Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Levensvatbaarheid Testen voor Cellen in Cultuur

46.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50645

⸱

20 januari 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Pharmaceutical Sciences, Mylan School of Pharmacy, Duquesne University

In dit artikel

Samenvatting

Therapeutische verbindingen worden vaak eerst in vitro, waarbij de levensvatbaarheid assays onderzocht. Blind celtellingen door een menselijke waarnemer kan zeer gevoelig zijn voor kleine veranderingen in het aantal cellen maar functioneren niet beoordelen. Computergestuurde levensvatbaarheid assays, zoals hier beschreven, kan zowel de structuur en functie op een objectieve manier te beoordelen.

Samenvatting

Handmatige celtellingen op een microscoop een gevoelige manier is om de cellulaire levensvatbaarheid maar tijdrovend en dus duur. Geautomatiseerde levensvatbaarheid testen zijn duur in termen van apparatuur, maar kan sneller en objectiever dan handmatige cel tellingen zijn. Het voorliggende rapport beschrijft het gebruik van drie van dergelijke levensvatbaarheid assays. Twee van deze testen zijn infrarood en men luminescerende. Beide infrarood assays rekenen op een 16 bit Odyssey Imager. Een infrarood-test gebruikt de DRAQ5 vlek voor kernen in combinatie met de Sapphire vlek voor cytosol en wordt gevisualiseerd in de 700 nm kanaal. De andere infrarood-test, een In-Cell westerse, gebruikt antilichamen tegen cytoskeleteiwitten (α-tubuline of microtubuli geassocieerde proteïne 2) en noemt ze in de 800 nm kanaal. De derde levensvatbaarheid assay is een veel gebruikte luminescerende test voor ATP, maar we gebruiken een kwart van de aanbevolen hoeveelheid te besparen op kosten. Deze metingen zijn lineair en correleert met het aantal cells plated, maar verschillen in gevoeligheid. Alle drie de tests te omzeilen tijdrovende microscopie en proeven van de gehele goed, waardoor sampling error verminderen. Tenslotte alle assays gemakkelijk worden voltooid binnen een dag na afloop van het experiment, waardoor grotere aantallen proeven op korte tijdsbestek worden uitgevoerd. Echter, ze ervan uitgaan dat celaantallen evenredig blijven met de signaalsterkte na behandeling, een veronderstelling dat soms niet is voldaan, met name voor cellulaire ATP. Ook als de cellen stijgen of dalen in omvang na behandeling, kan dit signaalsterkte beïnvloeden zonder dat celaantal. We concluderen dat alle levensvatbaarheid assays, waaronder handmatige tellingen, lijdt aan een aantal kanttekeningen, maar dat geautomatiseerde levensvatbaarheid assays zijn goed de initiële investering waard. Met behulp van alle drie de testen levert samen een uitgebreid overzicht van de cellulaire structuur en functie.

Inleiding

De meest voorkomende levensvatbaarheid assay in de biologische wetenschappen impliceert cel-tellingen. Dit blijkt uit een analyse van de top (meest recente) 200 publicaties die verschenen in PubMed met een van de zoekwoorden "in vitro" of "cultuur" op 2013/04/29 en 2013/04/30. Van deze publicaties, gebruikt 23,5% celgetal assays, waaronder handmatige aantal cellen telt, geautomatiseerde aantal cellen telt met beeldbewerkingssoftware, en trypanblauwexclusie. De Live / Dead test werd in 1% van deze publicaties. Het aantal publicaties met de MTT (3 - (4,5-dimethyl-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide) assay voor metabole levensvatbaarheid was 11%. Dit overzicht van de literatuur blijkt ook dat het aantal publicaties met behulp van testen zoals MTT in combinatie met celgetal assays was slechts 3,5%. Ondanks lijkt de trend om een ​​levensvatbaarheid test op zichzelf gebruiken, het beoordelen van cellulaire functie in combinatie met het aantal cellen de beste keuze voor de beoordeling van cellulaire integrity. Celtellingen op zich niet voldoende omdat de resterende cellen niet functioneel of gezond, hoewel zij in de put 1,2 zijn mogelijk. Omgekeerd kan functionele maatregelen zoals ATP verhogen of verlagen in afwezigheid van parallelle veranderingen in het aantal cellen. De ontkoppeling van metabole uitlezingen van aantal cellen suggereert dat ATP en MTT-tests nooit worden gebruikt als enige levensvatbaarheid assay. In dit rapport worden drie levensvatbaarheid testen die zowel cellulaire structuren en metabolische functie enquête beschreven, voor een meer uitgebreid overzicht van cellulaire integriteit dan een test op zich kan veroorloven.

Twee van onze analyses vereisen een infrarood imager die fluorescentie meet in de 700 en 800 nm kanalen. Lage ruis in het infrarode golflengten, wat leidt tot hogere signaal-tot-ruisverhoudingen 3. De Odyssey imager die we gebruiken heeft een 4,5 log dynamisch bereik en een bit-diepte van 16, Translating tot 2 16 of 65.536 tinten van infrarood. Dit in tegenstelling tot 8-bit kleuren weergave, die alleen biedt 2 8 of 256 tinten voor elke golflengte. Zo, 16-bits beeldvorming heeft fijnere resolutie. Opgemerkt zij dat de oorspronkelijke infraroodbeelden vaak pseudocolored groen (800 nm) en rood (700 nm) in gepubliceerde rapporten voor presentatie. Odyssey imagers worden vaak gebruikt voor zowel Western blotting en In-Cell Westerns 4-7. In-Cell Westerns op formaldehyde gefixeerde cellen gebruiken primaire antilichamen tegen een eiwit van interesse en label ze op zijn beurt met infrarood fluorescerende secundaire antilichamen. Deze techniek wordt vooral nuttig voor fosforylering eindpunten 6 zijn. In onze In-Cell Westerns, vlekken wij vaste cellen voor cytoskeleteiwitten α-tubuline of de neuronale microtubuli geassocieerde proteïne 2 (MAP2) in de 800 nm kanaal. Deze eiwitten zijn overvloedig hebben een hoge signaal-ruisverhoudingen leveren. We hebben ook vlekken op ons bord in de 700nm kanaal voor kernen met de DRAQ5 vlek en voor het cytoplasma met de Sapphire vlek. Zowel de cytoskeleteiwitten en de DRAQ5 + Sapphire vlekken weerspiegelen dus cellulaire structuren.

De derde levensvatbaarheid-assay meet metabolische functie en heet "Cell Titer Glo." In deze luciferase gebaseerde test, luminescentie waarden in directe verhouding tot ATP. ATP assays worden vaak gebruikt om levensvatbare cellen te kwantificeren 8-12. Echter, zoals het woord "titer" in de naam van de assay is iets van een verkeerde benaming omdat ATP productie per cel kan veranderen als functie van toxine behandelingen en daarom niet altijd in verhouding tot het aantal cellen 8. ATP niveaus kunnen ook worden beïnvloed door circadiaanse ritmes 13 en door celdeling 14 en celdifferentiatie 15. Niettemin, de ATP-bepaling hier is eenvoudig uit te voeren en nuttig omdat ATP is een robuuste maat voor metabolelevensvatbaarheid 16-21, zo niet het aantal cellen per se. gebruik van deze test om de infrarood te vullen In-Cell levert Westerns daarom een vollediger beeld van de cellulaire integriteit dan iemand test alleen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Een schema van de protocollen wordt geïllustreerd in figuur 1.

1. Cell Plating

Plaat cellen in 96-well platen met verschillende plating dichtheden (figuur 2). Voor lineariteitscontroles op de N2a neuroblastoomcellijn, plaat 2.5k, 5k, 10k en 15k cellen per putje in 3 of 6 putten / groep. Voor lineariteit controles in de rat primaire corticale neuronen, plaat 25k, 50k, 100k en 200k cellen per putje in 3 of 6 putten / groep. Als de cellijnen of primaire cellen van belang er gezond bij verschillende plating dichtheden, plaat op en rond de optimale celdichtheid voor dat type cel.

Opmerking: In de huidige studie werden N2a cellen uitgeplaat in 100 pl media en primaire corticale neuronen in 200 ul media op platen die zijn ontworpen voor een lagere verdamping. Voor gedetailleerde informatie over de mobiele handling, media, sera, antibiotica, en toxine behandelingen, zie Unnithan et al.. voor N2a cells 8 en Posimo et al.. voor de primaire cortex culturen 22.

    1. Herhaal de beplating op een tweede plaat met 96 putjes. Een plaat wordt getest op ATP (Figuur 2A) en de andere met de infrarood assays (figuur 2B). Men kan geen gebruik maken van dezelfde plaat voor de ATP en infrarood testen omdat de cellen geopend moet worden gelyseerd voor intracellulaire ATP-metingen.
    2. Zorg ervoor dat u ten minste 3 extra putten voor achtergrond aftrekken in het infrarood assays plaat op het optimale plating dichtheid (kolom 2; Figuur 2B).
  2. Media zonder cellen of, meer goedkoop, steriel water toe te voegen aan de buitenste putjes in rijen A en H en in de kolommen 1 en 12. Vermijd gebaseerd op gegevens uit putten langs de randen, zoals leefbaarheid vaak lager hier van effecten van media verdamping en temperatuur gradiënten. Dergelijke problemen met microplates worden gewoonlijk randeffecten 23,24. Mis deze putten niet leeg blijvenwant dan rij B en G en de kolommen 2 en 11 lijden aan de rand effect.
    Rand effecten kunnen worden verminderd door het incuberen van een vers gezaaid plaat bij kamertemperatuur in omgevingscondities vóór de overdracht naar de CO 2 incubator 24. Bovendien is een recente studie van Carralot beschrijft een wiskundige correctiemethode voor microtiterplaten met een stuurknuppel 23. Oliver en collega's gebruikten een speciaal ontworpen geforceerde lucht microtitratieplaat incubator om thermische gradiënten 25 te verminderen. Als de rand effect is van groot belang, kan microplaat stabiliteit kamers (bijv. BT & C Incorporated) worden gekocht om een homogene micro-omgeving met een hoge luchtvochtigheid en zelfs temperatuur gradiënten creëren.
  3. Indien meer dan putjes getoond in figuur 1 zijn nodig omdat aanvullende reagens verdunningen of meer platen dichtheden worden getest, gebruik de rand putjes achtergrond aftrek.
  4. Wacht 's nachts voor de bevestigingcellen en test de volgende ochtend zoals hieronder beschreven.

2. Lichtgevende ATP Assay

  1. Volg de aanbevelingen van de celtiter Glo fabrikant voor reconstructie van het substraat met buffer en voor incubatie tijden.
    1. Verwijder 50 of 150 ul media uit de 100 of 200 ul van plating media, respectievelijk. Iets minder dan 50 ul zal achterblijven in de put blijft. Voeg 25 ul van de reagentia (substraat plus buffer) kolommen 2-6 (Figuur 2A) in een 1:02 verdunning.
      Opmerking: Variërend volumes media achtergelaten na verwijdering kunnen verdunnen of concentreren de ATP testreagentia differentieel over putten. Let erop dat het vloeistofniveau in de multichannel pipet tips gelijkwaardig. Meet de resterende vloeistof in geselecteerde putten over de plaat met een pipet onmiddellijk voor het toevoegen van de ATP testreagentia om nauwkeurigheid te garanderen. Als grote variabiliteit bestaat uit gedifferentieerde media Evaporatie over het oppervlak van de plaat, verwijder alle oude media en voeg dezelfde hoeveelheid vers medium of fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) aan alle putjes onmiddellijk vóór toevoeging van ATP assay reagentia. Als de platen lijdt variabele niveaus van verdamping, probeer dan het lage verdamping platen van Costar Corning. In deze platen, de 60 binnenkant putjes getoond in figuur 2 alleen lijden aan een gemiddelde van 0,995 ± 0,41% media verdamping overnacht. Er is dus verwaarloosbaar variabiliteit in media volume op het moment van bepaling.
    2. In de kolommen 7 tot en met 11, rij B tot en met D, verwijder genoeg media om 50 pl achter te laten, zoals hierboven beschreven, en voeg 50 ul van de reagentia in een 1:01 verdunning.
    3. In de kolommen 7 tot 11, rij E tot G, laat cellen in 100 pl medium en voeg 100 ul van reagentia, opnieuw een 1:01 verdunning. Het bedrijf raadt 100 ul van reagentia moeten worden verdund 1:01 in 100 ul van media.
      Opmerking: Omom te besparen op de kosten, is het mogelijk om deze aanbevelingen te snijden zowel in volume als in verdunning. Echter, voordat je dit doet, ervoor zorgen dat het niet de lineariteit en de gevoeligheid van de test doet verminderen.
    4. Zodra een bepaald volume en verdunningsfactor van de reagentia worden bevredigend bevonden, stok met hen in alle volgende experimenten. De criteria voor bevredigende gegevens worden beschreven in de Resultaten.
    5. Ongebruikt gereconstitueerd reagentia kunnen worden ingevroren en gebruikt op een later tijdstip om te besparen op de kosten. Volgens de fabrikant kan gereconstitueerd reagentia worden bewaard bij -20 ° C gedurende 21 weken met ~ 3% verlies van activiteit.
  2. Plaats de plaat op een schudapparaat gedurende 2 minuten of een Tuimelschijfmeter gedurende 10 minuten. Als een deel van de plaat wordt getest op een andere meting en kan niet worden geschud, schud de media eenvoudig op en neer pipetteren alleen in de putjes van belang. Echter, overmatig belletjes die tijdens deze stap verstoren luminescent uitgang.
    1. 10 minuten na toevoeging van de reagentia, overdracht 60 ul van de inhoud ver in witte 96-wells platen. Luminescentie waarden zijn hoger in witte platen dan in helder of zwarte platen, omdat ze licht omhoog naar de detector weerspiegelen.
      Opmerking: In onze ervaring, cellen overleven beter op de lage verdamping, duidelijk Costar platen dan andere platen. Deze specifieke platen worden niet verkocht met witte muren. Ten tweede, de ondoorzichtige wanden en duidelijke bodem platen zijn duurder dan helemaal duidelijk borden. Als men draagt ​​de lichtgevende vloeistof witte platen, kan de witte platen worden gewassen en hergebruikt, besparen op de kosten van het gebruik van nieuwe witte platen voor elk experiment. Het overzetten vloeistof is dus de goedkopere optie op de lange termijn.
    2. Pop luchtbellen vóór het lezen van de plaat met een naald of bij voorkeur met geforceerde lucht uit een plastic overdracht pipet lamp. Lees de plaat op een lichtmeter met een 1 sec integratie tijd (het bedrijf recommends 0,25-1 sec als voldoende integratie tijd). Lees de plaat 10-12 min na toevoeging van ATP bepalingsreagentia. Timing is van cruciaal belang voor de vergelijking tussen de verschillende platen, omdat de lichtgevende signaal is van voorbijgaande aard met een snelle verval snelheid, zoals getoond door Gilbert en collega's 26.
  3. Middel de luminescerende waarden uit de 3 of 6 putjes in elke groep en plot als functie van het aantal cellen in een spreidingsdiagram (zie figuur 3). Aftrekken eerste gemiddelde achtergrond luminescentie waarden van de juiste lege putten (putten 2B - 2G, putten 11B - 11D, en putten 11E - 11G) van elke overeenkomstige gegevenspunt. Er worden drie verschillende groepen per plating dichtheid in dit eerste experiment (Figuur 2A). ATP kan lineair gecorreleerd met dichtheden in een of meer van deze groepen. Ga verder met de hoogste verdunning van de reagentia die nog steeds geeft bevredigende resultaten te besparen op de kosten. Criteria voor bevredigende resultaten beschreven in de Resultaten.
    Opmerking: Met de media die in de onderhavige studie, achtergrondwaarden met deze assay niet hoog en het is mogelijk om de blanco putjes slaan. Echter, de fabrikant Promega rapporteert verschillen in luminescentie met andere cultuur media. De huidige studie maakt gebruik Hyclone Foetale Clone III, een synthetische versie van foetaal bovine serum voor N2a cellen en runderkalfserum voor primaire corticale culturen. Volgens de fabrikant kalfsserum af fluorescentie waarden maar gevoeligheid van de test niet afneemt. Niettemin, als dit van groot belang, verdund ATP testreagentia in PBS in plaats van de media bij de assay.
    1. Als de cellen blijken ongelijk nachts groeien over kolommen, probeer het testen van hen binnen 6 uur in de platen. Echter, in gedachten houden dat de dichtheid op de gebruikelijke tijd van de test (bijvoorbeeld 24 uur na de behandeling) is de dichtheid waaraan lineariteit moet worden bereikt.

3. Infrared Testen

  1. De ochtend na plating, bevestig de cellen in de tweede plaat bij kamertemperatuur in een zuurkast. Zorg ervoor dat u handschoenen te dragen voor deze stap en gooi de fixeermiddel als chemisch afval omdat formaldehyde is een kankerverwekkende stof. Voeg 4% formaldehyde en 4% sucrose in 0,1 M fosfaatbuffer bij de bestaande media in een 1:01 verdunning. De media kunnen ook uitgeschakeld worden gewassen met PBS voor bevestiging in volle sterkte fixeermiddel. Ofwel techniek werkt goed.
    1. Incubeer in fixatief gedurende 20 minuten en verwijder daarna de fixerende en was 3x in 200 ul PBS.
  2. Bewaar de plaat in PBS met 0,2% natriumazide bij 4 ° C indien de test niet zal plaatsvinden op dezelfde dag. Anders gaat de assay en zet de cellen in blokkerende oplossing om niet-specifieke binding van antilichamen te minimaliseren.
    1. Verdun de vis serum Odyssey block 1:01 in PBS en voeg 0,3% Triton X-100 als een cel permeabilisator. Maak genoeg blokkerende oplossing en als primaire en secundaire Antibody oplossingen voor 35 gl kunnen worden gepipetteerd in elk putje. Echter, als er veel belletjes tijdens pipetteren worden waargenomen, merken> 50 ul per put, anders bereikt de luchtbellen naar beneden in de cellen en blok antilichamen binden. Overmatige zeep bubbels verschijnt als een ongekleurde ronde plek in het midden van de put. Probeer de pipetteren aanpassen indien dit zich voordoet.
    2. Incubeer in deze blokkerende oplossing gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur.
      Opmerking: 5% bovine serum albumine of normale sera van dezelfde soort als het secundaire antilichaam kan ook worden gebruikt als oplossingen blokkeren om te besparen op de kosten van de vis serum blok. Blokkeren oplossingen kunnen prestaties van het antilichaam beïnvloeden. Dus de optimale blok voor elk antilichaam best empirisch bepaald.
      Opmerking: Sommige onderzoekers plaatsen In-Cell westerse platen op shakers tijdens incubatie. Dit is echter niet noodzakelijk.
  3. Maak de primaire antilichamen 1:10.000 verdunning van anti-α-tubuline(Monoklonale, tabel 1) en 1:2000 verdunning van anti-MAP2 (monoklonaal, tabel 1). Deze antilichamen zijn specifiek voor de eiwitten van belang in deze cellulaire modellen, specificiteit is essentieel voor immunocytochemische kleuring.
    Opmerking: MAP2 is een merker voor neuronen en is geschikt voor gemengde neuronale / gliale culturen. De postnatale culturen hier getoonde bevatten ook een aantal glia (~ 25%), omdat astrocyten verschijnen eerst op embryonale dag 18, met hun nummers een piek in de vroege neonatale periode 27,28. Men kan geen onderscheid maken tussen astrocyten en neuronen in de ATP en DRAQ5 + Sapphire assays. Om neuronen en astrocyten gescheiden, gelijktijdig gebruik MAP2 en GFAP kleuring in de 800 en 700 nm kanalen, zoals beschreven door Mullett en collega 4,29, weglaten DRAQ5 + Sapphire. Echter, als alle cellen in de cultuur wensen te worden beoordeeld, gebruik dan een pan-cellulaire marker zoals α-tubuline, β-actine, of GAPDH.
    Opmerking: Deze verdunningen werden geoptimaliseerd voor de N2a en primaire corticale cellen en niet generaliseren naar elk model. Daarom proberen ten minste twee primaire antilichaam verdunningen, een aan de linkerhelft van de plaat en een aan de rechterhelft (zie figuur 2B). Als alternatief, probeer dan 3-4 verdunningen van primaire antilichamen op 3 putten elk. Bijvoorbeeld kan de aanbevolen verdunning van het antilichaam inlegvel worden geflankeerd met tweeledig veranderingen. Met andere woorden, als de aanbevolen verdunning voor immunocytochemie 1:500, 1:250 en ook proberen 1:1000 verdunningsfactoren.
    1. Verdunnen antilichamen in 01:01 Odyssey block: PBS en voeg 0,3% Triton-X. Om te besparen op de kosten, proberen om de antilichamen in de blokkerende oplossing werd aangebracht op de cellen in stap 3.2.1 door het verwijderen van deze oplossing aan het eind van de incubatie. Houd de cellen in PBS terwijl je dit doet, ze moeten niet uitdrogen.
    2. Incubeer in primaire antilichamen of 1-2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. Voor zwak bINDENDE antilichamen en eiwitten die niet in overvloed zijn, kan 's nachts incubaties helpen verhogen signaal.
      Opmerking: Laat minstens 3 putten in het blokkeren oplossing voor achtergrond aftrekken bij elke secundaire concentratie antilichaam (putten 2B-2D en putten 2E-2G in figuur 2B). Mis deze putten niet helemaal bloot aan primaire antilichaam. Zij onthullen de mate van specifieke binding van het secundaire antilichaam en zijn bruikbaar voor berekeningen van signaal-ruisverhoudingen. Als er een bezorgdheid dat de secundaire antilichamen leidt tot hoge specifieke binding, ook controleputjes die niet zijn blootgesteld aan de primaire of secundaire antilichaam maar ontvangen hetzelfde aantal wasbeurten. Het verschil tussen deze putten en "secundaire enige" putten onthullen de mate van specifieke binding door het secundaire antilichaam alleen. In onze test op de muis N2a cellen, signaalintensiteit met anti-muis secundair antilichaam alleen was 0,557 ± 0,032, signaal met anti-konijnsecundaire antilichaam alleen was 0,533 ± 0,041, signaleren zonder secundaire antilichaam werd 0.357 ± 0.003 en signaal met primaire en secundaire antilichamen was 11,867 ± 0,911. We hebben dus niet waargenomen hoge specifieke binding zelfs bij gebruik van anti-muis secundaire antilichamen op muizencellen. Er zijn verschillende fabrikant voor infrarood secundaire antilichamen, adviseren wij alleen het kopen van de zeer cross-geadsorbeerd Ones. Merk op dat de concentratie van secundaire IgG antilichamen kunnen variëren afhankelijk van de bron.
  4. Afwassen primaire antilichamen met 3 wasbeurten van 200 ul PBS per well, 10 minuten elk. Primaire antilichamen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor een paar weken in 0,2% natrium azide en hergebruikt tot kleine vlekken van vuil worden duidelijk wanneer de oplossingen worden tegengehouden aan het licht. Dit wordt alleen gedaan om te besparen op de kosten. Als de kosten is geen probleem, maak verse antilichamen voor elk gebruik.
  5. Verdun de secundaire antilichaam door 1:1000 of 1:2000 in 01:01 Odyssey block: PBS met 0,3% Triton-X (Figuur 2B). Voeg de 1:1000 verdunning tot de bovenste helft van de plaat en 1:2000 de onderste helft van de plaat. Deze concentraties kunnen verder worden verlaagd om te besparen op de kosten, maar vraagt ​​lineariteit voor het plegen van dit.
    Opmerking: Zorg ervoor dat u de juiste secundaire antilichaam oplossing voor de achtergrond aftrekken putten (kolom 2 in figuur 2B) toe te voegen.
    1. Als een tweede eiwit wordt getest in plaats van DRAQ5 + Sapphire, label cellen voor α-tubuline of MAP2 aan 700 nm geit anti-muis IgG en de tweede eiwit in het 800 nm kanaal met primaire antilichamen van een andere muis species. De 800 nm kanaal heeft minder achtergrond dan de 700 nm kanaal en moet worden gereserveerd voor de meest kritische eiwit van belang.
    2. Incubeer in secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een lade tegen licht.
  6. Afwassen secundaire antilichamen met 3 wasbeurten van 200 ul PBS per well, 10 minuten elk.
  7. Maak de DRAQ5 + Sapphire oplossingen. In de linkerhelft van de plaat verdund DRAQ5 1:10.000 (0,5 uM uiteindelijke concentratie) en Sapphire 1:1000 in PBS met 0,3% Triton-X (kolommen 3 - 6, Figuur 2B). Voor de rechter helft van de plaat, verdunnen DRAQ5 1:20.000 (0,25 uM) en Sapphire 1:2000 (kolommen 7-10; Figuur 2B).
    Opmerking: DRAQ5 gebruikt worden verkocht tegen een 1 mM voorraad in plaats van een 5 mM voorraad. Sommige eerder gepubliceerde rapporten daarom gebruikt 1:4000 of 1:2000 verdunningen van DRAQ5 8.
    1. Om te besparen op de kosten, wanneer twee platen tegelijk worden getest, kan dezelfde DRAQ5 + Sapphire oplossingen worden gebruikt op twee platen in volgorde pipetteren het uit de eerste plaat en toevoegen aan de tweede. Als dezelfde oplossingen tweemaal op deze wijze wordt gebruikt, gebruik ze binnen een dag. Verdund DRAQ5 + Sapphire oplossingen kunnen niet worden opgeslagen bij 4 ° C of voor later gebruik bevroren.
    2. Incubeer in deze oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur weg from licht. Als de tijd kort is en de DRAQ5 + Sapphire oplossingen niet toepasbaar andere platen met verschillende secundaire, voeg deze vlekken aan het secundaire antilichaam oplossing in stap 3.5 en incubeer gedurende 1 uur.
      Opmerking: DRAQ5 + Sapphire oplossing toevoegen achtergrond aftrek putjes (kolom 2 in figuur 2B) als deze putten niet worden gekleurd in het 700 nm kanaal.
  8. Was de plaat 3x met 200 ul PBS per well gedurende 10 minuten elk. Doe 0,2% natriumazide in PBS laatste wassing als de plaat zal worden gekleurd met andere zichtbare bereik secundaire antilichamen na de infrarood imaging voltooid.
  9. Scan de plaat op een Odyssey Imager. Begin met het scannen van de platen bij intensiteit 5 en 169 mm resolutie. Ofwel "gemiddelde kwaliteit" of instellingen "lage kwaliteit" zijn voldoende. Het bedrijf geen gedetailleerde excitatie / emissie filter informatie vrij te geven. De emissiefilters ongeveer 20 nm breed zijn gecentreerd rond 720 en 820 nm, volgens de fabrikant.
    Opmerking: Het is mogelijk om platen te scannen terwijl het nog nat als onderzoekers wenst te blijven om ze te kleuren met andere markers. Echter, het bedrijf stelt in zijn online protocol dat droge platen resulteren in minder well-to-well signaal verspreiden. Als je ze allebei nat en droog vervolgens de gegevens te vergelijken scannen, moet u alle de PBS uit de put te verwijderen omdat de resterende zouten na verdamping kan leiden tot hoge achtergrond fluorescentie langs de randen.
    1. De Odyssey Imager scant en door de onderkant van de plaat. Platen van verschillende fabrikanten kunnen verschillende offsets aandacht vereisen vanwege de bodem van de putjes kunnen variëren in de dikte en diepte in de plaat. Probeer te scannen op andere focus offsets en zien waar de hoogste signaal-ruisverhouding en helderste (meest in beeld) signaal wordt bereikt: 2,5 mm, 3,0 mm, 3,5 mm, 4,0 mm. Probeer ook om de diepte van de put te meten van de bodem van een plaat met een liniaal om de Findin bevestigengs op de Odyssee. Vergeet niet dat het plastic in de bodem van de put extra hoogte kan toevoegen liniaalmaateenheden. De Costar platen gebruikt in de onderhavige studie vereisen een focus offset van 4,0 mm.
    2. Gebruik de In-Cell westerse functie in de software om de juiste maat raster te plaatsen op het beeld van de plaat en de gegevens te exporteren naar Microsoft Excel. Onderzoek de "geïntegreerde intensiteit" waarden van dezelfde putjes in andere focus offsets voor de hoogste fluorescentie waarden vinden. De focus offset die de hoogste signaal-ruisverhouding (signaal immuun-versus putjes "geen primaire negatieve controle" putjes) levert is een om hierna te kiezen.
    3. Zodra men de focus offset wordt besloten, opnieuw scannen in kleinere stappen. Als bijvoorbeeld de helderste signaal was 3,5 en 4,0 mm, probeer scannen met 3,6, 3,7, 3,8, en 3,9 mm en of er verdere verbetering van de signaalsterkte. Als de focus offset is fout, signaal intensiteiten over de 12 kolommen op een lege platen (wanneer alle kolommen gelijk signaal zou moeten hebben) zal verschijnen als een U-vormige curve in plaats van een vlakke lijn. Als dit nog steeds een probleem met plastic borden, probeer met glazen bodem platen.
  10. Trek de gemiddelde van de geïntegreerde intensiteiten op de achtergrond aftrekking putjes (Figuur 2B, putten 2B - 2D of boorputten 2E - 2G) van elke overeenkomstige gegevenspunt in de 700 en 800 nm kanalen. Gemiddeld dan de geïntegreerde signaal intensiteiten voor elke groep putten. Plot de gegevens als een puntenwolk tegen celdichtheid (zie figuur 3).
    1. Vergelijk de resultaten van de twee verschillende verdunningen van primaire en secundaire antilichamen en de resultaten van de twee verschillende verdunningen van DRAQ5 + Sapphire om zich te vestigen op een verdunning stuk voor de volgende experimenten. Als lineariteit niet bereikt, probeer scannen met een verschillende intensiteit. Opnieuw te scannen met intensiteiten 3 en 7 in plaats van 5 en opnieuw analyseren van de gegevens. Als de gegevens te verbeteren op een van deze intensiteiten maarzijn nog steeds niet bevredigend is, opnieuw scannen in stappen rond die intensiteit.
    2. Wees voorzichtig niet te beelden waar de software toont witte vlekken in de putten te analyseren; die plekken betekenen verzadigde signaal buiten het bereik van de imager. Scan met een lagere intensiteit als dit gebeurt.
    3. Als lineariteit niet bereikt, ook proberen om de cellen vast te stellen binnen 6 uur in de platen om problemen groeien of sterven ongelijk in verschillende kolommen overnacht. Probeer ook verschillende plating dichtheden, het scannen van verschillende intensiteiten, verdere optimalisaties van reagens dilutiefactoren, glazen bodem platen, DRAQ5 door zich als een alleen-kern vlek, of anders dan anti-α-tubuline of anti-MAP2 verschillende antilichamen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het snelheidsbeperkende factor in deze experimenten is de infrarood kleuring, de ATP test relatief korte duur. Voor de infrarood assays, verwachten we dat acht 96-well platen kan worden gekleurd en gescand binnen een dag door maar liefst twee partijen van vier borden elk (zie figuur 1). Deze schatting gaat uit 20 min van fixatie, 30 min. van het wassen, 30 min van het blokkeren, 2 hr primaire antilichaam incubatie gevolgd door 30 min wasbeurten, 1 uur secundair antilichaam incubatie gevolgd door 30 min ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Wij hebben gevonden dat signaalsterkte in alle drie levensvatbaarheid assays lineair en gecorreleerd met plating dichtheid. Echter, niet alle testen zijn even gevoelig voor 2-voudige en 1,5-voudige veranderingen in uitplaatdichtheid. Voor N2a cellen, de infrarood testen zijn minder gevoelig dan de ATP-bepaling, met name bij lagere dichtheden plating. Hoewel de infrarood testen zijn minder gevoelig dan ATP, de DRAQ5 + Sapphire assays en de α-tubuline assays zijn goed overeen doordat zij onthullen de zeer beschermend effe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen van de auteurs hebben eventuele conflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij erkennen Juliann Jaumotte voor het idee van besparing op de volumes van reagentia in de ATP-test. Wij zijn zeer dankbaar voor de uitstekende administratieve ondersteuning van Maria Caruso, Deb Willson, en Jackie Farrer en de Mylan School of Pharmacy voor het verstrekken van financiële steun voor deze studies. Dank ook aan de Hunkele gevreesde ziekten Foundation en de Parkinson en Movement Disorders Foundation voor hun financiële ondersteuning van de primaire neuronale studies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Cell Titer GloPromegaG7572Koop in hoeveelheden van 100 ml en verdeel in aliquoten, in plaats van de duurdere hoeveelheid van 10 ml te kopen. Gereconstitueerde, ongebruikte reagentia kunnen opnieuw worden ingevroren bij -20 °C gedurende minimaal 21 weken
18% FormalinThermo-Shandon9990244Door dit fixeermiddel te kopen, vermijdt u het afwegen van formaldehydepoeders en het koken van de oplossing; de blootstelling aan dampen wordt hierdoor geminimaliseerd
SucroseSigma-AldrichS0389Het is niet essentieel om dit toe te voegen aan formaldehydeoplossingen, maar het verbetert het uiterlijk van de gefixeerde cellen
Odyssey BlockLI-COR927-40003Dit visserum kan in bulk worden gekocht en bevroren bij -20 °C voor langdurig gebruik
Triton-X 100Sigma-Aldrich21568We bewaren een voorraadoplossing van 10% Triton-X 100 in steriel water bij 4 °C
Natriumfosfaat MonobasischFisherS468Men kan ook PBS-tabletten of 10x PBS-oplossingen kopen, maar deze zijn duurder
Natriumfosfaat DibasischFisherS373Zie hierboven
Natriumazid (250x)Ricca Chemical Company7144.8-16Koop het poeder niet omdat natriumazid zeer giftig is. We bewaren al onze gebruikte antilichamen in 1x natriumazid bij 4 °C totdat ze besmet raken met puin
Muis anti-α-tubulineSigma-AldrichT5168Dit antilichaam is duur maar kan sterk worden verdund en is zeer specifiek
Muis anti-MAP2Sigma-AldrichM9942Dit antilichaam is duur maar is zeer specifiek (een voorwaarde voor In-Cell Westerns)
800 nm Geit anti-muis IgGLI-COR926-32210Andere bedrijven verkopen ook infrarode secundaire antilichamen. Zorg ervoor dat u de sterk geadsorbeerde antilichamen koopt en houd er rekening mee dat concentraties van IgG's kunnen variëren met de bron
DRAQ5BiostatusDR50200Deze verbinding werd vroeger door LI-COR verkocht bij 1 mM
SapphireLI-COR928-40022
LuminometerPerkinElmerVICTOR3 1420 multilabelteller
Odyssey ImagerLI-COR9201-01
Schakelaar/MixerResearch Products International248555

Referenties

  1. Leak, R. K., Liou, A. K., Zigmond, M. J. Effect of sublethal 6-hydroxydopamine on the response to subsequent oxidative stress in dopaminergic cells: evidence for preconditioning. J Neurochem. 99, 1151-1163 (2006).
  2. Ugarte, S. D., Lin, E., Klann, E., Zigmond, M. J., Perez, R. G. Effects of GDNF on 6-OHDA-induced death in a dopaminergic cell line: modulation by inhibitors of PI3 kinase. J. Neurosci. 73, 105-112 (2003).
  3. Patonay, G., Antoine, M. Near-infrared fluorogenic labels: new approach to an old problem. Anal. Chem. 63, (1991).
  4. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 deficiency in astrocytes selectively enhances mitochondrial Complex I inhibitor-induced neurotoxicity. J. Neurochem. 117, 375-387 (2011).
  5. Egorina, E. M., Sovershaev, M. A., Osterud, B. In-cell Western assay: a new approach to visualize tissue factor in human monocytes. J. Thromb. Haemost. 4, 614-620 (2006).
  6. Aguilar, H. N., Zielnik, B., Tracey, C. N., Mitchell, B. F. Quantification of rapid Myosin regulatory light chain phosphorylation using high-throughput in-cell Western assays: comparison to Western immunoblots. PLoS One. 5, (2010).
  7. Jinwal, U. K., Dickey, C. A. Cell-based assays for regulators of tau biology. Methods Mol. Biol. 670, 93-108 (2011).
  8. Unnithan, A. S., Choi, H. J., Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Rescue from a two hit, high-throughput model of neurodegeneration with N-acetyl cysteine. Neurochem. Int. 61, 356-368 (2012).
  9. Hoskins, C., Wang, L., Cheng, W. P., Cuschieri, A. Dilemmas in the reliable estimation of the in-vitro cell viability in magnetic nanoparticle engineering: which tests and what protocols? Nanoscale Res. Lett.. 7, 10-1186 (2012).
  10. Essner, M. D., Javed, A., Eleazer, P. D. Effect of sodium hypochlorite on human pulp cells: an in vitro study. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 112, 662-666 (2011).
  11. Sims, J. T., Plattner, R. MTT assays cannot be utilized to study the effects of STI571/Gleevec on the viability of solid tumor cell lines. Cancer Chemother. Pharmacol. 64, 629-633 (2009).
  12. Petty, R. D., Sutherland, L. A., Hunter, E. M., Cree, I. A. Comparison of MTT and ATP-based assays for the measurement of viable cell. J. Biolumin. Chemilumin. 10, 29-34 (1995).
  13. Womac, A. D., Burkeen, J. F., Neuendorff, N., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Circadian rhythms of extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus cells and cultured astrocytes. Eur. J. Neurosci. 30, 869-876 (2009).
  14. Ataullakhanov, F. I., Vitvitsky, V. M. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci. Rep. 22, 501-511 (2002).
  15. Iglehart, J. D., Silver, D. P. Synthetic lethality--a new direction in cancer-drug development. New Engl. J. Med. 361, 189-191 (2009).
  16. Crouch, S. P., Kozlowski, R., Slater, K. J., Fletcher, J. The use of ATP bioluminescence as a measure of cell proliferation and cytotoxicity. J. Immunol. Methods. 160, 81-88 (1993).
  17. Kangas, L., Gronroos, M., Nieminen, A. L. Bioluminescence of cellular ATP: a new method for evaluating cytotoxic agents in vitro. Med. Biol. 62, 338-343 (1984).
  18. Lundin, A., Hasenson, M., Persson, J., Pousette, A. Estimation of biomass in growing cell lines by adenosine triphosphate assay. Methods Enzymol. 133, 27-42 (1986).
  19. Sevin, B. U., et al. Application of an ATP-bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing. Gynecol. Oncol. 31, 191-204 (1988).
  20. Maehara, Y., Anai, H., Tamada, R., Sugimachi, K. The ATP assay is more sensitive than the succinate dehydrogenase inhibition test for predicting cell viability. Eur. J. Cancer Clin. Oncol. 23, 273-276 (1987).
  21. Andreotti, P. E., et al. Chemosensitivity testing of human tumors using a microplate adenosine triphosphate luminescence assay: clinical correlation for cisplatin resistance of ovarian carcinoma. Cancer Res. 55, 5276-5282 (1995).
  22. Posimo, J. M., Titler, A. M., Choi, H. J., Unnithan, A. S., Leak, R. K. Neocortex and allocortex respond differentially to cellular stress in vitro and aging in vivo. PLoS One. 8, (2013).
  23. Carralot, J. P., et al. A novel specific edge effect correction method for RNA interference screenings. Bioinformatics. 28, 261-268 (2012).
  24. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. J. Biomol. Screen. 8, 566-570 (2003).
  25. Oliver, D. G., Sanders, A. H., Hogg, R. D., Hellman, J. W. Thermal gradients in microtitration plates. Effects on enzyme-linked immunoassay. J. Immunol. Methods. 42, 195-201 (1981).
  26. Gilbert, D. F., et al. A novel multiplex cell viability assay for high-throughput RNAi screening. PLoS One. 6, (2011).
  27. Bayer, S. A., Altman, J. Neocortical Development. , Raven Press. (1991).
  28. Miller, F. D., Gauthier, A. S. Timing is everything: making neurons versus glia in the developing cortex. Neuron. 54, 357-369 (2007).
  29. Mullett, S. J., Hinkle, D. A. DJ-1 knock-down in astrocytes impairs astrocyte-mediated neuroprotection against rotenone. Neurobiol. Dis. 33, 28-36 (2009).
  30. Jiang, Y., et al. N-Acetyl cysteine blunts proteotoxicity in a heat shock protein-dependent manner. Neuroscience. 255, 19-32 (1016).
  31. Madeira, A., et al. Caveolin-1 interacts with alpha-synuclein and mediates toxic actions of cellular alpha-synuclein overexpression. Neurochem. Int. 59, 280-289 (2011).
  32. Fioriti, L., et al. Cytosolic prion protein (PrP) is not toxic in N2a cells and primary neurons expressing pathogenic PrP mutations. J. Biol. Chem. 280, 11320-11328 (2005).
  33. Zhang, L., et al. Proteasome inhibition modulates kinase activation in neural cells: relevance to ubiquitination, ribosomes, and survival. J. Neurosci. Res. 87, 3231-3238 (2009).
  34. Braak, H., et al. Staging of brain pathology related to sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Aging. 24, 197-211 (2003).
  35. Stranahan, A. M., Mattson, M. P. Selective Vulnerability of Neurons in Layer II of the Entorhinal Cortex during Aging and Alzheimer's Disease. Neural Plast. 2010, (2010).
  36. Duyckaerts, C., Delatour, B., Potier, M. C. Classification and basic pathology of Alzheimer disease. Acta Neuropathol. 118, 5-36 (2009).
  37. Chu, C. C., Tranel, D., Damasio, A. R., Van Hoesen, G. W. The autonomic-related cortex: pathology in Alzheimer's disease. Cereb. Cortex. 7, 86-95 (1997).
  38. Braak, H., Del Tredici, K., Bohl, J., Bratzke, H., Braak, E. Pathological changes in the parahippocampal region in select non-Alzheimer's dementias. Ann. N.Y. Acad. Sci. 911, 221-239 (2000).
  39. Braak, H., Rub, U., Schultz, C., Del Tredici, K. Vulnerability of cortical neurons to Alzheimer's and Parkinson's diseases. J. Alzheimers Dis. 9, 35-44 (2006).
  40. Calabrese, E. J. Hormesis is central to toxicology, pharmacology and risk assessment. Hum. Exp. Toxicol. 29, 249-261 (2010).
  41. Giordano, J., Ives, J. A., Jonas, W. B. Hormetic responses in neural systems: consideration, contexts, and caveats. Crit. Rev. Toxicol. 38, 623-627 (2008).
  42. Mattson, M. P. Hormesis defined. Ageing Res. Rev.. 7, 1-7 (2008).
  43. Wang, P., Henning, S. M., Heber, D. Limitations of MTT and MTS-based assays for measurement of antiproliferative activity of green tea polyphenols. PLoS One. 5, (2010).
  44. Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
  45. Titler, A. M., Posimo, J. M., Leak, R. K. Astrocyte plasticity revealed by adaptations to severe proteotoxic stress. Cell Tissue Res. , (2013).
  46. McLaughlin, B., et al. Caspase 3 activation is essential for neuroprotection in preconditioning. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 715-720 (2003).
  47. Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection. Methods Mol. Biol. 536, 499-513 (2009).
  48. Picariello, L., et al. A comparison of methods for the analysis of low abundance proteins in desmoid tumor cells. Anal. Biochem. 354, 205-212 (2006).
  49. Tapias, V., Cannon, J. R., Greenamyre, J. T. Melatonin treatment potentiates neurodegeneration in a rat rotenone Parkinson's disease model. J. Neurosci. Res. 88, 420-427 (2010).
  50. Fenteany, G., Schreiber, S. L. Specific inhibition of the chymotrypsin-like activity of the proteasome induces a bipolar morphology in neuroblastoma cells. Chem. Biol. 3, 905-912 (1996).
  51. Omura, S., et al. Lactacystin, a novel microbial metabolite, induces neuritogenesis of neuroblastoma cells. J. Antibiot. 44, 113-116 (1991).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Cellulaire fitheidATP metinginfraroodbeeldvormingin cell westernDRAQ5 Sapphire kleuringluminescentie assaycytoskeletale eiwittenOdyssey Imagerluminometer
Levensvatbaarheid Testen voor Cellen in Cultuur
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.