Twee aanvullende methoden op basis van flowcytometrie en microscopie gepresenteerd die de kwantificering van de enkele cel, de dynamiek van genexpressie geïnduceerd door de activering van MAPK route in gist mogelijk.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Temporele Kwantificering van MAPK geïnduceerde expressie in Single gistcellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De kwantificering van genexpressie op het eencellige niveau onthult nieuwe regulerende mechanismen verduisterd in de metingen uitgevoerd op populatieniveau. Twee methoden op basis van microscopie en flowcytometrie worden aangetoond hoe dergelijke gegevens kunnen worden verkregen. De expressie van een fluorescerende reporter geïnduceerd na activering van de hoge osmolariteit glycerol MAPK route in gist wordt gebruikt als een voorbeeld. De specifieke voordelen van elke methode worden gemarkeerd. Flowcytometrie meet een groot aantal cellen (10.000) en een directe maat voor de dynamiek van eiwitexpressie onafhankelijk van de langzame rijping kinetiek van het fluorescerende eiwit. Beeldvorming van levende cellen door microscopie is daarentegen beperkt tot het meten van de gerijpte vorm van de reporter in minder cellen. Echter, de datasets gegenereerd door deze techniek zeer rijk dankzij de combinatie van meerdere reporters en de ruimtelijke en temporele informatieverkregen van individuele cellen. De combinatie van deze twee meetmethoden kunnen nieuwe inzichten in de regulatie van eiwitexpressie leveren door signaalwegen.
Inleiding
Signalering via transductie cascades vaak culmineert in de expressie van eiwitten. De karakterisering van deze expressieprofiel is een belangrijk element in het begrijpen van de functie van biologische wegen. De identificatie van het spectrum van up-gereguleerde eiwitten en de dynamiek van hun activering kan worden bereikt door verschillende technieken, zoals micro-arrays, Northern blots en Western-blots 1-3. Echter, deze technieken gemiddelde van de respons van een gehele celpopulatie. De fijne regeling van de expressie van eiwitten te begrijpen, is het wenselijk om metingen te verzamelen op enkele cel. Idealiter zouden deze metingen ook kwantitatieve geg....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Microscopie Metingen
- Inoculeer 5 ml synthetisch medium met gist.
- Groeien cellen bij 30 ° C gedurende de nacht.
- Meet de OD 600 van de overnacht cultuur de volgende ochtend.
- Verdunnen overnacht cultuur in 5 ml synthetisch medium om OD600 0,05.
- Groeien de verdunde cultuur bij 30 ° C gedurende ten minste 4 uur.
- Bereid 3-voudig geconcentreerd (0,6 M) NaCl-oplossing in synthetisch medium.
- Bereid een 1 mg / ml oplossing van Concanavaline A (ConA) in PBS.
- Het filtraat -200 pl ConA oplossing in de put dia.
- Laat staan voor 30 minuten.
- Verwijder ConA o....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Microscopie
Gist cellen die de expressie reporter p STL1-qV (ySP9 7) zijn bevestigd aan de bodem van de put-glijbaan en onder de microscoop geplaatst. De cellen werden gestimuleerd door toevoeging van stress medium direct in de put tijdens de opnamesessie. Dit stelt ons in staat om een paar beelden van de cellen te verwerven voor pathway inductie en volg hun lot na de stimulatie. In het onderhavige geval werden de cellen gevolgd ~ 2 uur met een tijdsinterval van 10 minuten.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Microscopie
De behandeling van het goed met ConA is een essentiële stap voor een goede beeldvorming van de cellen te waarborgen. Omdat ConA is slecht oplosbaar in PBS (5 mg / ml), het filtratieproces kan de verwijdering van grote aggregaten die in de ongefilterde oplossing zijn en storen de beeldvorming. Cellen hechten relatief sterk aan het behandelde oppervlak en de toevoeging van de inducerende oplossing niet de lokalisatie van de cellen te verstoren, waardoor een continu volgen voor en na d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Dankbetuigingen
De auteurs danken Matthias Peter en zijn groep aan het Instituut voor Biochemie aan de ETH in Zürich, waar deze methoden zijn ontwikkeld. Dit werk werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagent | |||
| Yeast Nitrogen Base | ForMedium | CYN6202 | |
| CSM amino-acid mix | ForMedium | DCS0011 | |
| Concanavalin A | GE Healthcare | 17-0450-01 | |
| Cycloheximide | Fluka Aldrich Sigma | C7698 | Toxisch |
| ySP9 | W303Mata leu2::LEU2-pSTL1-quadrupleV enus | ||
| pSP34 | pRS305 pSTL1 (-800 -0) - quadruple V enus | ||
| Materiaal | |||
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | |
| Microscope control software | Micro-manager | Ver 1.4.11 | |
| Incubatiekamer | LIS | The Box | |
| Fluorescentie lichtbron | Lumencor | SpectraX | |
| Camera | Hamamatsu | Flash 4.0 | |
| Flow cytometer | BD | FACS calibur | |
| Sonicator bad | Telesonic | TUC-150 | |
| 8-well-slide | Thermo Lab-tek | 155409 | |
| 96-well-plate | Matrical bioscience | MGB096-1-2-LG | |
| FACS buis | BD Falcon | 352054 |
Referenties
- Gasch, A. P., Spellman, P. T., et al. Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes. Molecular biology of the cell. 11 (12), 4241-4257 (2000).
- de Nadal, E., Zapater, M., Alepuz, P. M., Sumoy, L., Mas, G., Posas, F.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
