Methodenartikel

Microfabricage van Nanoporeuze Gold Patronen voor Cell-materiaal Interaction Studies

DOI:

10.3791/50678

⸱

15 juli 2013

 ,  ,  ,  , 
1Department of Electrical and Computer Engineering, University of California, Davis , 2Department of Chemical Engineering and Materials Science, University of California, Davis , 3Department of Biomedical Engineering, University of California, Davis

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij rapporteren over technieken micropattern nanoporeuze gouden dunne films via stencilafdruk en fotolithografie, alsook werkwijzen cultuur brengen van cellen op microschaal vervaardigde patronen. Verder beschrijven we beeld analysemethoden morfologie van het materiaal en de gekweekte cellen met behulp van scanning elektronenmicroscopie en fluorescentie microscopie technieken karakteriseren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nanostructuurmaterialen met functie maten in tientallen nanometers hebben versterkt de prestaties van verschillende technologieën, zoals brandstofcellen, biosensoren, biomedische apparaat coatings en drug delivery gereedschappen. Nanoporeuze goud (np-Au), geproduceerd door een nano-schaal zelf-assemblage proces, is een relatief nieuw materiaal dat grote effectieve oppervlak, hoge elektrische geleidbaarheid en katalytische activiteit vertoont. Deze eigenschappen hebben np-Au maakte een aantrekkelijk materiaal om wetenschappelijke gemeenschap. De meeste studies over np-Au dienst macro-schaal monsters en zich richten op de fundamentele wetenschap van de stof en de katalytische en sensor toepassingen. De macro-schaal exemplaren beperken potentiële np-Au in geminiaturiseerde systemen, waaronder biomedische apparaten. Om deze problemen aan te pakken, hebben we in eerste instantie beschrijven twee verschillende methoden om micropattern np-Au dunne films op harde ondergronden. De eerste methode maakt gebruik van handmatig geproduceerd stencil maskers voor het creëren van millimeter-schaal np-Au patronen, while de tweede methode maakt gebruik van lift-off fotolithografie op patroon sub-millimeter-schaal patronen. Als np-Au dunne films verkregen door sputter-afzetting verenigbaar zijn met conventionele microfabricage technieken, waardoor vatbaar voor gemakkelijke integratie in microsystemen. Deze systemen omvatten elektrisch-adresseerbare biosensor platformen die profiteren van de hoge effectieve oppervlak, elektrische geleidbaarheid, en goud-thiol-gebaseerde oppervlak bioconjugatie. We beschrijven celkweek, immunokleuring en beeldverwerkingstechnieken te np-Au van interactie met zoogdiercellen, wat een belangrijke parameter prestaties van sommige biosensoren kwantificeren. We verwachten dat de hier getoonde technieken integratie van np-Au zal helpen platforms op verschillende lengteschalen en in talrijke toepassingen, zoals biosensoren, opslagsystemen en katalysatoren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Materialen met nano-schaal functies hebben aangetoond belofte in het verbeteren van diverse toepassingen, zoals brandstofcellen 1, Sensors 2,3 En biomedische apparaten 4,5. Een relatief nieuw materiaal nanoporeuze gold (np-Au), die wordt geproduceerd door een nano-schaal zelfassemblage proces. De voorloper van np-Au is een gouden legering die meestal bestaat uit zilver op 60% tot 80% door atomaire percentage. Kort, de karakteristieke open poriën nanostructuur is het resultaat van herschikking van goudatomen clusters als zilver wordt opgelost door een sterk zuur ( Bv Salpeterzuur 70%) of op grond van een elektrochemische potentiaal 6-8. Np-Au profiteert van verschillende wenselijke eigenschappen, waaronder grote effectieve oppervlak, hoge elektrische geleidbaarheid, gevestigde oppervlak functionalisering technieken, en biocompatibiliteit 9. Ook al is er sprake van een snelle uitbreiding van de studies over np-Au, de meeste van hen richten zich op de mechanische eigenschappen np-Au's 10,11, Katalytische activiteit 12 En biomoleculaire sensing prestaties 13-15. Terwijl de wenselijke eigenschappen zijn zeer nuttig voor verschillende biomedische hulpmiddelen 16,17, Zijn de toepassingen op dit gebied beperkt gebleven. Een mogelijke reden hiervoor is dat de meeste studies hebben hoofdzakelijk gebruikt macroschaal specimens ( Bv Vellen, folies, en blokken) en de technieken voor het opnemen van np-Au in geminiaturiseerde systemen zijn gebleven ontoereikend. In feite zijn er slechts een handvol voorbeelden van het gebruik van conventionele microfabricage technieken die np-Au films in dienst 16-20. Met de komst van miniaturisatie technologie en de noodzaak van nieuwe biomedische tools, is het van cruciaal belang om te kunnen integreren in nieuwe materialen apparaten. Dit vereist gewoonlijk dat de materialen kunnen worden gedeponeerd en met conventionele microfabricage technieken patroon. Bovendien, snelle kwantificering van celmateriaal interacties is vaak noodzakelijk om de biocompatibiliteit van een nieuw materiaal te evalueren. Het doel van deze paper is om de basistechnieken te tonen aan micropattern np-Au films en kwantificeren zowel nanostructuur en cel-materiaal interacties via digitale beeldverwerking.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Nanoporeuze Gold Fabrication

  1. Clean substraten in Piranha oplossing
    1. Voeg 25 ml waterstofperoxide (30%) en 100 ml zwavelzuur (96%) in een kristallisatie-schaal en verwarm het mengsel tot 65 ° C op een kookplaat. LET OP: De vloeistoffen zijn extreem corrosief en moet met zorg worden behandeld. De verbruikte oplossing mag niet worden opgeslagen in een verzegelde container, aangezien deze kan exploderen.
    2. Plaats 1-inch met 3 inch microscoop dia's in het mengsel met behulp van zuurbestendige tang en reinig ze gedurende 10 minuten. Gebruik een porseleinen immunostaining boot voor batch-reinigen van kleine dekglaasjes. Behandel kleine coverslips met lucht plasma bij 10 W gedurende 30 seconden voorafgaand aan onderdompeling in de oplossing.
    3. Spoel de schoongemaakte monsters kristallisatie gerechten stromend gedeïoniseerd (DI) water gedurende 3 minuten. Föhnen monsters met een stikstof geweer over niet-pluizende doeken.
  2. Bereid stencilmasker (Methode 1: Gebruik deze voor het creëren van millimeter-schaal patronen)
    1. Punch 250 urn dikke siliconen elastomeer platen met biopsie stoten en / of incisie uit regio's met een scalpel over een semi-harde kunststof oppervlak. Reinig de verwerkte elastomeer vellen in 70% isopropanol en droog met stikstof pistool.
    2. Plaats de geperforeerde plaat op een stofvrije cleanroom handdoek en lijn de piranha-gereinigde dekglaasjes over het stencil met het monster oppervlak naar het stencil.
  3. Patroon lift-off fotolak (Methode 2: Gebruik dit voor het maken van sub-millimeter-schaal patronen)
    1. Plaats een piranha-gereinigde microscoopdia op draaiende boorkop en afblazen eventuele deeltjes met stikstof pistool. Doseer 1,5 ml van adhesie promotor (hexamethyldisilazaan) op het glaasje met een plastic pipet. Verspreid de promotor door het draaien van de glijbaan achtereenvolgens bij 500 rpm gedurende 5 sec en 1500 rpm gedurende 30 sec. Bak de dia op een kookplaat bij 115 ° C gedurende 7 minuten en laat het afkoelen gedurende 5 minuten.
    2. Doseer 4 ml fotoresist op het glaasje (3 inch by 1-inch). Verspreid de fotolak door het draaien van de dia met hetzelfde protocol als voor de hechting promotor. Bak de fotolak op een kookplaat bij 115 ° C gedurende 1,5 minuten en laat het afkoelen gedurende 10 minuten.
    3. Expose de fotolak beklede schuif met UV-licht (intensiteit: 22 mW / cm 2) door middel van een transparant masker voor 15 sec. Bak de fotoresist op een verwarmingsplaat bij 115 ° C gedurende 1,5 min en 45 min wachten. Los de blootgestelde fotoresist in de ontwikkelaar ten minste 3,5 minuten. Grondig met DI-water. Inspecteer de ontwikkelde patronen onder een optische microscoop.
  4. Aanbetaling voorloper metalen om np-Au dunne films te produceren
    1. Laad de monsters in een sputterende machine die onafhankelijk van elkaar kunnen storten goud, zilver en chroom. Sputter-reinigen van de monsters gedurende 90 sec bij 50 W onder 25 mTorr argon verwerking sfeer voordat metalen afzetting.
    2. Sputter chroom gedurende 10 minuten bij 300 W onder argon 10 mTorr. Sputter goud voor 90 sec bij 400 W un10 mTorr der argon. Co-sputteren goud en zilver voor 10 min met zilver op 200 W en Au vermogen bij 100 W. Schakel goud sputteren bron ongeveer 10 seconden voor het uitschakelen van de zilveren sputteren bron.
  5. Verkrijgen voorloper metalen micropatterns
    1. Ultrasone trillingen fotolak beklede monsters ~ 180 ml fotolakstripper voor 10 cycli van 20 sec sonicatie en 2 minuten pauze tussen de cycli. Spoel de monsters met DI-water en droog met een stikstof pistool. Inspecteer de metalen patronen onder een microscoop.
    2. Schil de elastomeer stencil van niet-fotolak beklede monsters met behulp van twee pincet om het afgezette metaal onthullen.
  6. Dealloy voorloper metaal en modify nanostructuur via thermische behandeling
    1. Vul een bekerglas 200 ml met 170 ml salpeterzuur (70%) en handhaven temperatuur van de oplossing bij 55 ° C op een kookplaat. LET OP: Het salpeterzuur is uiterst corrosief en moeten worden behandeld met de juiste beschermingsmiddelen.
    2. Behandel kleine coverslips met lucht plasma bij 10 W gedurende 30 seconden voorafgaand aan de onderdompeling in salpeterzuur. Plaats 1-inch met 3 inch microscoop dia's in de beker met behulp van zuurbestendige pincet en dealloy ze gedurende 15 minuten. Gebruik een porseleinen immunostaining boot voor batch-dealloying kleine dekglaasjes.
    3. Spoel de dealloyed monsters door ze achtereenvolgens onder te dompelen in twee bekers gevuld met verse DI water drie keer. Bewaar monsters in DI-water en elke dag vervang het water met verse DI water voor minstens een week. Föhnen monsters met een stikstof geweer over niet-pluizende handdoeken voor gebruik.
    4. Laad monsters op een schone siliciumwafel in een snelle thermische apparatuur. Regel de temperatuur tussen 200 ° C en 450 ° C en Stijgingssnelheid tot 10 ° C / sec. Expose de monsters aan de voorgeschreven temperatuur gedurende 10 min onder stikstof omgevingstemperatuur. Laat de kamer afkoelen (<100 ° C) en verwijder de monsters. Als alternatief, langzaam plaats de monsters op de kookplaat voor thermische treatment.

2. Celkweek

  1. Bereid np-Au monsters voor celkweek
    1. Plaats np-Au monsters in polystyreen gerechten en behandelen met lucht plasma bij 10 W voor 30 seconden en breng de monsters naar 24-well weefselkweek platen.
    2. Voeg 500 ul compleet kweekmedium (Dulbecco's Modified Eagle Medium met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline / streptomycine) in elk putje. Bewaren in een bevochtigde incubator bij 37 ° C en 5% CO2 totdat het zaaien van de cellen (<1 uur).
  2. Handhaven, passage, en zaad cellen
    1. Handhaaf cellen plaats (in casu NIH 3T3-fibroblasten of murine astrocyten) in T75 flessen met kweekmedium en passage wanneer cellen 70% confluent.
    2. Voor passage van de cellen, verwijder media uit de kolf, was tweemaal met 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), voeg 2 ml 1x trypsine / EDTA en incubeer tot de cellen los (ca. 5 min.). Voeg 3 ml vers medium enCentrifugeer bij 1200 rpm gedurende 3 minuten. Aspireren supernatant en schorten de pellet in 2 ml media.
    3. Verwijder het verbruikte medium uit de putjes en zaden de cellen op de dekglaasjes bij een dichtheid van 25.000 cellen / cm 2 met een eindvolume van 1 ml. Schud de cultuur plaat forward-back en rechts-links om een ​​uniforme coating van cellen zorgen over de monsters. Incubeer de cellen tot de analyse, terwijl dagelijks inspecteren.

3. Cel en Materiaalanalyse

  1. Vlek cellen om cytoskelet en kernen te visualiseren
    1. Verwijder besteed media uit putten en cellen twee maal wassen met PBS. Fix cellen in 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 15 minuten.
    2. Bereid kleuroplossing van 300 nM Alexa Fluor 488 falloïdine in PBS met 1% runderserumalbumine.
    3. Was de cellen tweemaal met PBS, en doorlaatbaar ze in 500 pl 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 5 minuten.
    4. Twee keer wassen cellen met PBS en overbrengen naar putten schoon te maken. Blot 50-200 ul vlekken oplossing op de monsters en op te slaan in het donker gedurende 20 minuten.
    5. Was de cellen met PBS en tegenkleuring met met 3 nM DAPI in PBS gedurende 5 minuten.
    6. Was de cellen met PBS, en duik in gedemineraliseerd water voor de montage op glazen dekglaasjes met montage media en afdichting met heldere nagellak.
  2. Acquire beelden van np-Au samples en celculturen op np-Au oppervlakken
    1. Afbeelding np-Au oppervlakken met scanning elektronenmicroscoop (SEM) met 50.000 X vergroting bij 10 kV elektron energie met behulp van secundaire elektronen detector.
    2. Leg samengestelde celbeelden op verschillende plekken op de monsters met een omgekeerde fluorescentie microscoop bij 10X vergroting met de geschikte filter blokjes.
  3. Proces beelden naar porie en celmorfologie bepalen
    1. Open afbeeldingen in ImageJ en opgesplitst in afzonderlijke kanalen, indien van toepassing. Zetten de beelden naar 8-bit, aftrekken van de achtergrond, en glad hen door het mediaan filtering. Pas de drempel handmatig of door ingebouwde drempelen algoritmen om de poriën (vides) en cellichamen / kernen te markeren.
    2. Gebruik waterscheiding commando om samengevoegde poriën of cellen te scheiden. Stel deeltjesanalyse parameters en voer de volgende opdracht om het aantal deeltjes, gemiddelde oppervlakte, en procent dekking door deeltjes onttrekken. Gebruik DAPI gekleurde cel beelden voor cel tellen en phalloidin-gekleurde cel beelden voor het kwantificeren procent cel dekking.
    3. Wijzig de opgenomen macro bestanden naar batch analyse van meerdere afbeeldingen uit te voeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Figuur 1 schetst de belangrijkste procedurele stappen, waaronder het creëren van de np-Au patronen, het kweken van cellen, het kwantificeren van de nanostructuur, en karakteriseren celmorfologieën. Het elastomeer stencil figuur 2a (geplaatst) wordt gebruikt voor het maken van np-Au patronen in de beelden hieronder. Figuur 2b is een foto van het porselein boot batch processing specimens. Figuur 2c toont de kleurverandering van het afgezette metaal patron...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We laten twee verschillende technieken om micropattern np-Au films voor het uitbreiden van het gebruik van deze films in microsystemen en biologische studies. Sputter-coating goud en zilver is een veelzijdige methode voor np-Au patronen, zoals sputteren is compatibel met conventionele microfabricage processen en de legering samenstelling en dikte kan gemakkelijk worden geregeld door de afzonderlijke sputteren gun bevoegdheden (voor goud en zilver targets) en respectievelijk de afzetting tijd. Typische np-Au laagdikte be...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Auteurs hebben geen tegengesteld belang.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O. Kurtulus en D. Dimlioglu worden ondersteund door een universiteit van Californië Laboratorium Toeslagen Research Program Award 12-LR-237197. P. Daggumati wordt ondersteund door een University of California Davis Research Investeringen in de Sciences & Engineering (RISE) Award. CA Chapman wordt ondersteund door een Ministerie van Onderwijs Graduate Bijstand gebieden onder nationale Need Fellowship. Dit werk werd ondersteund door UC Lab Vergoedingen Research Program, UC Davis RISE, en UC Davis College of Engineering start-up middelen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Gold targetLeskerEJTAUXX403A2Voorloper van legering voor het produceren van np-Au
Chrome targetLeskerEJTCRXX353A2Hechtlaag
Silver targetLeskerEJTAGXX403A2Voorloper van legering voor het produceren van np-Au
Porseleinen bootThomas Scientific8542E40Gebruikt voor het verwerken van kleine monsters
SalpeterzuurSigma-Aldrich43873Gebruikt bij 70% voor delegering
ZwavelzuurJ.T Baker7664-93-9Gebruikt bij 96% voor piranha-reiniging
WaterstofperoxideJ.T Baker7722-84-1Gebruikt bij 30% voor piranha-reiniging
Biopsie-punchesTed Pella150xxBeschikbaar in verschillende maten
Siliconen elastomeer vellenRogers CorporationHT 6240Beschikbaar in verschillende diktes
HexamethyldisilazaneSigma-Aldrich440191-100MLGebruikt als adhesieve promotor voor positieve resist
Microposit MF CD26Shipley38490Positieve fotoresist ontwikkelaar
PRS 3000J.T BakerJT6403-5Positieve fotoresist stripper
Circulaire glazen deksels (12 mm)Ted Pella26023Gebruikt als substraat voor metaalpatroon en celkweek
Glazen platen (1 x 3 inch)Ted Pella26007Gebruikt als substraat voor metaalpatroon
Kapton polyimide tapeVWR82030-950Gebruikt voor het bevestigen van elastomeer
TransparantiemaskersOutput CityGebaat in fotolithografie http://www.outputcity.com/
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-32GGebruikt voor het activeren van glazen oppervlakken
SputtermachineKurt J. LeskerLAB18Gebruikt voor het afzetten van metalen

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Arico, A. S., Bruce, P., Scrosati, B., Tarascon, J. M., Van Schalkwijk, W. Nanostructured materials for advanced energy conversion and storage devices. Nature Materials. 4, 366-377 (2005).
  2. Roy, S., Gao, Z. Nanostructure-based electrical biosensors. Nano Today. 4, 318-334 (2009).
  3. Chen, C. L., et al. DNA-decorated carbon-nanotube-based chemical sensors on complementary metal oxide semiconductor circuitry. Nanotechnology. 21, 095504(2010).
  4. Lu, J., Rao, M. P., MacDonald, N. C., Khang, D., Webster, T. J. Improved endothelial cell adhesion and proliferation on patterned titanium surfaces with rationally designed, micrometer to nanometer features. Acta Biomaterialia. 4, 192-201 (2008).
  5. Wagner, V., Dullaart, A., Bock, A. K., Zweck, A. The emerging nanomedicine landscape. Nat. Biotechnol. 24, 1211-1218 (2006).
  6. Weissmüller, J., Newman, R., Jin, H., Hodge, A., Kysar, J. Theme Article - Nanoporous Metals by Alloy Corrosion: Formation and Mechanical Properties. Materials Research Society Bulletin. 34, 577-586 (2009).
  7. Erlebacher, J., Aziz, M., Karma, A., Dimitrov, N., Sieradzki, K. Evolution of nanoporosity in dealloying. Nature. 410, 450-453 (2001).
  8. Okman, O., Lee, D., Kysar, J. W. Fabrication of crack-free nanoporous gold blanket thin films by potentiostatic dealloying. Scripta Mater. 63, 1005-1008 (2010).
  9. Seker, E., Reed, M., Begley, M. Nanoporous Gold: Fabrication, Characterization, and Applications. Materials. 2, 2188-2215 (2009).
  10. Biener, J., et al. Size effects on the mechanical behavior of nanoporous Au. Nano Lett. 6, 2379-2382 (2006).
  11. Senior, N., Newman, R. Synthesis of tough nanoporous metals by controlled electrolytic dealloying. Nanotechnology. 17, 2311-2316 (2006).
  12. Zielasek, V., et al. Gold catalysts: Nanoporous gold foams. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 8241-8244 (2006).
  13. Wittstock, A., Biener, J., Bäumer, M. Nanoporous gold: a new material for catalytic and sensor applications. PCCP. 12, 12919-12930 (2010).
  14. Shulga, O., et al. Preparation and characterization of porous gold and its application as a platform for immobilization of acetylcholine esterase. Chem. Mater. 19, 3902(2007).
  15. Shulga, O., Zhou, D., Demchenko, A., Stine, K. Detection of free prostate specific antigen (fPSA) on a nanoporous gold platform. The Analyst. 133, 319-322 (2008).
  16. Seker, E., et al. The fabrication of low-impedance nanoporous gold multiple-electrode arrays for neural electrophysiology studies. Nanotechnology. 21, 125504(2010).
  17. Seker, E., Berdichevsky, Y., Staley, K. J., Yarmush, M. L. Microfabrication-Compatible Nanoporous Gold Foams as Biomaterials for Drug Delivery. Advanced Healthcare Materials. 1, 172-176 (2012).
  18. Okman, O., Kysar, J. W. Microfabrication of Nanoporous Gold. Nanoporous Gold: From an Ancient Technology to a High-Tech Material. 22, 69(2012).
  19. Lee, D., et al. Microfabrication and mechanical properties of nanoporous gold at the nanoscale. Scripta Mater. 56, 437-440 (2007).
  20. Seker, E., et al. The effects of post-fabrication annealing on the mechanical properties of freestanding nanoporous gold structures. Acta Mater. 55, 4593-4602 (2007).
  21. Parida, S., et al. Volume change during the formation of nanoporous gold by dealloying. Phys. Rev. Lett. 97, 35504-35506 (2006).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Microfabricatietechniekenstencilmaskeringfotolithografische lift offsputterdepositiedeslegering met salpeterzuurcelkweekcompatibiliteitfluorescentiemicroscopiescanning elektronenmicroscopiekwantificering van beeldanalyse

Gerelateerde artikelen