgd ~ 2 uur met een tijdsinterval van 10 minuten.......

Discussion

Microscopie

De behandeling van het goed met ConA is een essentiële stap voor een goede beeldvorming van de cellen te waarborgen. Omdat ConA is slecht oplosbaar in PBS (5 mg / ml), het filtratieproces kan de verwijdering van grote aggregaten die in de ongefilterde oplossing zijn en storen de beeldvorming. Cellen hechten relatief sterk aan het behandelde oppervlak en de toevoeging van de inducerende oplossing niet de lokalisatie van de cellen te verstoren, waardoor een continu volgen voor en na d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Yeast Nitrogen Base	ForMedium	CYN6202
CSM amino-acid mix	ForMedium	DCS0011
Concanavalin A	GE Healthcare	17-0450-01
Cycloheximide	Fluka Aldrich Sigma	C7698	Toxic
ySP9			W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus
pSP34			pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus
Material
Microscope	Nikon	Ti-Eclipse
Microscope control software	Micro-manager	Ver 1.4.11
Incubation chamber	LIS	The Box
Fluorescence light source	Lumencor	SpectraX
Camera	Hamamatsu	Flash 4.0
Flow cytometer	BD	FACS calibur
Sonicator bath	Telesonic	TUC-150
8-well-slide	Thermo Lab-tek	155409
96-well-plate	Matrical bioscience	MGB096-1-2-LG
FACS tube	BD Falcon	352054