Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen

16.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50662

⸱

1 augustus 2013

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester School of Medicine and Dentistry, 2Departments of Immunology and Microbial Sciences, The Scripps Research Institute

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Redding van recombinant arenavirussen uit gekloneerde cDNA's, gegeven voor een reverse genetische benadering stelt onderzoekers de rol van specifieke virale genproducten, evenals de bijdrage van de verschillende specifieke gebieden en residuen te onderzoeken, om verschillende aspecten van de biologie van arenavirus . Ook reverse genetics technieken FDA-goedgekeurde cellijnen (Vero) voor vaccinontwikkeling verschaft nieuwe mogelijkheden voor het genereren van effectieve en veilige vaccins ter bestrijding humane pathogene arenavirussen.

Samenvatting

De ontwikkeling en implementatie van arenavirus reverse genetics is een belangrijke doorbraak in het areanavirus veld 4. Het gebruik van cel-gebaseerde arenavirus minigenoom systemen samen met de mogelijkheid om recombinant infectueus arenavirussen met voorafbepaalde veranderingen in hun genomen te genereren is het onderzoek naar de bijdrage van virale determinanten van de verschillende stappen van de arenavirus levenscyclus, en virus-gastheer vergemakkelijkt interacties en mechanismen van pathogenese arenavirus 1, 3, 11. Bovendien is de ontwikkeling van trisegmented arenavirussen toegelaten gebruik van de arenavirus genoom aanvullende vreemde genen van interesse en aldus de mogelijkheid van arenavirus gebaseerd vaccin vector toepassingen 5 openen. Ook aan een enkele cyclus infectieuze arenavirussen kan uitdrukken reporter genen verschaft een nieuwe experimentele methode om de veiligheid van onderzoek met highl verbetereny pathogene menselijke arenaviruses 16. De generatie van recombinant arenaviruses met behulp van vector-gebaseerde reverse genetics technieken heeft tot nu toe vertrouwd op het gebruik van knaagdieren cellijnen 7,19, die enkele barrières voor de ontwikkeling van de Food and Drug Administration (FDA)-licentie vaccin of vaccinvectoren poses. Om dit obstakel te overwinnen, beschrijven we hier de efficiënte productie van recombinante arenaviruses in FDA-goedgekeurde Vero-cellen.

Inleiding

Arenaviruses zijn omhulde virussen met een bisegmented, negatieve-stranded RNA genoom 3 die behoren tot de familie Arenaviridae. De arenavirus genoom codeert vier eiwitten in een ambisense mode uit twee afzonderlijke virale segmenten 3. De grote (L) segment codeert het RNA-afhankelijke RNA-polymerase (L) en de kleine RING (Really Interesting New Gene) vinger eiwit (Z), dat fungeert als de belangrijkste drijvende kracht van het virus ontluikende. Het kleine (S) segment codeert het virale nucleoproteïne (NP) en het oppervlak glycoproteïne (GP) (figuur 1).

Verscheidene leden van de familie Arenaviridae verantwoordelijk voor dodelijke hemorrhagic fever (HF) bij mensen 3. Principiële zorgen zijn Lassa virus (LASV) en Junín virus (JUNV), waarvan bekend is dat hoge mortaliteit bij gehospitaliseerde patiënten 8, 9 veroorzaken. Hoewel deze virussen zijn endemisch in West-Afrika en landelijke Argentinië, respectievelijk,er zijn toenemende bezorgdheid van de invoer van LASV en JUNV naar niet-endemische gebieden als gevolg van verhoogde reizen 10. Bovendien, hoewel niet gewoonlijk geassocieerd met ernstige ziekten bij de mens, is het prototype arenavirus lymfatische choriomeningitisvirus (LCMV) beschouwd als een verwaarloosde pathogeen als er gevallen van dodelijke infecties zijn in immuungecompromitteerde patiënten 6, 15 en is verantwoordelijk voor aangeboren afwijkingen en spontane abortussen bij zwangere vrouwen 2, 13. Momenteel zijn er geen FDA-goedgekeurde vaccins tegen arenavirussen en behandeling is beperkt tot het nucleoside analoog ribavirine, die slechts gedeeltelijk effectief en vaak geassocieerd met significante bijwerkingen.

De introductie van plasmide-gebaseerde reverse genetics 4 en generatie van recombinant arenaviruses 7, 19 zijn sterk vooruitgegaan op het gebied van arenavirus onderzoek. Momenteel worden cellen van knaagdieren (zoals BHK-21) voor de algeatie van recombinant arenavirussen door de soortspecifieke murine RNA polymerase I (pol-I) promoter de transcriptie van de eerste S en L segmenten. Echter virus rescue in BHK-21 cellen geen goedgekeurde methode voor het genereren van recombinant arenavirussen als potentieel vaccin kandidaten zaad. Hier documenteren wij het gebruik van de menselijke pol-I promotor voor doeltreffende redding van de prototypische Oude Wereld (OW) LCMV en de Nieuwe Wereld (NW) JUNV Candid # 1 stam in Vero-cellen. Met behulp van een soortgelijke methodologie, we gegenereerd recombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) en Candid # 1 (r3Candid # 1) arenaviruses dat twee extra vreemde genen gecodeerd in twee verschillende S-RNA-segmenten 5 bevatten. Dit nieuwe systeem volgt niet alleen een zeer reproduceerbare en eenvoudig protocol maar kunnen onmiddellijk worden toegepast bij de vorming van recombinante arenavirussen als potentiële vaccins of vaccin vector zaden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Arenavirus Rescue Transfection

Ons rescue was gebaseerd op het gebruik van zowel polymerase II eiwit expressieplasmiden die coderen voor de nucleoproteïne (NP) en RNA-afhankelijke RNA-polymerase (L), de virale trans-werkende factoren nodig zijn voor RNA-replicatie en genexpressie van de arenavirus genoom 7, 19 en plasmiden staat om directe intracellulaire synthese, via het cellulair RNA-polymerase I (pol-I), van de S en L antigenoom RNA species 7. In onze studies gebruiken we de pCAGGS eiwitexpressie plasmide, dat de kip β-actine promoter en polyadenylanation (pA) signaalsequenties gebruikt en de menselijke pol I-plasmide, dat het menselijke polymerase I promotor gebruikt en murine terminatorsequenties (figuur 2) . De S en L RNA segmenten worden gekloneerd in het plasmide HPOL-I in een antigenome oriëntatie om voor het genereren van genomische RNA segmenten bij transcriptie bij HPOL-I. Voor de redding van wild-type recombinant LCMV (rLCMV) en Candid # 1 (rCandid nr. 1) de pCAGGS NP en L van elk virus gecotransfecteerd met hun respectievelijke humane pol I-S en L RNA segmenten (Figuur 3). Generatie van recombinant trisegmented LCMV (r3LCMV) en Candid # 1 (r3Candid nr. 1) was dezelfde protocol maar de S segment werd opgesplitst in twee verschillende pol-I S plasmiden, coderen elk een onderscheidende reportergen: in een, de NP open reading frame (ORF) werd vervangen door het Green Fluorescent Protein (GFP) reporter gen (HPOL-I S GFP / GP) en, in de andere, de virale glycoproteïne precursor (GPC) ORF wordt vervangen Gaussia luciferase (Gluc) reportergen (HPOL-I S NP / Gluc). Een schematische weergave van het protocol is geïllustreerd in figuur 4. De volgende transfectie en infectie-protocol is vastgesteld voor 6-well-platen.

  1. OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) mengsel: Bereid 250 ul OptiMEM media en, afhankelijkhet virus te redden, 10-12 ug LPF2000 (1 ug / ul) per transfectie (tabel 1). Een verhouding van 2,5 ug LPF2000 per ug DNA wordt aanbevolen. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur. Bereid ondertussen het plasmide transfectie mengsel in een aparte microcentrifugebuis (stap 1.2).
  2. Plasmide-DNA transfectie mengsel: Bereid de plasmide transfectie cocktail in een microcentrifugebuis met de aanbevolen hoeveelheden voor elk virus rescue (zie tabel 1). Breng het uiteindelijke volume tot 50 pi met OptiMEM.
  3. OptiMEM-LPF2000 plasmide-DNA mengsel Voeg 250 ul van de OptiMEM-LPF2000 mengsel (stap 1.1) in het plasmide DNA transfectie mengsel (stap 1.2). Incubeer het mengsel gedurende 20-30 minuten bij kamertemperatuur. Ondertussen bereiden en tel 1 x 10 6 Vero-cellen per transfectie reactie. Vero-cellen worden getransfecteerd in suspensie.
  4. Bereiding van Vero cellen: Vero cells worden gekweekt in 100 mm gerechten. Breng alvorens te beginnen de 1x PBS, DMEM 10% FBS 1% PS media, en trypsine-EDTA mengsel tot 37 ° C.
    1. Was de cellen tweemaal met 5 ml 1x PBS.
    2. Trypsinize cellen met 1 ml trypsine-EDTA en wacht tot cellen detach (ca. 5 min). Zacht tikken misschien nodig om volledig te verwijderen van de cellen van de gerechten.
    3. Voorzichtig resuspendeer de cellen in 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS in een 15 ml centrifugebuis.
    4. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 1000 rpm in een centrifuge.
    5. Resuspendeer de cellen in 10 ml DMEM 10% FBS en 1% PS tellen van de cellen met een hemocytometer en concentratie passen aan 1 x 10 6 cellen / ml. Er werd waargenomen dat 0,5-1 x 10 6 cellen per transfectie Vero de beste resultaten.
  5. Meng LPF2000/DNA en cellen: Na 20 - 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur (stap 1.3), voeg 1 ml van Vero-cellen (1 x 10 6) (stap 1.4) naarde OptiMEM-LPF2000 plasmide-DNA mengsel en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
  6. Seed LPF2000/DNA-cell mengsel in 6-well-platen: Voeg de DNA-LPF2000 Vero-mengsel (stap 1.5) in de putjes van de 6-well plaat. Schud de 6-well-plaat en laat de transfectie incubeer overnacht in de incubator bij 37 ° C en 5% CO 2.
  7. Wijzig transfectiemedium: Ongeveer 16-24 uur na transfectie, verwijder de transfectie media, voeg 2 ml van de infectie media en incubeer getransfecteerde cellen voor een extra 48 uur.
  8. Celpassage: Na 48 uur incubatie in infectie media, verwijder de weefselkweeksupernatant (TCS) en passeren de getransfecteerde cellen in een 100 mm schaal. De TCS bevat zelden besmettelijk virus, omdat de getransfecteerde cellen nodig aanvullende incubatie om virusdeeltjes te genereren. Voor de passage cel:
    1. Was de cellen tweemaal met 2 ml 1x PBS.
    2. Trypsinize cellen w ide 0,5 ml trypsine-EDTA en wacht tot cellen los.
    3. Resuspendeer de cellen in 1 ml DMEM 10% FBS 1% PS in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
    4. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 5000 rpm, 4 ° C in een microcentrifuge.
    5. Resuspendeer voorzichtig de cellen in 1 ml van infectie media en overbrengen van de cellen naar een 100 mm schaal. Breng het totale volume van de plaat, met besmettelijke media, 8 ml, voldoende volume om uitdroging te voorkomen van de cellen en voor het concentreren van het virus.
  9. Schud de 100 mm schaal en verder het incuberen van Vero-cellen in de incubator bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 72 uur.
  10. Collectie van TCS: Na 72 uur incubatie, het verzamelen van de TCS in een 15 ml centrifugebuis. Verwijder celresten door centrifugeren gedurende 5 min bij 2500 rpm in een centrifuge. Infectieuze arenavirus wordt gevonden in de TCS, zodat uit de celresten pellet en opslaan TCS bij -80 ° C.
le ". Bevestiging van Recombinant arenavirus Rescue> 2

Detectie van een succesvolle redding van rLCMV en rCandid # 1 geschiedt via een focus-vormende eenheid (FFU) immunofluorescentie assay (IFA). Voor wild-type virus rescue gebruiken we antilichamen specifiek voor de virale NP. De r3LCMV en r3Candid nr.1 coderen twee reportergenen (GFP en Gluc), waardoor virale detectie en titratie zonder de noodzaak van antilichamen door fluorescentiemicroscopie (GFP) en / of luminescentie (Gluc).

  1. Bevestig wild-type recombinante arenavirus rescue: De dag vóór titratie, wassen Vero-cellen tweemaal met PBS, trypsinize en bereiden 96-well platen tot 80 te bereiken - 90% samenvloeiing volgende dag (4 x 10 4 cellen / putje). Schud de platen met de hand om een ​​geüniformeerde verdeling van de cellen te krijgen. Cultuur van de cellen een nacht in de 37 ° C incubator met 5% CO2. Controleer de cellen onder de microscoop om een ​​monolaag te bevestigen, alvorens verder te gaan met de infectie:
    1. Serieel verdund (10 voudige verdunningen) de virus-bevattende TCS gewonnen uit de getransfecteerde cellen in de 100 mm schaal (stap 1.10) in OptiMEM.
    2. Verwijder het afdrukmateriaal uit de gezaaide Vero-cellen, wassen tweemaal met 50 pi 1x PBS, en infecteren cellen met 50 ul van de serieel verdund virus (stap 2.1). Infecteren cellen gedurende 1,5 uur bij 37 ° C en 5% CO2.
    3. Na infectie, verwijder de virusinoculum, voeg 100 ul van infectie media / putje en incubeer de cellen voor 16 - 18 uur. Virale re-infectie kan optreden na 18 uur incubatie, wat kan leiden tot overschatting van de virale titers.
    4. Bij 16 - 18 uur na infectie, verwijder de TCS van elk putje en zet de cellen met 4% formaldehyde opgelost in 1 x PBS, gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Vervolgens verwijdert de fixeeroplossing en doorlaatbaar de cellen met 0,1% triton X-100 verdund in 1 x PBS, gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Zuig het permeabilisatie oplossing, daarna wassen cellen 3 maal with 1x PBS.
    7. Blokkeer de cellen met 2,5% runderserum albumine (BSA) in 1x PBS (blokkerende oplossing) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Als alternatief kunnen de cellen worden overnacht bij 4 ° C geblokkeerd en voortgezet met antilichaam incubatie de volgende dag.
    8. Maak ondertussen het primaire antilichaam. Verdun de LCMV-en Candid # 1-specifieke primaire antilichamen in blockingbuffer en centrifugeer de antilichaam / blokkerende oplossing gedurende 15 minuten bij 3.500 rpm. De monoklonale anti-LCMV NP antilichaam kloon 1.1.3 (1:30 verdunning) 16 en de monoklonale anti-JUNV NP antilichaam SA02-BG12 van BEI Resources (1:500 verdunning) kan worden gebruikt voor de detectie van rLCMV en rCandid nr.1 respectievelijk.
    9. Na 1 uur incubatie, zuigen de blockingbuffer en voeg 50 ul van het primaire antilichaam aan de cellen en incubeer 1 uur bij 37 ° C.
    10. Op dit moment Verdun het secundaire antilichaam in blockingbuffer en centrifugeer de antilichaam / blokkerende oplossing gedurende 15 minuten bij 3.500 rpm. De polyklonale konijn anti-muis IgG FITC tweede antilichaam voor de detectie van primaire monoklonale antilichamen werd gebruikt om beelden waargenomen in figuur 5 te verkrijgen.
    11. Na 1 uur incubatie zuig het primaire antilichaam, was 3 maal met 1 x PBS en voeg het secundaire antilichaam gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
    12. Na 30 min incubatie, zuig het secundaire antilichaam en was 3 keer met 1x PBS. De cellen zijn nu klaar om te worden waargenomen met behulp van fluorescentie microscopie aan beide bepalen het succes van virale redding en titratie door het tellen van de focus eenheden per ml (FFU / ml).
  2. r3LCMV en r3Candid # 1 viral rescue: Omdat deze virussen uiten twee reporter genen, hun reddingen kunnen worden gecontroleerd met behulp van fluorescentie microscopie om GFP expressie of Gluc expressie in TCS detecteren. Rescue kan ook worden bevestigd door expressie van Gluc in TCS. Om de trisegmented virussen titreren, volgen we de stappen 2.1 tot en met 2.1.4, echter cellen hoeven niet te be bevestigd aan een succesvolle virale redding door GFP-expressie te bepalen. De titratie van het virus wordt bepaald door het tellen van de FFU / ml. Om succesvolle virale redding bepalen door Gluc expressie Gluc expressie van TCS kunnen worden gemeten met een Gluc assay kit (Biolux Gaussia Luciferase Assay kit, New England Biolabs). Daartoe:
    1. Pipet 100 ul van TCS in een 96-well witte plaat (Platbodem microtiterplaten, Fisher Scientific).
    2. Stel de lichtmeter (LumiCount, Packard Biosciences).
    3. Voeg 50-100 ul Gluc Assay oplossing (zoals aanbevolen door de fabrikant) aan elk monster en meet de Gluc reportergenexpressie met de luminometer. Als negatieve controle werd Gluc expressie van de TCS van de wildtype virussen geïnfecteerde cellen gemeten.

3. Passage van Tissue Culture Supematanten

Virale redding is afhankelijk van transfectie efficiëntie. Vero-cellen is aangetoondtot lagere transfectie efficiëntie dan andere cellijnen 14 hebben. Als virustiters in de TCS zijn laag, infecteren verse Vero-cellen bij een multipliciteit van infectie (MOI) van 0,01 (LCMV) of 0.1 (Spontaan # 1) voor 72 uur om het virus te versterken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Succesvolle redding van een recombinant wildtype arenavirus wordt bevestigd door de aanwezigheid van virale antigenen met IFA (figuur 5). Bij recombinante trisegmented virussen kunnen succesvolle virale redding worden beoordeeld door het observeren GFP expressie door fluorescentie microscopie (figuur 6A). Succesvolle rescue zullen verder bevestigd door het beoordelen Gluc expressie (Figuur 6B). Representatieve resultaten illustreren de succesvolle redding van wild-type ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Generatie van recombinant arenaviruses met behulp van vector-gebaseerde reverse genetics technieken is uitgegroeid tot een veel gebruikte aanpak voor het onderzoeken van vele verschillende facetten van arenavirus biologie. Hier documenteren we een cruciale verbetering van het huidige systeem door het uitvoeren arenavirus reddingen in Vero-cellen, waardoor de potentiële productie van FDA-goedgekeurde kandidaten vaccin tegen arenaviruses en vaccinvectoren tegen andere besmettelijke ziekten.

De...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Geen belangenconflicten verklaard.

Dankbetuigingen

Wij danken heden en verleden leden in JCT en LM-S laboratoria voor de ontwikkeling en verbetering van de arenavirus reverse genetics technieken en plasmiden. We danken ook Snezhana Dimitrova voor technische ondersteuning. Het monoklonaal antilichaam gericht om JUNV NP (SA02-BG12) werd verkregen van BEI Resources (NIAID Biodefense en opkomende infecties Research Resources Repository). BYHC werd ondersteund door Grant Number GM068411 van Institutionele Ruth L. Kirschstein National Research Service Award. EO-R is een Fulbright-Conicyt (BIO 2008) en een Rochester Vaccin Fellowship (2012) ontvanger. EO-R huidige ondersteuning wordt geleverd door een postdoctorale Fellowship voor Diversiteit & Academic Excellence van het Bureau voor Faculty Development & Diversiteit aan de Universiteit van Rochester. Onderzoek in LM-S laboratorium wordt gefinancierd door de NIH subsidie ​​RO1 AI077719, R21NS075611-01, R03AI099681-01A1, de NIAID Centers of Excellence voor Influenza Onderzoek en Surveillance (HHSN266200700008C), enDe Universiteit van Rochester Centrum voor Biodefense Immune Modeling (HHSN272201000055C).

Onderzoek bij JCT laboratorium werd ondersteund door subsidies RO1 AI047140, RO1 AI077719 en RO1 AI079665 van NIH.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Materiaal en methoden
Cellijnen
Vero E6 (nierepitheelcellen van Afrikaanse groene aap) worden bewaard in een 37 °C incubator met 5 % CO2 in DMEM 10 % FBS 1 % PS. Cellen zijn verkrijgbaar bij de American Type Culture Collection (ATCC, catalogusnummer CRL-1586).

Plasmiden
Alle plasmiden, met uitzondering van hpol-I L, kunnen worden gekweekt bij 37 °C, gedurende 16-18 uur. We raden aan dat culturen van de hpol-I L worden gekweekt bij 30 °C gedurende 24 uur. Plasmiden worden bereid met behulp van een plasmide maxi kit (EZNA Fastfilter Plasmid Maxi Kit, Omega Bio-tek) volgens de aanbevelingen van de fabrikant en worden bewaard bij -20 °C. De concentratie van het gezuiverde DNA-plasmide wordt bepaald door spectrofotometrie bij 260 nm, waarbij de zuiverheid wordt geschat aan de hand van de 260:280 nm-verhouding. Bereidingen met 1,8-2,0 260:280 nm-verhoudingen worden geschikt geacht voor virusredding. Bovendien moeten de concentratie en zuiverheid van het plasmide worden bevestigd met agarosegelelektroforese.

Virussen
Het beschreven protocol voor het redden van rLCMV (Armstrong 53b) en rCandid#1 kan worden uitgevoerd onder bioveiligheidsniveau (BSL) 2-omstandigheden. Besmet materiaal, inclusief TCS en cellen, moet worden gesteriliseerd voordat het wordt weggegooid. Het redden van andere arenavirussen kan hogere BSL-faciliteiten vereisen, dus de juiste veiligheids-/beveiligingsmaatregelen moeten worden gevolgd.

Weefselkweekmedia en oplossingen
DMEM 10 %FBS 1 %PS: 445 ml Dulbecco's aangepast Eagle's medium (DMEM), 50 ml foetaal bovien serum (FBS) en 5 ml 100X Penicilline/Streptomycine (PS). Bewaren bij 4 °C. Dit medium wordt gebruikt voor het onderhoud van Vero-cellen.

Besmettelijk medium: 2-tot-1 mengsel van OptiMEM en DMEM 10 %FBS 1 %PS. Bewaren bij 4 °C. Dit medium wordt gebruikt tijdens virale infecties.

10X Fosfaatgebufferd zout (PBS): 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g van Na2HPO4.7H2O, 2 g van KH2PO4. Voeg ddH2O tot 1 liter toe. Breng pH aan op 7,3. Steriliseer door autoclaveren. Bewaren bij kamertemperatuur.
1X PBS: Verdun 10X PBS 1:10 met ddH2O. Steriliseer door autoclaveren en bewaar bij kamertemperatuur.
2,5 % BSA: 2,5 g BSA in 97,5 ml van 1X PBS. Bewaren bij 4 °C. Dit wordt gebruikt als blokkeeroplossing voor IFA.

Referenties

  1. Albarino, C. G., Bird, B. H., Chakrabarti, A. K., Dodd, K. A., Flint, M., Bergeron, E., White, D. M., Nichol, S. T. The major determinant of attenuation in mice of the Candid1 vaccine for Argentine hemorrhagic fever is located in the G2 glycoprotein transmembrane domain. Journal of Virology. 85, 10404-10408 (2011).
  2. Barton, L. L. Lymphocytic choriomeningitis virus: a neglected central nervous system pathogen. Clinical Infectious Diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 22, 197(1996).
  3. Buchmeier, M. J., Peter, C. J., de la Torre, J. C. Arenaviridae: The viruses and their replication. Fields' Virology. Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Fifth, 179201827(2007).
  4. Emonet, S. E., Urata, S., de la Torre, J. C. Arenavirus reverse genetics: new approaches for the investigation of arenavirus biology and development of antiviral strategies. Virology. 411, 416-425 (2011).
  5. Emonet, S. F., Garidou, L., McGavern, D. B., de la Torre, J. C. Generation of recombinant lymphocytic choriomeningitis viruses with trisegmented genomes stably expressing two additional genes of interest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 3473-3478 (2009).
  6. Fischer, S. A., Graham, M. B., Kuehnert, M. J., Kotton, C. N., Srinivasan, A., Marty, F. M., Comer, J. A., Guarner, J., Paddock, C. D., DeMeo, D. L., et al. Transmission of lymphocytic choriomeningitis virus by organ transplantation. The New England Journal of Medicine. 354, 2235-2249 (2006).
  7. Flatz, L., Bergthaler, A., de la Torre, J. C., Pinschewer, D. D. Recovery of an arenavirus entirely from RNA polymerase I/II-driven cDNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 4663-4668 (2006).
  8. Gunther, S., Lenz, O. Lassa virus. Critical reviews in clinical laboratory sciences. 41, 339-390 (2004).
  9. Harrison, L. H., Halsey, N. A., McKee, K. T., Peters, C. J., Barrera Oro, J. G., Briggiler, A. M., Feuillade, M. R., Maiztegui, J. I. Clinical case definitions for Argentine hemorrhagic fever. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 28, 1091-1094 (1999).
  10. Isaacson, M. Viral hemorrhagic fever hazards for travelers in Africa. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 33, 1707-1712 (2001).
  11. Kerber, R., Rieger, T., Busch, C., Flatz, L., Pinschewer, D. D., Kummerer, B. M., Gunther, S. Cross-species analysis of the replication complex of Old World arenaviruses reveals two nucleoprotein sites involved in L protein function. Journal of Virology. 85, 12518-12528 (2011).
  12. Lee, K. J., Novella, I. S., Teng, M. N., Oldstone, M. B., de La Torre, J. C. NP and L proteins of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) are sufficient for efficient transcription and replication of LCMV genomic RNA analogs. Journal of Virology. 74, 3470-3477 (2000).
  13. Mets, M. B., Barton, L. L., Khan, A. S., Ksiazek, T. G. Lymphocytic choriomeningitis virus: an underdiagnosed cause of congenital chorioretinitis. American Journal of Ophthalmology. 130, 209-215 (2000).
  14. Murakami, S., Horimoto, T., Yamada, S., Kakugawa, S., Goto, H., Kawaoka, Y. Establishment of canine RNA polymerase I-driven reverse genetics for influenza A virus: its application for H5N1 vaccine production. Journal of Virology. 82, 1605-1609 (2008).
  15. Palacios, G., Druce, J., Du, L., Tran, T., Birch, C., Briese, T., Conlan, S., Quan, P. L., Hui, J., Marshall, J., et al. A new arenavirus in a cluster of fatal transplant-associated diseases. The New England Journal of Medicine. 358, 991-998 (2008).
  16. Rodrigo, W. W., de la Torre, J. C., Martinez-Sobrido, L. Use of single-cycle infectious lymphocytic choriomeningitis virus to study hemorrhagic fever arenaviruses. Journal of Virology. 85, 1684-1695 (2011).
  17. Rojek, J. M., Kunz, S. Cell entry by human pathogenic arenaviruses. Cellular Microbiology. 10, 828-835 (2008).
  18. Rojek, J. M., Sanchez, A. B., Nguyen, N. T., de la Torre, J. C., Kunz, S. Different mechanisms of cell entry by human-pathogenic Old World and New World arenaviruses. Journal of Virology. 82, 7677-7687 (2008).
  19. Sanchez, A. B., de la Torre, J. C. Rescue of the prototypic Arenavirus LCMV entirely from plasmid. Virology. 350, 370-380 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Plasmidtransfectievirusrescueimmunofluorescentie assayluciferase expressietrisegmentvirusFDA goedgekeurde cellenreverse genetica
Generatie van recombinant arenavirus for Vaccine Development in FDA-goedgekeurde Vero cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.