Method Article

Een methode voor het kweken van embryonale C. elegans Cellen

DOI:

10.3791/50649

⸱

September 21st, 2013

 , 
1Department of Physiology and Biophysics, University of Miami

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We beschrijven hier een herziene protocol voor grootschalige kweek van embryonale C. elegans cellen. Embryonale C. elegans cellen gekweekt in vitro gebruik van deze methode, blijken differentiëren en herhalen de expressie van genen in een celspecifieke wijze. Technieken die directe toegang tot de cellen of isolatie van specifieke celtypen van andere weefsels vereisen, kunnen worden toegepast C. elegans gekweekte cellen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans is een krachtig modelsysteem, waarin de genetische en moleculaire technieken zijn eenvoudig toepasbaar. Tot voor kort echter technieken die directe toegang tot cellen en isolatie van specifieke celtypen vereisen, kunnen niet worden toegepast in C. elegans. Deze beperking is te wijten aan het feit dat de weefsels worden ingesloten in een onder druk cuticula die niet gemakkelijk verteerd door behandeling met enzymen en / of reinigingsmiddelen. Gebaseerd op vroege pionierswerk door Laird Bloom, Christensen en collega's 1 ontwikkelde een robuuste methode voor het kweken van C. elegans embryonale cellen op grote schaal. Eieren worden geïsoleerd van zwangere volwassenen door behandeling met bleekwater / NaOH en vervolgens behandeld met chitinase om de eierschalen te verwijderen. Embryonale cellen worden vervolgens gedissocieerd door handmatig pipetteren en uitgeplaat op substraat bedekt glas in serum verrijkte media. Binnen 24 uur van isolatie cellen beginnen te differentiëren door het veranderen van de morfologie en expressie celspecifieke Markers. C. elegans cellen gekweekt met deze methode overleven gedurende 2 weken in vitro en zijn gebruikt voor elektrofysiologische, immunochemische, en imaging analyses als ze zijn gesorteerd en gebruikt voor microarray profilering.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans (C. elegans) is een krachtige modelorganisme voor het onderzoek naar de moleculaire basis van cellulaire functie, differentiatie, en gedrag. Terwijl het genoom, metabolische en biosynthetische routes lijken op gewervelde dieren, de genetische en moleculaire volgzaamheid veel groter 2. Onder de voordelen zijn de grootte en simpele anatomie, de snelle levenscyclus (3 dagen bij 25 ° C), korte levensduur (2 weken) en een groot aantal nakomelingen (> 200). Door zijn tweeslachtig karakter en de korte levenscyclus, moleculaire en genetische manipulaties zijn eenvoudig in C. elegans, inclusief de ontwikkeling van transgene ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sterretjes (*) geven aan nieuwe of gewijzigde stappen opzichte Christensen et al. 1.

1. Material Setup

  1. De celkweek procedure vereist grote hoeveelheden eieren geïsoleerd van zwangere volwassenen. Groeien C. elegans 8P op agarplaten geënt met NA22 (beschikbaar via het C. elegans Genetische Consortium - CGC) bacteriën grote hoeveelheden eieren isoleren. In deze platen de hoeveelheid pepton gebruikte 8 keer de hoeveelheid die gewoonlijk wordt gebruikt voor NGM platen. Hoe hoger pepton concentratie ondersteunt de groei van NA22 bacteriën efficiënter, die in strijd zijn OP50-, groeien in dikke l....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans gekweekte cellen differentiëren en uitdrukkelijke cel specifieke markers

Christensen en collega's met behulp van trypan blauw kleuring toonde aan dat> 99% van de embryonale C. elegans cellen overleven de isolatie procedure. Op dag 9 en 22 na plateren, 85% en 65%, respectievelijk nog in leven 1. Geïsoleerde embryonale C. elegans cellen moeten hechten aan een substraat om te differentiëren. Cellen die niet aan de vorm klonten houden en het i.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

C. elegans is een krachtige modelorganisme voor het ontcijferen van de genetische wegen betrokken bij de ontwikkeling, het gedrag en veroudering. Het gemak is voornamelijk het gevolg van het gemak waarmee het genetisch gemanipuleerd kan worden en uit zijn korte levenscyclus. Ondanks het gemak, C. elegans heeft zijn beperkingen. C. elegans cellen zijn klein en ingesloten in een onder druk cuticula dat de toepassing van methoden die directe toegang tot de cellen, zoals elektrofysiologische en fa.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
REAGENTS
Bacto PeptoneVWR International Inc.90000-382
Difco Agar GranulatedVWR International Inc.90000-784
Bacto TryptoneVWR International Inc.90000-284
Bacto Yeast ExtractVWR International Inc.90000-724
Leibovitz's L-15 Medium (1x) LiquidInvitrogen11415-064
Fetal Bovine SerumInvitrogen16140-063
Penicillin-streptomycinSigmaP4333-100ML
Chitinase from Streptomyces GriseusSigmaC6137-25UN
NA22 Escherichia coliCaenorhabditis Genetics Center
Peanut LectinSigmaL0881-10MG
SucroseSigma57903-1KG
D-(+)GlucoseSigma67528-1KG
Ethylene glycol-bis (2-amin–thylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)SigmaE0396-25G
HepesSigmaH3375-500G
Cholesterol
NaClSigma57653-1KG
KClSigmaP9333-500G
CaCl2SigmaC1016-500G
MgCl2SigmaM8266-100G
MgSO4SigmaM2643-500 g
K2HPO4SigmaP2222-500G
KH2PO4SigmaP9791-500G
NaOHSigmaS8045-500G
KOHSigmaP1767-500G
Ethanol
Autoclaved distilled H2O
Bleach
EQUIPMENT
101-1000 μl Blue Graduated Pipet TipsUSA Scentific1111-2821
10 ml Sterilized Pipet Individually WrappedUSA Scentific1071-0810
Ergonomic Variable Volume (100-1000 μl) Pipettor with tip ejectorVWR International Inc.89079-974
Portable Pipet Aid, DrummondVWR International Inc.53498-103
Transfer Plastic Pipet SterileVWR International Inc.14670-114
15 ml Conical Tube USA Scentific1475-1611
50 ml Conical TubeUSA Scentific1500-1811
Sterile 18 gauge NeedlesBecton, Dickinson and Co.305196
Sterile 10 ml SyringesBecton, Dickinson and Co.305482
Plastic Syringe Filters Corning 0,20 μm pore size Corning431224
Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 μm versapor MembraneVWR International Inc.28144-095
60x15 mm Petri Dish SterileVWR International Inc.82050-548
100x15 mm Petri Dish SterileVWR International Inc.82050-912
12 mm Diameter Glass CoverslipsVWR International Inc.48300-560
Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid Thomas scientific6902A09
Dumont #5- Fine Forceps Fine Science Tools11254-20
Centrifuge 5702Eppendorf022629883
Laminar Flow Hood
Inverted Microscope with x10 objective
Ambient air humidified Incubator

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33, 503-514 (2002).
  2. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. elegans II. , (1997).
  3. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

C elegans Embryonic CellsEgg IsolationChitinase TreatmentManual DissociationCell CultureImmunofluorescenceMicroscopyElectrophysiologyCalcium ImagingPatch Clamp

Related Articles