De productie van grote aantallen grote gecontroleerde bolvormige tumoren met behulp microputjesplaten

Summary

We introduceren een protocol voor het aanleggen van grote aantallen (duizenden tot honderdduizenden) van gelijke grootte-en-samenstelling gecontroleerde bolvormige tumoren, met behulp van in de handel verkrijgbare microputjesplaten.

Abstract

Bolvormige tumoren worden steeds meer erkend als een belangrijke in vitro model voor het gedrag van tumorcellen in drie dimensies. Meer fysiologisch relevante dan conventionele hechtende vel culturen, ze nauwkeuriger recapituleren de complexiteit en de effecten zoals die voorkomen in het echte tumoren. Om dit model te benutten om tumorbiologie of de doeltreffendheid van nieuwe therapeutische middelen beter te beoordelen, is het noodzakelijk om te kunnen sferoïden reproduceerbaar te genereren, op een gecontroleerde wijze en in grote aantallen.

Het AggreWell systeem bestaat uit een array met hoge dichtheid van piramidevormige microputjes, waarin een suspensie van afzonderlijke cellen gecentrifugeerd. De aantallen cellen clustering onderaan elk microwell, en het aantal en de verhouding van verschillende celtypen betrokken alleen afhangen eigenschappen van de suspensie die door de experimentator. Zo zijn wij in staat om bolvormige tumoren van willekeurige grootte en samenstelling te genereren metuit om het onderliggende platform technologie wijzigen. De honderden microputjes per vierkante centimeter cultuur oppervlak weer zodat zeer hoge productieniveaus via een eenvoudige, nonlabor-intensief proces kan worden bereikt. Wij verwachten dan ook dat dit protocol in grote lijnen nuttig voor onderzoekers op het bolvormige gebied tumor zal zijn.

Introduction

Er is een toenemende hoeveelheid bewijsmateriaal dat tumorcellen zich anders gedragen in de driedimensionale culturen dan wanneer ze worden gekweekt op plastic, en dat therapeutische middelen die op conventionele weefselkweek platforms werkzaamheid kunnen verliezen toen overgestapt op een meer fysiologisch-relevante systeem ^1. Het is daarom wenselijk om het gedrag van kankercellen bestuderen onder deze omstandigheden, zowel inzicht in de onderliggende biologische verkrijgen en ook de slaagkans van overgang nieuwe therapeutische middelen van de screening mogelijk om de kliniek te verhogen. Een nuttige modelsysteem met een lange historie telt driedimensionale clusters van kankercellen bekend als bolvormige tumoren ^1,2. Idealiter zou technieken sferoïde vorming van grote aantallen uniforme bolvormige deeltjes waarvan de omvang en samenstelling worden gecontroleerd door de experimentator mogelijk. Terwijl opknoping-drop en goed-plaat benadert ^3,4 zijn in staat om een aantal van deze re vervulleneisen, throughput het algemeen beperkt, en het genereren van grote aantallen sferoïden wordt een arbeidsintensieve taak.

We hebben onlangs een systeem ontwikkeld om soortgelijke uitdagingen in de regeneratieve geneeskunde veld ⁵ op te lossen. Gebruikmakend gedwongen aggregatie binnen een reeks dicht op elkaar gepakte micronschaal putjes (zie figuur 1), deze benadering maakt de vorming van sferoïden van willekeurige aantallen cellen, inclusief mengsels van verschillende celtypes ^6, alsmede de inbouw van verschillende biomaterialen ^7. Sferoïden zijn gevormd in grote aantallen - duizenden tot honderdduizenden of meer - en kunnen direct worden geëxtraheerd of gehandhaafd in de microputjes waarin zij zijn gevormd met medium ruil voor tenminste een ⁸ tot twee (niet gepubliceerde waarneming) weken. Dit systeem is daarom goed geschikt voor het genereren van grote aantallen uniforme en reproduceerbare bolvormige tumoren voor de beoordeling van de effectiveness van nieuwe antitumormiddelen of fundamentele biologische onderzoeken.

Protocol

OPMERKING: Microwell platen zijn in verschillende formaten, afhankelijk van de gewenste resultaten. Specificaties en grove richtlijnen voor de minimum en maximum aantallen cellen die moeten worden gebruikt met elke indeling zijn weergegeven in Tabel 1. De kleinere microwells taps tot een scherpe punt, en dus is er geen lagere limiet, hoewel variabiliteit tussen de bolletjes wordt meer significant bij kleinere maten. Routine productie van sferoïden van gemiddeld slechts 20 cellen elk is eenvoudig ^8. De grotere microwell maat is niet volledig taps, probeert dus sferoïden van kleine aantallen cellen vormen kan resulteren in meerdere kleinere sferoïden per microwell. Als gevolg van kleine verschillen in oppervlakte-eigenschappen, de voorbereiding met het oppervlakte-oplossing (stap 1.2) is niet optioneel bij gebruik AggreWell 400EX platen.

Dit protocol is gebaseerd op het gebruik van AggreWell 400 platen - voor andere formaten nadelenult Tabel 1. Het aantal cellen in elk putje te laden wordt bepaald door het aantal microputjes bevat het aantal cellen geclusterd elke sferoïde vermenigvuldigen. Om bijvoorbeeld sferoïden van 1000 cellen per stuk produceren, moet elk putje worden geladen met (1200 sferoïden tijden 1.000 cellen per =) 1,2 x 10 ⁶ cellen. Celdichtheid moet worden berekend omdat de cellen in een volume van 0,4 ml wordt geladen. Dus het voorbeeld van sferoïden gevormd van 1000 cellen per 1,2 x 10 ⁶ cellen in 0,4 ml vertaalt tot een dichtheid van 3 x 10 ⁶ cellen per ml.

1. Het voorbereiden microwells Cellen ontvangen

1. Microputjesplaten zijn steriel zoals voorzien, en mag alleen worden verwijderd uit hun verpakking in een steriele omgeving, zoals een laminaire stroming bioveiligheid kast. Steriliteit moeten in de hele protocol worden gehandhaafd. Mocht steriliteit in het gedrang komen, de putten worden gesteriliseerd met behulp van 70% ethanol in water met behulp van devolgende optionele stappen.
   1. Voeg 0,5 ml 70% ethanol aan elk ongebruikt ook. Sommige microputjes zullen houden luchtbellen, hoewel dit kan worden verminderd door toevoeging van vloeistof aan de ene kant, en te laten verspreiden over het oppervlak, dan laten vallen verticaal op het oppervlak. Vervang deksel.
   2. Terwijl ethanol damp snel eventuele luchtbellen moeten doordringen, als er grote aantallen kan het wenselijk zijn om ze te verwijderen. Centrifugeer gedurende 2 min. bij 2000 x g. Merk op dat het belangrijk ervoor te zorgen de rotor goed evenwicht met deze snelheid.
   3. Met behulp van een lage vergroting omgekeerde microscoop, controleren luchtbellen zijn verwijderd uit de microwells.
   4. Incubeer gedurende 5 minuten met deksel bij kamertemperatuur.
   5. Aspireren ethanol. Plaat kan nu met steriel water of PBS worden gewassen voor onmiddellijk gebruik, of aan de lucht gedroogd voor opslag.
2. Om ervoor te zorgen dat cellen niet interageren met het oppervlak microwell, kan worden bereid onder toepassing van een surfactant. In het algemeen israadzaam deze stap eerst uitgevoerd en vervolgens vergelijken sferoïden gemaakt met en zonder oppervlakteactieve beklede microputjes.
   1. Voeg 0,5 ml spoeloplossing aan elke well. Sommige microputjes zullen houden luchtbellen, hoewel dit kan worden verminderd door toevoeging van vloeistof aan de ene kant, en te laten verspreiden over het oppervlak, dan laten vallen verticaal op het oppervlak. Vervang deksel.
   2. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 2000 xg om luchtbellen te verwijderen. Merk op dat het belangrijk ervoor te zorgen de rotor goed evenwicht met deze snelheid.
   3. Met behulp van een lage vergroting omgekeerde microscoop, controleren luchtbellen zijn verwijderd uit de microwells.
   4. Incubeer gedurende ten minste dertig minuten met deksel bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. Platen kunnen worden opgeslagen bij vier graden met de oppervlakteactieve stof in de putjes totdat ze nodig indien goed afgedicht om uitdroging te voorkomen.
   5. Was plaat met steriel water of PBS onmiddellijk vóór gebruik. Heeft platen niet toete drogen na het coaten.

2. Voorbereiden van Cellen

OPMERKING: De details van celpreparaat zal enigszins variëren met het specifieke celtype onderzocht. We hebben echter deze omstandigheden waargenomen effectief een groot aantal cellen, met inbegrip van de lijnen besproken, alsook menselijke en murine embryonale stamcellen (ESC), humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC), fibroblasten, vermeende primitieve endoderm zijn, en stromale cellen. Andere groepen hebben dit systeem met succes voor een breed scala aan toepassingen, waaronder chondrogenese van mesenchymale stamcellen ⁹ gebruikt, gestandaardiseerde generatie van neurale precursoren van pluripotente stamcellen ^10, toxicologische analyses hepatocyten ¹¹ en evaluatie van het ruggenmerg regeneratie salamanders ^12. De specifieke protocol voor het werken met HT29 cellen wordt hier getoond.

1. Begin met een T75 fles van HT29 cellen, gekweekt in DMEM+ 10% FBS
2. Aspireren groeimedium van kolf en voeg 3 ml trypsine.
3. Incubeer cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C.
4. Stop trypsine digestie door toevoeging van 3 ml groeimedium. Pipetteer een voor celtelling en breng de rest in een 15 ml centrifugebuis.
5. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g.
6. Terwijl het centrifugeren aan de gang is, tellen cellen.
7. Zuig trypsine / medium-mengsel en vervangen door vers groeimedium volume bepaald door de vereiste celdichtheid zoals hierboven berekend.
8. (OPTIE) Leid de celsuspensie door een zeef om eventuele klonten te verwijderen. OPMERKING: Mobiele oogstomstandigheden zal enigszins variëren tussen de lijnen. Als een dissociatie protocol voor bv. passage van de cellen van belang beschikbaar is, moet dat worden gebruikt als uitgangspunt. Met gevoelige cellijnen gebruik van trypsine kan excessieve celdood. In deze gevallen hebben we goede resultaten waargenomen met behulp TrypLE als alternatief dissociatiOp reagens ^8. Als de cellen samengeklonterd tijdens dissociatie en levensvatbaarheid verliezen, kan toevoeging van DNAse de enzymoplossing dit oplossen. Vermindering van dissociatie tijden en met gebruikmaking van een aanwrijven stap te breken celklonten kan ook toenemen levensvatbaarheid.

3. Spheroïde Vorming

OPMERKING: sferoïden worden opgewekt in een diversiteit aan media formuleringen, maar eerste proeven worden uitgevoerd met het medium waarin de cellen gekweekt om de gevolgen van de overgang naar een 3-dimensionale kweeksysteem tegen de gevolgen van wisselende samenstelling van het medium onderscheiden.

1. Voeg 0,4 ml groeimedium aan elk putje.
2. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 2000 xg om luchtbellen te verwijderen. Merk op dat het belangrijk ervoor te zorgen de rotor goed afgesteld bij deze snelheid vóór centrifugatie.
3. Met behulp van een lage vergroting omgekeerde microscoop, controleren luchtbellen zijn verwijderd uit de microwells.
4. Voeg 0,4 mlcelsuspensie op de gewenste dichtheid (hierboven berekend). Meng door en neer te pipetteren, zonder dat er luchtbellen in de microwells. Het is belangrijk dat de cellen gelijkmatig verdeeld over de bron, teneinde consistente sferoïden verkrijgen.
5. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g. Als de plaat niet zelf-niveau tijdens het centrifugeren, kan convectie stromingen die resultaat ontstaan ​​ongelijke verdeling van de cellen over de microwells. Daarom moet de plaat intern in evenwicht alsmede tegen de andere plaat, zodat het gewicht gelijkmatig verdeeld over beide zijden van de plaat drager.

OPMERKING: als bewijs van ongelijke celverdeling wordt gezien, kan het nodig zijn om een ​​kleine hoeveelheid smeermiddel van toepassing op de scharnierpunten op de plaat drager - raadplegen centrifuge fabrikant voor instructies.

OPMERKING: Nadat de cellen zijn in de microwells gecentrifugeerd, ze zijn redelijk weerstandtant om uitwassen van kleine bewegingen van de plaat. Abrupte bewegingen die resulteren in klotsen van het medium moet worden vermeden, maar de overdracht van de plaat uit centrifuge naar microscoop of incubator mag niet leiden tot significante cel verplaatsing.

6. Met behulp van een omgekeerde microscoop, controleert cellen geclusterd binnen de microputjes, en dat ze gelijkmatig verdeeld over de put.
7. Incubeer overnacht bij 37 ° C.
8. Met behulp van een omgekeerde microscoop, observeren het proces van de bolvormige formatie. Sommige cellijnen compacte bolletjes vormen binnen 24 uur, anderen kan het langer duren. De overgang van cluster te aggregeren in HT29-cellen wordt getoond in figuur 2.
9. Recover sferoiden uit de microwells en transfer naar suspensiecultuur door voorzichtig jetting ze uit met een pipet. Als alternatief onderhouden sferoïden in situ met medium vervangen ⁸ - de duur hangt af van hun oorspronkelijke grootte en groeisnelheid, die define het tot ze groeien de microputjes waarin ze werden gevormd.
   1. Om medium vervangen zonder verlies sferoïden zuigen medium aan de rand van de put met een Pasteur pipet. Langzaam breng de punt naar beneden totdat het begint te vloeibaar te trekken uit de meniscus, en volg de meniscus af als het daalt. Voeg dan vers medium tegen de put muur op dezelfde plaats. Enkele sferoïden verloren gaan, maar als medium altijd wordt afgezogen en vervangen in dezelfde positie, dit aantal klein in vergelijking met de grote aantallen in de put blijft.

Results

Sferoïden van meerdere tumorlijnen van uiteenlopende anatomische oorsprong kunnen gemakkelijk worden gegenereerd en naar suspensiekweek geëxtraheerd. Figuur 3 illustreert de vaste groottecontrole verkrijgbaar via deze methode, met zeer gelijkmatige bolvormige populaties onder elke conditie. Duidelijke inter-lijn verschillen in gedrag zijn ook zichtbaar, met HT29 darmkankercellen en TE6 slokdarmkanker cellen die dicht op elkaar gepakte bolletjes met scherp gedefinieerde grenzen, terwijl LNCaP prostaatkankercellen gaf aanleiding tot minder coherent bolletjes met onregelmatige grenzen (zie Overleg voor mogelijke redenen ). De grotere interne krachten in de meer samenhangende aggregaten ook geleid tot ineenstorting een meer symmetrische vorm, zelfs terwijl de microputjes waarin zij zijn gevormd, terwijl de LNCaP aggregaten, vooral in de grotere maat, zichtbaar blijven de vierkante pyramidale geometrie van de microwells. De relatie tussen input mobiele nummers en de Phys ical grootte van de resulterende sferoïde is afhankelijk van een aantal variabelen. Theoretische volumes op basis van het product van het volume per cel en het aantal cellen toegepast kan worden verminderd celverlies, waardoor verlies aan cellen tijdens de eencellige suspensie stadium evenals verlies van uiterst kleine aggregaten kunnen door onvoldoende aantallen buren en uit te grote aggregaten als gevolg van beperkingen en necrose transport in de kern. Grootte zal ook worden beïnvloed door een proliferatie die kunnen optreden tijdens het aggregatieproces. Aangezien deze parameters zal variëren van cellijn tot cellijn, als sferoïden specifieke fysieke afmetingen gewenst zijn het juiste aantal cellen te introduceren moet experimenteel bepaald. Als eerste benadering wordt bolvormige diameter verwachting toenemen met de derdemachtswortel van het aantal cellen opgenomen - bijvoorbeeld een 8-voudige toename in aantal cellen moet resulteren in een verdubbeling van sferoïde diameter.

_content "fo: keep-together.within-page =" altijd ">
Figuur 1. Schema van sferoïde productie. Het microtiterplaat bestaat uit een array van dicht opeengepakte vierkante pyramidale microputjes (625 per cm ² voor de 400 μ m grootte), waarin cellen worden gecentrifugeerd. De cellen worden samengebracht door de hellende zijwanden en de grootte van de verkregen bolvormige wordt geregeld door het variëren van de dichtheid van de celsuspensie gebruikt.

50665fig2highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg "/>
Figuur 2. Assemblage van geclusterd cellen in sferoiden. Sferoïden werden gevormd uit zevenhonderd HT29 cellen per stuk. Onmiddellijk na centrifugeren (A), worden cellen los geclusterd in de bodem van elk microputje. Merk op dat de clusters uniform gecompenseerd naar rechtsonder in dit geval. Dit is aanvaardbaar mits clustergrootten consistent in de array blijven. Indien significante clustergrootte verschillen gezien vanaf de ene zijde van de matrix naar de andere, zie opmerking in stap 3.5. Na incubatie gedurende 24 uur (B), hebben intercellulaire kleefkrachten veroorzaakt de clusters te aggregeren en vormen coherente sferoïden kunnen vervolgens worden geëxtraheerd (C).

r /> Figuur 3. Sferoïden generated in microputjesplaten. Sferoïden gevormd uit zevenhonderd (A, C, E) of vijftienhonderd (B, D, F) HT29 colonkankercellen (A, B), LNCaP-prostaatkankercellen (C, D) of TE6 slokdarmkanker cellen (E, F). Let op de consistentie van sferoïden in een preparaat, en ook verschillen tussen cellijnen - met name de losse LNCaP aggregaten ten opzichte van de dichter gepakt en TE6 HT29 cellen. Schaalbalk vertegenwoordigt 200 micrometer.

	Microwell formaat
	AggreWell 400	AggreWell 40Ex	AggreWell 800
Microwell breedte (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">µm )	400	400	800
Microwells per cm 2	625	625	156.25
Microwells per putje	1200	4700	300
Minimum cellen per microwell *	N / A	N / A	2000
Maximum cellen per microwell *	2000	2000	10.000
Minimum cellen per well *	N / A	N / A	6 x 10 5
Maximum cellen per well *	2.4 x 10 6	9,4 x 10 6	3 x 10 6
1.1.1 - 70% Ethanol volume (ml)	0.5	2.0	0.5
1.2.1 - spoeloplossing volume (ml)	0.5	2.0	0.5
3.2 - Medium preload volume (ml)	0.4	1.6	0.4
3.5 - Mobiele laadvolume (ml)	0.4	1.6	0.4
* Aantallen cellen per microwell zijn slechts een benadering aangezien deze waarde zal variëren met de grootte van de specifieke cellen gebruikt en moet empirisch worden bepaald

Tabel 1. AggreWell opties en protocol wijzigingen.

Discussion

Wij hebben een systeem waarbij grote aantallen uniforme sferoïden worden gegenereerd uit meerdere cellijnen van verschillende bronnen opgesteld. We moeten nog een hechtende cellijn die geen bolletjes vormt wel onder deze omstandigheden tegenkomen. We hebben eerder waargenomen cel verlies in populaties gevoelig voor anoikis ^5,8, maar tot op heden deze kwestie is niet ontstaan ​​met tumorlijnen. Het systeem is willekeurig schaalbaar oppervlak met gedrag consistent microputjes in 24 putjes en 6 putjes, alsmede prototype bioreactoren met 50.000 microputjes elk in ontwikkeling.

Indien sferoïde asymmetrie een zorg, kan de incubatietijd in stap 4.8 worden verhoogd tot twee of drie dagen. Sferoïden ook gedurende een periode na extractie van de microputjes symmetrie verhogen, maar in dat geval moet worden cultuur dichtheden voldoende laag te houden, als sferoïden in contact met elkaar will vaak samensmelten tot grotere structuren. Daarom hebben we eerder behandelde culturen binnen de microputjes waarin de aggregaten gevormd bij de belangrijkste beperking door de grootte van de sferoïde. Hierdoor is een functie van zowel de groeisnelheid en begingrootte ⁸ en bij verlenging cultuur binnen de microwell plaat wordt voorzien, moet dit worden beschouwd tevoren. Opties om wildgroei te voorkomen, mocht dat toch gebeuren, onder andere ook te beginnen met kleinere bolletjes, of in dienst van de grotere microwells van de AggreWell 800 plaat.

Indien sferoïden niet toenemen in samenhang verloop van tijd een potentiële oorzaak celdood. Vooral in grotere aggregaten van zeer metabolisch actieve cellen, kan massa beperkingen vervoer over de levering van zuurstof en essentiële voedingsstoffen resulteren in een necrotische kern ² - dus een niet-samenhangend spheroïde kan slechts een gevolg van overmatig celdood zijn. Als alternatief, metingen van de mechanische samenhangning van sferoïden zijn gebruikt om intercellulaire bindingskrachten beoordelen in verhouding tot het metastatisch potentieel van een bepaalde cellijn ^13. Het zou interessant zijn om de relatie tussen de bolvormige vorm en metastatische potentieel te onderzoeken, misschien met behulp van morfometrische parameters zoals rondheid en omtrek-verhouding.

Naast het onderzoeken van de mechanische en morfometrische eigenschappen van sferoïden, opstelling in de microputjes systeem maakt grootschalige productie van gemengde samenstelling sferoïden, bestaande uit combinaties van meerdere celtypes en / of biomaterialen ^6,7. De interacties van tumorcellen met andere celtypen belangrijk nauwer modelleren het gedrag van tumoren in vivo ^14, dus kan het interessant zijn om sferoïden genereren van tumorcellen in combinatie met fibroblasten en endotheelcellen, bijvoorbeeld. Microdeeltjes van biomateriaal kan ook worden opgenomen, en kan invloed spheroid eigenschappen zowel direct door hun interacties met cellen ^7,15, en ook als reservoir voor de gecontroleerde afgifte van groeifactoren en cytokines in het inwendige van de sferoïde ^16.

Als er een bezorgdheid over steriliteit, bijvoorbeeld bij het werken met een microwell plaat waarin sommige putten eerder gebruikt, die enige tijd doorgebracht in een incubator als onderdeel van een voorgaande experiment, de putjes worden gesteriliseerd met 70% ethanol in water.

Zodra sferoïden zijn gevormd, kunnen zij ook worden uit de overblijvende niet opgenomen cellen gescheiden door het passeren van de schorsing meer dan een cel zeef. Individuele cellen zal passeren, terwijl de bolletjes blijven behouden. Als de sferoïde wordt vermoed afstoten potentieel metastatische cellen in de loop van de cultuur, kan het wenselijk deze procedure meerdere malen te zijn - aanvankelijk van feitelijke cellen te verwijderen, en vervolgens purifie isolerend populaties van de cellen afgegeven door de bolletjes.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
AggreWell 400 plate	StemCell Technologies Inc.	27845/27945
Rinsing Solution	StemCell Technologies Inc.	07010
Cell strainer (37 µm)	StemCell Technologies Inc.	27215
PBS	VWR / LONZA	CA12001-676
Trypsin-Versene (EDTA)	VWR / LONZA	CA12001-660
DMEM	VWR / LONZA	CA12002-212
FBS	VWR / LONZA	CA-95042-112
TrypLE	Invitrogen / Life Technologies	12605010
Inverted microscope	VWR / Motic	CA19000-610
Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates	VWR / Beckman	CABKA99465, CABK369704, CABK392806
Laminar flow biosafety cabinet	ESBE / Baker	BKR-SG603AHEUVSP