Methodenartikel

Een methode voor het kweken van embryonale C. elegans Cellen

DOI:

10.3791/50649

⸱

21 september 2013

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven hier een herziene protocol voor grootschalige kweek van embryonale C. elegans cellen. Embryonale C. elegans cellen gekweekt in vitro gebruik van deze methode, blijken differentiëren en herhalen de expressie van genen in een celspecifieke wijze. Technieken die directe toegang tot de cellen of isolatie van specifieke celtypen van andere weefsels vereisen, kunnen worden toegepast C. elegans gekweekte cellen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans is een krachtig modelsysteem, waarin de genetische en moleculaire technieken zijn eenvoudig toepasbaar. Tot voor kort echter technieken die directe toegang tot cellen en isolatie van specifieke celtypen vereisen, kunnen niet worden toegepast in C. elegans. Deze beperking is te wijten aan het feit dat de weefsels worden ingesloten in een onder druk cuticula die niet gemakkelijk verteerd door behandeling met enzymen en / of reinigingsmiddelen. Gebaseerd op vroege pionierswerk door Laird Bloom, Christensen en collega's 1 ontwikkelde een robuuste methode voor het kweken van C. elegans embryonale cellen op grote schaal. Eieren worden geïsoleerd van zwangere volwassenen door behandeling met bleekwater / NaOH en vervolgens behandeld met chitinase om de eierschalen te verwijderen. Embryonale cellen worden vervolgens gedissocieerd door handmatig pipetteren en uitgeplaat op substraat bedekt glas in serum verrijkte media. Binnen 24 uur van isolatie cellen beginnen te differentiëren door het veranderen van de morfologie en expressie celspecifieke Markers. C. elegans cellen gekweekt met deze methode overleven gedurende 2 weken in vitro en zijn gebruikt voor elektrofysiologische, immunochemische, en imaging analyses als ze zijn gesorteerd en gebruikt voor microarray profilering.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een krachtige modelorganisme voor het onderzoek naar de moleculaire basis van cellulaire functie, differentiatie, en gedrag. Terwijl het genoom, metabolische en biosynthetische routes lijken op gewervelde dieren, de genetische en moleculaire volgzaamheid veel groter 2. Onder de voordelen zijn de grootte en simpele anatomie, de snelle levenscyclus (3 dagen bij 25 ° C), korte levensduur (2 weken) en een groot aantal nakomelingen (> 200). Door zijn tweeslachtig karakter en de korte levenscyclus, moleculaire en genetische manipulaties zijn eenvoudig in C. elegans, inclusief de ontwikkeling van transgene dieren 3,4 en de toepassing van gen knock-down technieken zoals RNA interferentie 5. C. elegans lichaam en eierschaal transparant. Daarom cellen kunnen gemakkelijk worden gevisualiseerd in zowel de volwassenen en het embryo met standaard microscopie. In de afgelopen 40 jaar, de C. elegans gemeenschap is van onschatbare waarde middelen gecreëerd voor C. elegans onderzoek met inbegrip van een grote verzameling van mutanten, knockouts en transgenics, een gedetailleerde beschrijving van de anatomie en ontwikkeling 6,7, inclusief de volledige reconstructie van het zenuwstelsel 8, en een volledig gesequenced genoom die goed geannoteerd en ter beschikking van de hele gemeenschap ( www.wormbase.com ).

Ondanks de vele voordelen, hebben sommige experimentele benaderingen uitdagend in C. elegans. Deze omvatten degenen die toegang vereisen het plasmamembraan van de cellen en isolatie van weefsels of celtypen. Inderdaad C. elegans weefsels worden beperkt binnen haar onder druk hydrostatisch skelet, die niet gemakkelijk wordt verteerd door enzymatische behandeling of detergenten. Aan het einde van de jaren 1990 Miriam Goodman en Janet Richmond pionier methoden voor elektrofysiologische opnames van C. elegansneuronen en spiercellen in situ 9,10. Hoewel deze methoden gaf ons belangrijke inzichten in neuronale en spierfunctie in vivo, ze zijn uitdagend en lage doorvoersnelheid. Alternatieve methoden voor celfunctie studeren in vivo waren ontwikkeld, vooral met name in vivo calcium beeldvorming met behulp van genetisch gecodeerd calcium sensoren zoals GCamP en cameleon 11-13. Deze methoden echter niet het gebruik van farmacologische hulpmiddelen staan ​​omdat ze worden toegepast op intacte levende dieren.

De eerste poging tot het kweken van C. elegans cellen in vitro op grote schaal werd gemaakt door Laird Bloom tijdens de voorbereiding van zijn proefschrift 14. Helaas, moeilijkheden met slechte hechting van de cellen aan het substraat, slechte celdifferentiatie en overleving verhinderde de invoering van deze vroege protocol als een robuust celkweekwerkwijze. In 1995 Edgar en collega's een procedure gepubliceerdtot celdeling en morfogenese onderzoeken door isolatie en de cultuur van een enkele C. elegans embryo 15. Embryonale cellen verkregen door digestie van de eierschalen met een combinatie van enzymatische behandeling en handmatige dissociatie, bleven prolifereren, produceren tot ~ 500 cellen 15. Vervolgens Leung en collega's gekweekt een kleine aantallen blastomeres intestinale morfogenese bestuderen. Zij toonden aan dat een in vitro geïsoleerde E blastomeer geproduceerd gepolariseerde darmcellen die een structuur analoog aan de darmlumen door interactie met elkaar via apicale contactplaatsen 16. Buechner en collega's rapporteerden ook een soortgelijke methode voor het kweken C. elegans embryonale cellen in vitro 17.

Op basis van dit vroege werk, Christensen en collega's ontwikkelden een robuust protocol voor het kweken van embryonale C. elegans cellen in vitro 1. Zetoonde aan dat geïsoleerde C. elegans cellen kunnen differentiëren in verschillende celtypes en de functies die zij bezitten in vivo en het uiten van celspecifieke markers handhaven. Verschillende technieken die uitdagend in vivo kan worden toegepast op geïsoleerde C. elegans embryonale cellen. Deze omvatten elektrofysiologische 1,18 19, weergave en immunochemische technieken 20,21, en ​​isolatie van specifieke celtypes TL-Activated Cell Sorting (FACS) voor de bouw van cel-specifieke cDNA-bibliotheken 22,23. Gene knockdown technieken zoals RNA interferentie (RNAi) kan worden aangebracht op gekweekte C. elegans cellen 1 en een nieuwe metabolische labeling met gebruik Azido-suiker als een instrument voor glycoproteïne ontdekking recent ontwikkeld in vitro gekweekte C. elegans cellen 24.

Tenslotte breidt de celkweek methode matrix of technieken die kunnen worden toegepast op de C. elegans model in een poging om genfunctie ontcijferen in de context van een levend organisme. We beschrijven hier het protocol voor het kweken van C. elegans embryonale cellen in vitro, die grotendeels is gebaseerd op het protocol eerst beschreven door Christiansen en collega 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sterretjes (*) geven aan nieuwe of gewijzigde stappen opzichte Christensen et al. 1.

1. Material Setup

  1. De celkweek procedure vereist grote hoeveelheden eieren geïsoleerd van zwangere volwassenen. Groeien C. elegans 8P op agarplaten geënt met NA22 (beschikbaar via het C. elegans Genetische Consortium - CGC) bacteriën grote hoeveelheden eieren isoleren. In deze platen de hoeveelheid pepton gebruikte 8 keer de hoeveelheid die gewoonlijk wordt gebruikt voor NGM platen. Hoe hoger pepton concentratie ondersteunt de groei van NA22 bacteriën efficiënter, die in strijd zijn OP50-, groeien in dikke lagen.

8P platen recept:

Los 3 g NaCl, 20 g Bacto-pepton, 25 g agar in 1 liter steriel gedestilleerd water en autoclaaf gedurende 30 minuten. Laat het medium afkoelen bij 55 ° C en voeg vervolgens steriel gefiltreerd 1 ml van cholesterol (5 mg / ml in EtOH), 1 ml 1 MgCl2, 1 ml MgSO4 en 25 ml KP buffer (voorraad van 500 ml: 5 g K 2 HPO 4, 30 g KH 2 PO 4, pH 6,00). Giet vloeibaar agar medium in 10 cm petrischalen (25 ml / plaat).

  1. De volgende dag verspreid het gehele oppervlak van elke verrijkt pepton agar plaat met 1 ml van NA22 E. coli nacht gekweekt in 2XYT medium (16 g trypton, 10 g gistextract, 5 g NaCl in 1 liter steriel water, pH 7,0) bij 37 ° C. Deze bacteriën vormen een rijke bron van voedsel met een dikke laag ondersteunen van de groei van grote hoeveelheden zwangere volwassenen vormen. Voeg gezaaide plaatjes gedurende een nacht bij kamertemperatuur om de groei van de bacteriën mogelijk. Het proces kan worden versneld door incubatie bij 37 ° C gedurende 4-5 uur.
  2. Transfer uitgehongerde dieren gezaaid 8P platen. Wassen dieren uit een uitgehongerde NGM plaat met behulp van 5-6 ml M9 buffer of water en voeg 1-2 ml van deze suspensie aan elk 8P plaat.
  3. Laat de groei en vermenigvuldiging van de dieren until de platen worden bevolkt bij samenloop door zwangere volwassenen.
  4. Isoleer het nodig is voor de voorbereiding van C. eieren elegans embryonale cellen, uit zwangere volwassenen met 5-6 ml lysis-oplossing.

Lysis-recept

5 ml Fresh Bleach, 1,25 ml 10 N NaOH en 18,5 ml van de steriele H 2 O. Dit mengsel moet vers voor elk gebruik worden bereid.

  1. Was de eieren geïsoleerd van zwangere volwassenen met behulp van ei-buffer:

Ei buffer recept

118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7,3, osmolariteit 340 mOsm.

  1. Verwijder de eierschaal dat de eieren omgeeft door behandeling met chitinase. Chitinase is een enzym met de hoogste activiteit bij zure pH 25. Los chitinase (Sigma, catalogusnummer. C6137) in ei-buffer pH 6,5 tot een eindconcentratie van 2 mg / ml. Bewaar de chitinase voorraadoplossing bij -20 ° C in 1 ml porties in steriele 15 ml conische buizen. Monsters kunnen worden opgeslagen bij -20 ° C tot enkele maanden.
  2. Groeien C. elegans gekweekte cellen op geautoclaveerd dekglaasjes (12 mm diameter), bedekt met pinda lectine. Los pinda lectine in steriel water (0,5 mg / ml). Peanut lectine oplossing mag niet worden gefilterd of geautoclaveerd. Het hoeft ook niet te worden behandeld met UV-licht. WINKEL 2 ml porties bij -20 ° C maximaal 6 maanden.
  3. Volledige celkweekmedium (500 ml) bevat 500 ml L-15 kweekmedium Gibco, 50 ml foetaal runderserum (hitte geïnactiveerd), 7,7 g sucrose (45 mOsm), 5 ml 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine (2%). De compleet medium wordt vervolgens gefilterd met behulp van een 0,20 um porie filter.

Merk op dat het ei buffer en het kweekmedium hebben osmolariteit van 340 en 345 mOsm respectievelijk. In tegenstelling tot zoogdiercellen C. elegans cellen een relatief hoge osmolariteitdie moet in telling worden gehouden bij het bereiden van oplossingen die in direct contact met het plasmamembraan van de cellen komt. De recepten van deze reagentia werden aangepast om de gewenste osmolariteit, die werd gemeten met een osmometer 1 bereikt. Het is niet noodzakelijk een osmometer gebruiken als deze recepten precies worden gevolgd en zorg wordt gebruikt bij het bereiden van deze reagentia. Echter, men moet een Osmoter gebruiken als andere oplossingen moeten worden voorbereid, waarvan de recepten zijn hier niet vermeld of in een van de publicaties die C. gebruiken elegans gekweekte cellen.

2. Ei Isolatie

  1. Het wordt aanbevolen om te beginnen met minstens vier 8P platen voldoende eieren te verzamelen voor 12 putjes van gekweekte cellen (in 24-well platen).
  2. Voordat u begint met de procedure ontdooien een buis van pinda lectine voorraad oplossing. Plaats geautoclaveerd dekglaasjes onder aan de putten in een 24-wells plaat en voeg 200 ul pinda lectine op de dekglaasjes. Incubeer gedurende 1 uur of Until de cellen zijn klaar om te worden verzilverd. Verwijder volledig de pinda lectine en was de putten eenmaal met 1 ml steriel geautoclaveerd water. Volledige verwijdering van de pinda lectine van de dekglaasjes essentieel voor het vermijden cel klonteren.
  3. Was de zwangere volwassenen uit de agar platen met behulp van steriele geautoclaveerd water. Verzamel de schorsing in twee steriele conische 50 ml tube. Laat de buizen op ijs gedurende 5 minuten tot precipitatie van de wormen mogelijk onderaan de buizen (*). Verwijder het water met een transfer plastic pipet en vervang het met vers steriel geautoclaveerd water. Pellet wormen door tafelblad centrifugatie bij 200 xg (~ 1200 rpm) gedurende 10 minuten (*). Herhaal deze laatste stap tenminste 3.
  4. Breng wormen in een steriele 15 ml conische buis en pellet ze op 200 xg (~ 1200 rpm) gedurende 10 min (*). Gebruik hogere centrifugeersnelheid niet om de bacteriën te voorkomen verzamelen op de bodem van de buis ook. Soms na centrifugeren de wormen niet volledig afgedraaid. After elk wassen en vóór verwijdering van de bovenstaande vloeistof, plaats de buizen gedurende 5 minuten op ijs. In gekoeld water precipiteren wormen naar de bodem van de buis.
  5. Verwijder het water en voeg 5-6 ml lysisoplossing (zie Material ingesteld). Rock de schorsing zachtjes gedurende 5-10 minuten en dan beginnen de controle worm lysis onder de stereomicroscoop om de 2-3 minuten. Een daling van de schorsing kan ook op een dekglaasje worden geplaatst voor een makkelijker inspectie. De incubatietijd varieert afhankelijk van de versheid van het bleekmiddel, koop kleine flesjes van bleekwater en open een nieuwe fles elke maand.
  6. Wanneer ~ 70-80% van de wormen worden gelyseerd (10 min vanaf het begin van de incubatie), stop de lysis reactie door toevoeging van 9 ml ei buffer pH 7,3 (zie Material ingesteld). Centrifugeer de suspensie bij 200 xg (~ 1200 rpm) gedurende 10 minuten. Vanaf dit punt een Bunsen brander, op de bank om nieuwe verontreiniging van de eieren (*) voorkomen.
  7. Verwijder voorzichtig het supernatant met behulp van een steriele plastic overdracht pipet en was het pellet 3-4x met ei buffergeheugen totdat de oplossing helder is. Zorg ervoor dat u de pellet goed te mengen in het ei buffer tijdens elke wasbeurt.
  8. Eieren worden gescheiden van de kadavers met 30% sucrose oplossing. Resuspendeer de pellet in 2 ml steriele ei buffer en voeg 2 ml 60% sucrose-oplossing (voorraad in steriele ei buffer). Meng goed en centrifugeer 20 min bij 200 xg (~ 1200 rpm) (*).
  9. Verwijder voorzichtig de buizen uit de centrifuge. De eieren zweven boven de oplossing. Met behulp van een P1000 pipet en steriele tips, de overdracht van alle eieren in een nieuwe steriele 15 ml conische buis.
  10. Voeg 10 ml steriel ei buffer aan de buis en centrifugeer bij 200 xg (~ 1200 rpm) gedurende 10 minuten. Herhaal het wassen 3 x. Zorg ervoor dat de eieren worden volledig opnieuw gesuspendeerd in het ei buffer tijdens elke wasbeurt.

3. Embryonale cellen Dissociatie

Gaan met de volgende stappen van de procedure onder steriele omstandigheden met behulp van een laminaire stroming kap. Hoewel dierentoga bacteriën op platen, wast en de behandeling met lysis oplossing die bleekmiddel meeste onschadelijk maken indien niet alle bacteriën. Aldus gebruik van een laminaire kap op dit punt van de procedure verhindert nieuwe verontreiniging van het ei suspensie.

  1. Resuspendeer afgedraaid eieren in 1 ml 2 mg / ml chitinase (voorraad in ei-buffer pH 6,5 (*)) en overbrengen naar een nieuwe steriele 15 ml conische buis. Rock de buis gedurende 10-30 minuten bij kamertemperatuur. De exacte incubatietijd verandert al naar gelang de versheid van het enzym en de temperatuur van de kamer en moet daarom worden bepaald voor elke bereiding. Het wordt aanbevolen om te beginnen bewaken de eieren onder een omgekeerde microscoop celcultuur na 10 minuten incubatie. Opmerking: in onze ervaring, lage pH verhoogt de chitinase enzymatische activiteit. Daarom gebruiken we ei buffer bij pH 6,5 tot chitinase (recept hierboven vermeld, waarbij de pH wordt ingesteld op 6,5 met NaOH) opgelost.
  2. Bij ~ 80% van de eierschalen worden verteerd door dechitinase behandeling (Figuren 1 AB), pellet de eieren door centrifugatie bij 900 xg (~ 2500 rpm) gedurende 3 min (*). Met behulp van een P1000 pipet en steriele tips, verwijder voorzichtig de supernatant en voeg 3 ml L-15-medium (*).
  3. Breng de eieren in een 6 cm diameter plaat en zachtjes distantiëren de cellen met behulp van een 10 ml steriele spuit met een 18 G naald. Controleer de dissociatiegraad door een druppel van suspensie in een nieuwe plastic petrischaal en het bekijken onder de microscoop. Geen lucht aan te zuigen in de spuit tijdens deze procedure om schade aan de cellen te voorkomen. Verdere dissociatie tot ~ 80% van de cellen gedissocieerd.
  4. Filter de schorsing met een steriele 5 micrometer Millipore filter. Celsuspensies worden gefilterd om celklonten, onverteerd eitjes en larven te verwijderen. Filter additionele 4-5 ml vers L-15 medium door het filter naar alle cellen herstellen. Niet te veel kracht te gebruiken tijdens de filtratie stap om da te voorkomenmaging het filter en / of de cellen.

4. Kweken Cellen

  1. Pellet de gedissocieerde cellen door centrifugatie bij 900 xg (~ 2500 rpm) gedurende 3 min (*). Met behulp van een P1000 pipet en steriele tips verwijder zorgvuldig alle supernatant. Resuspendeer de gepelleteerde cellen in volledige L-15-medium en plaat 1 ml / putje. De hoeveelheid toegevoegde medium afhankelijk van het aantal gebruikte platen 8P, de samenvloeiing van de wormen op de platen en het soort experimenten die worden uitgevoerd op de cellen. De celdichtheid worden bepaald met een hemocytometer. Voor patch-clamp opnames plating dichtheid van ~ 230.000 cellen / cm 2 is optimaal.
  2. Houd de 24 wells plaat in een plastic Tupperware container met natte papieren handdoeken om verdamping van kweekmedium te voorkomen. Bewaar de container in een bevochtigde incubator bij 20 ° C en lucht.
  3. De cellen zijn meestal klaar voor de experimenten binnen 24 uur wanneer de morfologische differentiatie en uitdrukkelijkeion van GFP markers compleet. Cellen kunnen in kweek worden gehouden binnen 2 weken, maar ze zijn meestal meest gezonde tot 7-9 dagen na uitplaten. Het medium moet eenmaal daags worden vervangen om gezonde cellen te behouden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans gekweekte cellen differentiëren en uitdrukkelijke cel specifieke markers

Christensen en collega's met behulp van trypan blauw kleuring toonde aan dat> 99% van de embryonale C. elegans cellen overleven de isolatie procedure. Op dag 9 en 22 na plateren, 85% en 65%, respectievelijk nog in leven 1. Geïsoleerde embryonale C. elegans cellen moeten hechten aan een substraat om te differentiëren. Cellen die niet aan de vorm klonten houden en het i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans is een krachtige modelorganisme voor het ontcijferen van de genetische wegen betrokken bij de ontwikkeling, het gedrag en veroudering. Het gemak is voornamelijk het gevolg van het gemak waarmee het genetisch gemanipuleerd kan worden en uit zijn korte levenscyclus. Ondanks het gemak, C. elegans heeft zijn beperkingen. C. elegans cellen zijn klein en ingesloten in een onder druk cuticula dat de toepassing van methoden die directe toegang tot de cellen, zoals elektrofysiologische en fa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
REAGENTS
Bacto PeptoneVWR International Inc.90000-382
Difco Agar GranulatedVWR International Inc.90000-784
Bacto TryptoneVWR International Inc.90000-284
Bacto Yeast ExtractVWR International Inc.90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) LiquidInvitrogen11415-064
Fetal Bovine SerumInvitrogen16140-063
Penicillin-streptomycinSigmaP4333-100ML
Chitinase from Streptomyces GriseusSigmaC6137-25UN
NA22 Escherichia coliCaenorhabditis Genetics Center
Peanut LectinSigmaL0881-10MG
SucroseSigma57903-1KG
D-(+)GlucoseSigma67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)SigmaE0396-25G
HepesSigmaH3375-500G
Cholesterol
NaClSigma57653-1KG
KClSigmaP9333-500G
CaCl2SigmaC1016-500G
MgCl2SigmaM8266-100G
MgSO4SigmaM2643-500 g
K2HPO4SigmaP2222-500G
KH2PO4SigmaP9791-500G
NaOHSigmaS8045-500G
KOHSigmaP1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet TipsUSA Scentific1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually WrappedUSA Scentific1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejectorVWR International Inc.89079-974
Portable Pipet Aid, DrummondVWR International Inc.53498-103
Transfer Plastic Pipet SterileVWR International Inc.14670-114
15 ml Conical Tube USA Scentific1475-1611
50 ml Conical TubeUSA Scentific1500-1811
Sterile 18 gauge NeedlesBecton, Dickinson and Co.305196
Sterile 10 ml SyringesBecton, Dickinson and Co.305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size Corning431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor MembraneVWR International Inc.28144-095
60x15 mm Petri Dish SterileVWR International Inc.82050-548
100x15 mm Petri Dish SterileVWR International Inc.82050-912
12 mm Diameter Glass CoverslipsVWR International Inc.48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid Thomas scientific6902A09
Dumont #5- Fine Forceps Fine Science Tools11254-20
Centrifuge 5702Eppendorf022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Molecular and cellular biology. 5, 3484-3496 (1985).
  4. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C. elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. The EMBO journal. 10, 3959-3970 (1991).
  5. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  6. Sulston, J. E., White, J. G. Regulation and cell autonomy during postembryonic development of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 78, 577-597 (1980).
  7. Chalfie, M. Caenorhabditis elegans development. Current opinion in cell biology. 1, 1122-1126 (1989).
  8. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological sciences. 314, 1-340 (1986).
  9. Goodman, M. B., Hall, D. H., Avery, L., Lockery, S. R. Active currents regulate sensitivity and dynamic range in C. elegans neurons. Neuron. 20, 763-772 (1998).
  10. Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction. Nature. 2, 791-797 (1038).
  11. Miyawaki, A., Griesbeck, O., Heim, R., Tsien, R. Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96, 2135-2140 (1999).
  12. Kerr, R., et al. Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans. Neuron. 26, 583-594 (2000).
  13. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nature. 19, 137-141 (2001).
  14. Bloom, L. Genetic and molecular analysis of genes required for axon outgrowth in Caenorhabditis elegans. , (1993).
  15. Edgar, L. G. Blastomere culture and analysis. Methods in cell biology. 48, 303-321 (1995).
  16. Leung, B., Hermann, G. J., Priess, J. R. Organogenesis of the Caenorhabditis elegans intestine. Developmental biology. 216, 114-134 (1999).
  17. Buechner, M., Hall, D. H., Bhatt, H., Hedgecock, E. M. Cystic canal mutants in Caenorhabditis elegans are defective in the apical membrane domain of the renal (excretory) cell. Developmental biology. 214, 227-241 (1999).
  18. Suzuki, H., et al. In vivo imaging of C. elegans mechanosensory neurons demonstrates a specific role for the MEC-4 channel in the process of gentle touch sensation. Neuron. 39, 1005-1017 (2003).
  19. Carvelli, L., McDonald, P. W., Blakely, R. D., Defelice, L. J. Dopamine transporters depolarize neurons by a channel mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 16046-16051 (2004).
  20. Bianchi, L., et al. The neurotoxic MEC-4(d) DEG/ENaC sodium channel conducts calcium: implications for necrosis initiation. Nature. 7, 1337-1344 (2004).
  21. Frokjaer-Jensen, C., et al. Effects of voltage-gated calcium channel subunit genes on calcium influx in cultured C. elegans mechanosensory neurons. Journal of neurobiology. 66, 1125-1139 (2006).
  22. Von Stetina, S. E., et al. Cell-specific microarray profiling experiments reveal a comprehensive picture of gene expression in the C. elegans nervous system. Genome biology. 8, R135(2007).
  23. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC genomics. 6, 42(2005).
  24. Burnham-Marusich, A. R., et al. Metabolic Labeling of Caenorhabditis elegans Primary Embryonic Cells with Azido-Sugars as a Tool for Glycoprotein Discovery. PloS one. 7, e49020(2012).
  25. Kim, K. J., Yang, Y. J., Kim, J. G. Purification and characterization of chitinase from Streptomyces sp. M-20. Journal of biochemistry and molecular biology. 36, 185-189 (2003).
  26. Chalfie, M., Wolinsky, E. The identification and suppression of inherited neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Nature. 345, 410-416 (1990).
  27. Parpura, V. Voltage-gated calcium channel types in cultured C. elegans CEPsh glial cells. Cell calcium. 50, 98-108 (2011).
  28. Miller, D. M. 3rd, Niemeyer, C. J. Expression of the unc-4 homeoprotein in Caenorhabditis elegans motor neurons specifies presynaptic input. Development. 121, 2877-2886 (1995).
  29. Lickteig, K. M., et al. Regulation of neurotransmitter vesicles by the homeodomain protein UNC-4 and its transcriptional corepressor UNC-37/groucho in Caenorhabditis elegans cholinergic motor neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 21, 2001-2014 (2001).
  30. Zhang, H., et al. UNC119 is required for G protein trafficking in sensory neurons. Nature. 14 (7), (2011).
  31. Maduro, M., Pilgrim, D. Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system. Genetics. 141, 977-988 (1995).
  32. Chalfie, M., Sulston, J. Developmental genetics of the mechanosensory neurons of Caenorhabditis elegans. Developmental biology. 82, 358-370 (1981).
  33. Fukushige, T., et al. MEC-12, an alpha-tubulin required for touch sensitivity in C. elegans. Journal of cell science. 112 (Pt. 3), 395-403 (1999).
  34. Driscoll, M., Chalfie, M. The mec-4 gene is a member of a family of Caenorhabditis elegans genes that can mutate to induce neuronal degeneration. Nature. 349, 588-593 (1991).
  35. Xu, K., Tavernarakis, N., Driscoll, M. Necrotic cell death in C. elegans requires the function of calreticulin and regulators of Ca(2+) release from the endoplasmic reticulum. Neuron. 31, 957-971 (2001).
  36. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
  37. Strange, K., Christensen, M., Morrison, R. Primary culture of Caenorhabditis elegans developing embryo cells for electrophysiological, cell biological and molecular studies. Nature protocols. 2, 1003-1012 (2007).
  38. Goodman, M. B., Lockery, S. R. Pressure polishing: a method for re-shaping patch pipettes during fire polishing. Journal of neuroscience. 100, 13-15 (2000).
  39. Nickell, W. T., Pun, R. Y., Bargmann, C. I., Kleene, S. J. Single ionic channels of two Caenorhabditis elegans chemosensory neurons in native membrane. The Journal of membrane biology. 189, 55-66 (2002).
  40. Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans. Nature neuroscience. 11, 916-922 (2008).
  41. Parpura, V. Cell culturing of Caenorhabditis elegans glial cells for the assessment of cytosolic Ca(2)(+) dynamics. Methods Mol. Biol. 814 (2), 153-174 (2012).
  42. Zhang, Y., et al. Identification of genes expressed in C. elegans touch receptor neurons. Nature. 418, 331-335 (2002).
  43. Cinar, H., Keles, S., Jin, Y. Expression profiling of GABAergic motor neurons in Caenorhabditis elegans. Current biology : CB. 15, 340-346 (2005).
  44. Bacaj, T., Tevlin, M., Lu, Y., Shaham, S. Glia are essential for sensory organ function in C. elegans. Science. 322, 744-747 (2008).
  45. Colosimo, M. E., et al. Identification of thermosensory and olfactory neuron-specific genes via expression profiling of single neuron types. Current biology : CB. 14, 2245-2251 (1016).
  46. Shih, J. D., Fitzgerald, M. C., Sutherlin, M., Hunter, C. P. The SID-1 double-stranded RNA transporter is not selective for dsRNA length. RNA. 15, 384-390 (2009).
  47. O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals. Nature. 8, 43-50 (2005).
  48. Du, H., Gu, G., William, C. M., Chalfie, M. Extracellular proteins needed for C. elegans mechanosensation. Neuron. 16, 183-194 (1996).
  49. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PloS one. 6, e19505(2011).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

C elegans Embryonic CellsEgg IsolationChitinase TreatmentManual DissociationCell CultureImmunofluorescenceMicroscopyElectrophysiologyCalcium ImagingPatch Clamp

Gerelateerde artikelen