De zebravis, een kleine tropische vissen, is uitgegroeid tot een populair model voor het bestuderen van gen-functie tijdens gewervelde ontwikkeling en ziekte. De ruimtelijke en temporele expressie van de doelwitgenen worden bepaald In situ Hybridisatie. Onze verbeterde protocol maakt de detectie van lage overvloedige transcripten met lage niet-specifieke achtergrondsignaal.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit artikel richt zich op de hele-mount in situ hybridisatie (WISH) van zebravis embryo's. De WISH-technologie vergemakkelijkt de beoordeling van genexpressie, zowel in termen van weefsel distributie en het ontwikkelingsstadium. Protocollen worden beschreven voor het gebruik van WISH van zebravis embryo's met behulp van antisense-RNA-probes gelabeld met digoxigenine. Probes worden gegenereerd door het opnemen van digoxigenine gekoppelde nucleotiden door in vitro transcriptie van genen sjablonen die gekloond zijn en gelineariseerd. De chorions van geoogst op bepaalde ontwikkelingsstadia embryo's worden vóór incubatie met specifieke probes verwijderd. Na een wassen procedure om de overmaat probe te verwijderen, worden embryo geïncubeerd met anti-digoxigenine antilichaam geconjugeerd met alkalische fosfatase. Door toepassing van een chromogeen substraat voor alkalische fosfatase, kan genexpressie worden bepaald. Afhankelijk van het niveau van genexpressie de gehele procedure kan worden voltooid binnen 2-3 dagen.
Inleiding
De zebravis (Danio rerio) heeft zich ontpopt als een krachtige diermodel voor de studie van gewervelde ontwikkeling, ziekte, gedrag, en in-drug screening 1-3. Zebravis embryo's worden verkregen in grote aantallen uit een kruising. Bevruchting en ontwikkeling plaatsvindt ex utero en het optisch heldere embryo's ontwikkelen zich snel. Kritische ontwikkelingsstoornissen gebeurtenissen zich voordoen tijdens de eerste 48 uur na de bevruchting (HPF). Dit omvat het voorkomen van orgaan primordia en de start van cytodifferentiation. Knockdown of over-expressie van eiwitten kan worden bereikt door micro-injectie van embryo's met antise....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Whole-mount in situ hybridisatie van zebravis embryo's
1.1 Voorbereiding van de embryo's
- Verzamel embryo's in de gewenste ontwikkelingsstadia. Zie Kimmel et al.. 5 voor embryonaal stadium beschrijving.
- Verwijder chorions handmatig met behulp van een pincet (Dumont Horlogemakers Pincet geen. 5).
- Fix embryo in een 4% oplossing van paraformaldehyde (PFA) bereid in PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing) gedurende een nacht bij 4 ° C.
- Wassen met PBS embryo tenminste 3x gedurende 5 min elk bij kamertemperatuur.
- WINKEL embryo in....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van het protocol met 50 embryo's per mand (per gen / per experimentele conditie) het expressiepatroon van dat gen kan in een experiment worden bereikt. Bijna alle embryo's vertonen gelijkaardige expressiepatronen van een bepaald gen. Representatieve voorbeelden van de in situ hybridisatie kleuring wordt getoond in figuren 3-6.
Zowel de sense en anti-sense riboprobes werden gesynthetiseerd uit het cDNA dat overeenkomt met PC5.1, PC5.2 6,.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We hebben betere methoden ontwikkeld om RNA te visualiseren met een hoge resolutie. De in situ hybridisatie procedures worden uitgevoerd met behulp van eenvoudige maat gemaakte manden met poreuze bodems (Figuur 1). Embryo's worden verwerkt met RNase-vrije oplossing in 6-well platen bij kamertemperatuur onder steriele omstandigheden.
Om scheiden embryo manden zijn gemaakt van verschillende gekleurde Eppendorf tubes. Manden met of zonder velg worden gebruikt voor .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Taq Polymerase | Invitrogen | 10342053 | |
| TopoTA Cloning Kit- Dual Promoter pCRII-TOPO | Invitrogen | K4650-01 | |
| HQ Mini Plasmid Purification Kit | Invitrogen | K2100-01 | |
| Agarose | Roche | 11 685 660 001 | |
| Not1 and HindIII Restriction Enzymes | Invitrogen | 15441-025, 15207-012 | |
| Buffer Saturated Phenol, ultrapure | Invitrogen | 15513039 | Bewaar bij 4 °C. Irriterend voor ogen, huid en luchtwegen en vermoedelijke carcinogeen. Wees voorzichtig bij gebruik. |
| Chloroform | Fisher | C607-1 | Toxisch en vermoedelijke carcinogeen. Werk onder afzuigkap. |
| RNase-free DNAse I | Roche | 4716728001 | Maak kleine aliquoten en bewaar bij -20°C. |
| DIG-RNA Labeling Mix with Sp6, T7 and T3 RNA Polymerase | Roche | 11277073910 | |
| RNase Inhibitor | Roche | 10777-019 | |
| 3.0 M Sodium Acetate (pH 5.5) | Fisher | 50-751-7355 | |
| 100% Ethanol | Commerciële alcoholen | ||
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | Sigma | 40718-25ML | DEPC is een irriterend voor ogen, huid en luchtwegen. Vermijd contact met huid en ogen. Gebruik veiligheidsbril, handschoenen en masker. |
| NaOH | Fisher | SS255-1 | |
| EDTA 0.5 M (pH 8.0) | Fisher | 50-751-7404 | |
| Instant Ocean Salt | Aquarium Systems | N/A | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher | FL-03-0900 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | P6148-1KG | Bereid en bewaar bij -20°C als 40 ml aliquoten voor later gebruik. PFA is giftig. Gebruik veiligheidsbril, handschoenen en stofmasker. |
| Phenylthiocarbomide (PTC) | Sigma | P7629-25G | PTC is zeer giftig. Gebruik veiligheidsbril, handschoenen en stofmasker. |
| Methanol | Fisher | A947-4 | |
| Dumont (klokkenmaker’s) Forceps patroon nr. 5 | Fine Science Tools | ||
| Six-well Cell Culture Cluster | Sarstedt | 83.1839 | |
| Mandjes zijn gemaakt van nylon gaas en Eppendorf buisjes | In-house voorbereiding | Om de mandjes te maken, snijdt u Eppendorf buisjes (1,5 ml) met of zonder rand om het kegelvormige uiteinde te verwijderen. Snijd nylon gaas in kleine stukken die overeenkomen met de grootte van de gesneden uiteinden van de Eppendorf buisjes. Plaats buisjes met het nylon gaas dat het gesneden uiteinde bedekt op een elektrische hot plate totdat zowel het buisje als het nylon gaas aan elkaar plakken (uitvoeren in afzuigkap). Snijd het overtollige gaas van de mandjes af en bewaar ze in 100% methanol tot gebruik. | |
| Polyoxyethyleensorbitaan Monolauuraat (Tween 20) | Sigma | P1379-500ML | |
| Proteinase K | Fermentas | EO0491 | |
| Azetyl Anhydride | Sigma | 242845 | |
| Triethanolamine | Sigma | 90279-100ML | |
| Formamide, hoge zuiverheidsgraad | Sigma | F9037 | |
| AG501-X8 Resin | Bio Rad | 142-6424 | |
| Citrate monohydraat | Sigma | C0706-500G | |
| Heparine Sodium Salt | Sigma | H3393-25KU | |
| Saline-natrium Citraat Buffer (SSC) | Sigma | S6639 | |
| tRNA uit bakkersgist type X | Sigma | R5636-1ML | |
| NaCl | Fisher | S640-500 | |
| Tris-HCl | Fisher | BP153-1 | |
| MgCl2 | Fisher | S25403 | |
| Levamisol Hydrochloride | Sigma | 31742 | |
| N,N-Dimethylformamide anhydrous (DMF) | Sigma | 227056 | Irritante, giftige, brandbare en vermoedelijke teratogeen. Gebruik met de juiste veiligheidsuitrusting inclusief handschoenen en veiligheidsbril. |
| 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl fosfaat (BCIP) | Sigma | N6639 | Bescherm deze oplossing tegen licht. |
| Nitroblue tetrazolium (NBT) | Sigma | 840W | Bescherm deze oplossing tegen licht. |
| Albumine uit runderserum, gezuiverde fractie V (BSA) | Sigma | A8806 | |
| Schapen Anti-digoxigenine-AP Fab Fragmenten | Roche | 1093274910 | |
| Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
| 96-well cell culture platen | Sarstedt | 83.1835 | |
| Tg(mnx1:GFP)ml2/Tg(hb9:GFP)ml2 | ZIRC | Tg(mnx1:GFP)ml2 | |
| Instant Ocean | Aquarium Systems | N/A |
Referenties
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat. Rev. Genet. 8, 353-367 (2007).
- Wolman, M., Granato, M. Behavioral genetics in larval zebrafish: learning from the young. Dev. Neurobiol. 72, 366-372 (2010).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
