Gelijktijdige Multicolor beeldvorming van biologische structuren met fluorescentie Fotoactivatie Lokalisatie Microscopie

Summary

We demonstreren het gebruik van fluorescentie foto activerings lokalisatie microscopie (FPALM) om gelijktijdig meerdere soorten fluorescerend gelabelde moleculen binnen cellen af te beelden. De beschreven technieken leveren de lokalisatie op van duizenden tot honderdduizenden individueel fluorescent gelabelde eiwitten, met een precisie van tientallen nanometer binnen enkele cellen.

Abstract

Localisatie-gebaseerde superresolutiemicroscopie kan worden toegepast om een ruimtelijke kaart (afbeelding) te verkrijgen van de verdeling van individueel fluorescent gelabelde enkele moleculen binnen een monster met een ruimtelijke resolutie van tientallen nanometers. Door gebruik te maken van fotoactiveerbare (PAFP) of fotoswitchbare (PSFP) fluorescente eiwitten gefuseerd met eiwitten van belang, of organische kleurstoffen geconjugeerd aan antilichamen of andere moleculen van belang, kan fluorescentiefotoactiveringslocalisatiemicroscopie (FPALM) tegelijkertijd meerdere soorten moleculen binnen enkele cellen afbeelden. Door de volgende aanpak te gebruiken, worden populaties van grote aantallen (duizenden tot honderdduizenden) van individuele moleculen in enkele cellen afgebeeld en gelocaliseerd met een precisie van ~10-30 nm. De verkregen gegevens kunnen worden toegepast om de nanoschalige ruimtelijke verdelingen van meerdere eiwitsoorten binnen een cel te begrijpen. Een belangrijk voordeel van deze techniek is de dramatische toename van ruimtelijke resolutie: terwijl diffractie de resolutie beperkt tot ~200-250 nm in conventionele lichtmicroscopie, kan FPALM lengteschalen meer dan een orde van grootte kleiner afbeelden. Aangezien veel biologische hypothesen betrekking hebben op de ruimtelijke relaties tussen verschillende biomoleculen, kan de verbeterde resolutie van FPALM inzicht bieden in vragen over cellulaire organisatie die eerder ontoegankelijk waren voor conventionele fluorescentiemicroscopie. Naast het beschrijven van de methoden voor monstervoorbereiding en data-acquisitie, beschrijven we hier de optische opstelling voor FPALM. Een extra overweging voor onderzoekers die superresolutiemicroscopie willen doen, is de kosten: in-house opstellingen zijn aanzienlijk goedkoper dan de meeste commercieel verkrijgbare beeldvormingsmachines. Beperkingen van deze techniek omvatten de noodzaak om de markering van moleculen van belang binnen celmonsters te optimaliseren, en de behoefte aan post-processing software om resultaten te visualiseren. We beschrijven hier het gebruik van PAFP en PSFP expressie om twee eiwitsoorten in vaste cellen af te beelden. Uitbreiding van de techniek naar levende cellen wordt ook beschreven.

Introduction

Terwijl cellulaire structuren bestaan op een breed scala aan ruimtelijke schalen, is fluorescentie-beeldvorming van cellulaire organisatie op lengte-schalen kleiner dan ~250 nm beperkt in conventionele microscopie vanwege de fysische beperking van de diffractielimiet. Deze limiet werd overwonnen met de komst van fluorescentiefotoactiveringslokalisatiemicroscopie (FPALM¹) en vergelijkbare technieken^2,3, die grote aantallen individuele moleculen met een nauwkeurigheid van ~10 nm kunnen lokaliseren, om beelden te genereren met een resolutie van een paar tientallen nanometer. FPALM is gebaseerd op het gebruik van optische controle om subsets van moleculen te activeren en te inactiveren (voor een volledige beschrijving van FPALM, en instructies over hoe dit beeldvormingssysteem te implementeren, zie Gould et al.⁴). Deze techniek maakt het mogelijk om de ruimtelijke verdelingen van hele populaties van enkele moleculen te karteren, waardoor biologische structuren worden opgehelderd op lengteschalen variërend van tientallen nanometer tot tientallen micrometer. Lokalisatie-gebaseerde superresolutiemicroscopie (hierna genoemd lokalisatiemicroscopie) is nu aangepast om een reeks biologische vragen aan te pakken, met technologische ontwikkelingen die bijvoorbeeld het beeldvormen van individuele moleculaire oriëntaties mogelijk maken met polarisatie FPALM, of P-FPALM⁵, de fluorescentiebeeldvorming van enkele moleculen in drie dimensies met Biplane FPALM⁶ of andere technieken^7-9, en de superresolutie fluorescentiebeeldvorming van enkele moleculen in levende cellen^10-12. Lokalisatiemicroscopie is ook toegepast op de beeldvorming van meerdere soorten in vaste cellen^13-16. Onlangs zijn drie eiwitsoorten gelijktijdig afgebeeld met FPALM in zowel vaste als levende cellen¹⁷. Lokalisatiemicroscopie kan monsters afbeelden die op verschillende manieren zijn gelabeld: voorbeelden zijn eiwitten die tot expressie worden gebracht met PAFP of PSFP-fusietags, antilichamen of moleculen gelabeld met verkapte organische kleurstoffen, of conventionele organische kleurstoffen. Hoewel het gebruik van conventionele fluorescerende kleurstoffen het labelen van eiwitten mogelijk maakt in afwezigheid van een fusie-eiwit-tag, vereisen de voorwaarden die over het algemeen vereist zijn voor het gebruik van niet-verkapte organische kleurstoffen in superresolutiebeeldvorming dat monsters worden ondergedompeld in reducerende buffers². Bovendien vereist de intracellulaire levering van antilichaam-kleurstofresten doorgaans dat cellen worden gefixeerd en hun membranen worden gepermeabiliseerd, of vereist dat levende cellen permeabel worden gemaakt door middel van elektroporatie of enige andere middelen. De vereisten voor reducerende bufferomstandigheden en membraanpermeabilisatie beperken de geschiktheid van organische kleurstoffen voor levende celbeeldvorming, hoewel recente ontwikkelingen hebben gezorgd voor effectief gebruik van HaloTags en FPALM om membraanstructuren af te beelden¹⁸.

FPALM was de eerste lokalisatiemicroscopietechniek die werd toegepast op levende cellen¹⁰. In levende cellen, naast het verstrekken van een tijdsafhankelijke ruimtelijke kaart van de locaties van gelabelde moleculen, kan FPALM enkele moleculen over meerdere frames volgen, en moleculaire trajecten bepalen over tijdschalen van milliseconden¹⁹. Dus, FPALM biedt toegang tot redelijk korte tijdschalen en nanoschaalresolutie.

Multicolor FPALM kan worden gebruikt voor een verscheidenheid aan verschillende sondes, inclusief fotoactiveerbare eiwitten en organische verkapte of niet-verkapte kleurstoffen. We geven hier details over het protocol en de opstelling voor de gelijktijdige beeldvorming van twee fluorescerende eiwitsoorten, Dendra2 en PAmCherry. We rapporteren de resultaten van de beeldvorming van PAmCherry geconjugeerd aan beta-actine (PAmCherry-actine) en Dendra2 geconjugeerd aan influenza hemagglutinine (Dendra2-HA) in NIH-3T3 fibroblasten. Componenten die in de opstelling worden beschreven, kunnen worden uitgewisseld voor andere hardware die meer geschikt is voor de beeldvorming van andere sondes. Waar dit het geval is, hebben we geprobeerd expliciet te zijn in de tekst.

Multicolor FPALM is ideaal voor het rapporteren van de ruimtelijke verdelingen van meerdere eiwitsoorten in levende of vaste cellen. Deze techniek is vooral geschikt voor het onderzoeken van ruimtelijke en/of dynamische relaties op nanometerlengteschalen, hoewel beelden lokalisatie zullen rapporteren op een reeks lengteschalen, van tientallen nanometer tot tientallen micrometer. Een belangrijk voordeel van multicolor FPALM is dat de opstelling relatief goedkoop is om te bouwen, en zeer flexibel voor gebruik met verschillende sondecombinaties. Het proces van constructie en kalibratie van het systeem uit componenten biedt ook aanzienlijk begrip van factoren die de kwaliteit en interpreteerbaarheid van de gegevens, en dus het onderzoeksresultaat, kunnen aantasten. We beschrijven hier de methoden voor de optische opstelling, monstervoorbereiding en gegevensverwerving van meerdere eiwitsoorten, met PSFP en PAFP-fusieconstructies, met behulp van FPALM. Hoewel dit protocol de analyse van vaste cellen beschrijft, zijn deze procedures gemakkelijk toepasbaar op de beeldvorming van levende cellen.

De hier beschreven optische opstelling is ideaal voor de gelijktijdige beeldvorming van de PSFP Dendra2 en de PAFP PAmCherry. Veel andere sondes kunnen worden gebruikt voor multicolorbeeldvorming; echter, de precieze vereiste componenten kunnen variëren, afhankelijk van de excitatie- en emissiespectra van de gekozen sondes. Keuzes van dichroïsche spiegels, filters en lasergolflengten moeten worden gemaakt op basis van deze overwegingen.

Protocol

Let op: Een diagrammatische weergave van optische componenten die in dit protocol worden vermeld, is te vinden in Figuur 1.

1. Voorbereiding van celmonsters

1. Plaats cellen met een geoptimaliseerde dichtheid (voor NIH-3T3 cellen, dit is ongeveer 2-5 x 10⁴ cellen/cm²) in putjes van een 8-putjes kamer. Cellen moeten in compleet medium worden geplaatst dat geschikt is voor het celtype, hoewel het medium moet worden gemaakt zonder antibiotica en zonder fenol rood, wat bijdraagt aan achtergrondfluorescentie. Merk op dat de omstandigheden voor celexperimenten, zoals het optimale bereik van passages, kunnen verschillen voor individuele cellijnen.
2. Incubeer cellen gedurende 24 uur bij 37 °C en 5% CO₂ (of onder voorwaarden die geschikt zijn voor het celtype) om cellen te laten hechten aan de dekglas. Transfecteer cellen met endotoxine-vrij DNA voor elk van twee eiwitsoorten constructies (in dit geval DNA voor PAmCherry-actine en Dendra2-HA). Bedek het monster met lichtdicht materiaal zoals aluminiumfolie. Transfectie moet putjes met beide DNA-constructies omvatten, en putjes met slechts een van elk van deze constructies.
3. Incubeer gedurende 4-6 uur, 37 °C en 5% CO₂ (of onder voorwaarden die geschikt zijn voor het celtype), voordat overgeschakeld wordt naar compleet medium (met antibiotica, zonder fenol rood) en verder incuberen gedurende 16-48 uur om cellen toe te laten de gewenste eiwitten te produceren.
   1. Cellen kunnen worden gefixeerd door drie keer te wassen met fosfaat gebufferd zout (PBS), en vervolgens 15 min bij RT in te kweken met 4% paraformaldehyde (PFA) (VOORZICHTIG: Toxisch) in PBS, en vervolgens nog 3x met PBS te wassen. Afhankelijk van de eiwitten van belang, kan deze fixatie resulteren in een aanzienlijke pool van getagde moleculen die nog steeds mobiel zijn. Om de mobiliteit verder te verminderen, omvatten alternatieve fixatiemethoden het gebruik van gekoeld 100% methanol, of 0.2% gluteraldehyde en 4% PFA in PBS gedurende >30 min bij 25 °C²⁰. Bij beide methoden moeten cellen worden gewassen met PBS zoals hierboven. Merk op dat het gebruik van gluteraldehyde onder sommige beeldvormingsomstandigheden de achtergrondfluorescentie of autofluorescentie kan verhogen, en kan een post-fixatiebehandeling met natriumborohydrie²¹ noodzakelijk maken.
4. Het monster kan tot 7 dagen worden bewaard bij 4 °C, ondergedompeld in PBS, verzegeld in een zelfklevende film, voorafgaand aan beeldvorming.

2. Microscoopuitlijning

1. Plaats een kalibratieschaal (reticulum) op de microscooptafel. Gebruik een 10X objectief en de lamp voor doorgelaten licht om het reticulum in het midden van het gezichtsveld (FOV) te centreren.
2. Köhler verlichting. Pas de microscoop aan voor Köhler verlichting²². Om te beginnen, sluit de veldopening en focuseer door de oculairen op het reticulum. Als de randen van de veldopening niet scherp staan, pas de hoogte van de condensor aan totdat zowel de veldopening als het reticulum scherp staan.
3. Pas de laterale positie van de veldopening aan tot deze gecentreerd is ten opzichte van het FOV. Sluit de veldopening totdat alleen het middelste raster op het reticulum verlicht is.
4. Voor een grove uitlijning van de camerapositie (d.w.z. de eerste keer dat de opstelling wordt uitgelijnd), gebruik een hoge lampintensiteit met de camerasluiter GESTRENGD, en plaats geen componenten in doos B (Figuur 1) in het optische pad totdat stap 2.5 is bereikt. Plaats L2 en L3 niet in het detectiepad bij het eerste uitlijnen van de camera. Centreer het reticulumbeeld ongeveer op de camerasluiter door de verticale en horizontale positie van de camera aan te passen (Figuur 2B). Schakel de EM-versterking uit, zet de kamerlichten uit en open de camerasluiter.
5. Nadat de lampintensiteit is verlaagd tot een niveau dat de camerasensor niet zal beschadigen, projecteer het licht van het reticulumbeeld direct op de camerasensor (Figuur 2A). Focuseer het reticulum door de microscoop focusknop aan te passen terwijl het beeld in live videomodus binnen de acquisitiesoftware wordt bekeken. Centreer het reticulumbeeld op de camerasensor door de verticale en horizontale positie van de camera aan te passen (Figuur 2B).
6. Plaats L2 en L3 in het detectiepad tussen de opening en de camera (Figuur 2C). Lijn L2 en L3 uit, zodat L2 één brandpuntsafstand verwijderd is van het brandpunt van de microscoopuitgangspoort en L3 één brandpuntsafstand verwijderd is van de camerasensor. De afstand tussen L2 en L3 moet idealiter gelijk zijn aan de som van de brandpuntsafstanden van L2 en L3, maar kan enigszins worden aangepast om ruimtebeperkingen te accommoderen. De camera en lenzen moeten op dezelfde hoogte zijn als de uitgangspoort.
7. Merk op dat het licht dat van de microscoop wordt uitgezonden, gecentreerd moet zijn op L2 en L3. Pas de afstand tussen L2 en de microscoop aan om ervoor te zorgen dat het reticulumbeeld scherp is op zowel de camera als door de oculairen.
8. Indien nodig kunnen kleine translaties (bijv. < 1 mm) van L2 en L3 worden gebruikt om het reticulumbeeld op de camerasensor te centreren.
9. Tweekleurige module. Zodra de camerapositie is geoptimaliseerd, bevestig componenten die in doos B (Figuur 1) zijn getoond in het detectiepad. Deze componenten kunnen worden bevestigd aan een verwijderbare montage, zodat de hele module kan worden ingevoegd voor meerkleurige FPALM, of verwijderd voor andere FPALM-toepassingen die het niet vereisen.
10. De eerste keer dat deze componenten worden samengesteld, pas de padlengtes van elk kanaal aan om gelijk te zijn. Projecteer he

Results

Influenza hemagglutinine (HA) vormt clusters van de orde van tientallen nanometer tot micrometer, en deze clusters localiseren variabel met actin (Figuur 5). Deze ruimtelijke verdelingen bevestigen grovere schaalbeelden van deze twee eiwitten²⁸ en de afhankelijkheid van de ruimtelijke verdelingen van HA van actin¹⁹. Multicolor FPALM-beelden kunnen verder worden gebruikt om de dichtheid, het gebied en de omtrek van deze clusters te beschrijven, en de mate van colocalisatie tussen de ...

Discussion

Localisatie-gebaseerde superresolutie beeldvorming biedt veel krachtige mogelijkheden voor biologische beeldvorming. De route van individuele optische componenten die op de tafel worden geplaatst tot een functionele superresolutiemicroscoop die in staat is om meerdere fluorescerende soorten in een biologisch monster tegelijkertijd te beeldvormen, vertoont een aantal uitdagingen. Sommige aspecten van de uitlijning zijn kritischer dan andere; we streven ernaar hieronder begeleiding te bieden aan potentiële gebruikers die t...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LabTek II-kamers	Nunc
Fluorescente kralen	Invitrogen	F-8801	Kralen voor kalibratie
Tetraspeck kralen	Invitrogen	T- 7279	Vierkleurige kralen voor kalibratie
Objectief-immersieolie	Zeiss	518F	Immersieolie voor objectief met hoge NA (afhankelijk van de keuze van het objectief)
HPLC-water	Fisher Scientific	W5-4
Media	ATCC	30-2003	Of Cellgro 10-090
Antibiotica	GIBCO	15070-063
serum	Thermo Scientific	SH30087.03
Lipofectamine	Invitrogen	52887
Optimem I	GIBCO	11058-021
Trypsine	MPBiomedicals	1689149
paraformaldehyde	Fisher Scientific	AA433689M	VOORSICHT: Giftig