Een protocol voor faag display en Affiniteit selectie met recombinant eiwit Baits

Summary

Faagdisplay is een krachtige techniek om eiwitten of eiwitcomponenten die interageren met een geïmmobiliseerd molecuul van belang vangen. Zodra een beslissing van de aard van de faag cDNA bibliotheek creëren en het scherm is gemaakt, de hier beschreven protocol maakt efficiënte affiniteit selectie leidt tot de identificatie van interactoren.

Abstract

Met recombinante faag als een scaffold verschillende eiwitgedeelten gecodeerd door een directioneel gekloneerd cDNA bibliotheek geïmmobiliseerde aas moleculen presenteren een efficiënte manier om interacties te ontdekken. De techniek is grotendeels gebruikt voor eiwit-eiwit interacties ontdekken, maar het aas molecuul uitgedaagd hoeft niet beperkt tot eiwitten. Is geoptimaliseerd De gepresenteerde protocol om een ​​bescheiden aantal aas worden gescreend in duplo op de identificatie van onafhankelijke klonen met hetzelfde eiwit maximaliseren. Dit maakt een grotere vertrouwen dat interacterende eiwitten geïdentificeerd zijn legitiem interactoren van het aas molecuul. Monitoring van de faag titer na elke affiniteit selectieronde geeft informatie over hoe de affiniteit selectie evenals vordert over de werkzaamheid van negatieve controles. Een middel titering de faag, en hoe en wat te bereiden op voorhand, zodat dit proces zo efficiënt vooruitgangmogelijk wordt gepresenteerd. Attributen van amplicons teruggevonden na isolatie van onafhankelijke plaque worden benadrukt dat kan worden nagegaan hoe goed de affiniteitsselectie is gevorderd. Trouble shooting technieken om valse positieven te minimaliseren of te omzeilen voortdurend hersteld fagen worden toegelicht. Middel om virale besmetting oplaaien worden besproken.

Introduction

Waarom gebruik maken van faag display en affiniteit selectie plaats van de talloze andere technieken beschikbaar voor het ontdekken en onderzoeken van eiwit interacties met andere moleculen? Faag display conclusie aantal unieke voordelen boven andere werkwijzen voor het detecteren van eiwit-ligand interacties ^1-3 zoals:

Zeer breed repertoire van aas moleculen

De belangrijkste reden is de verscheidenheid van moleculen die als aas affiniteitsselectie ^4. Faagdisplay is een zeer krachtig middel isoleren eiwitfragmenten die interageren met andere eiwitten, nucleotiden, koolhydraten, enz. ⁵ In wezen, als een polymeer / molecuul kan worden bevestigd aan een herstelbare steun kan worden gescreend op affiniteit met faag display eiwitten. Bovendien kan het aas molecuul toegankelijk te bepalen of biologische activiteit behoudt wanneer geïmmobiliseerd ^6, indien de gebruiksomstandigheden reduce / haar activiteiten te elimineren effectief zijn ⁶ of, aan post-translationele modificaties aan het aas voorafgaand aan affiniteitsselectie introduceren.

Faag weerstand tegen externe factoren

Een tweede reden om faag display, is dat het mogelijk is dat sommige aas omgevingsstress (warmte, hoge osmolyt concentraties specifieke cofactoren, etc..) Kunnen vereisen om hun interagerende eiwitten vangen, of faag display eiwitten moeten andere manier worden gewijzigd vóór affiniteitsselectie. De primaire factor die onderzocht is de interactie tussen aas en eiwitten, niet de voorwaarde waarmee de interactie voordoet of als het dodelijk voor het testorganisme. De T7 faag is bijzonder geschikt voor deze studies, omdat het bestand is tegen zware proefomstandigheden zowel intacte en levende (bij voorbeeld de gepubliceerde thermische maximum T7 levensvatbaarheid ~ 60 ° C ^7). Als voorbeeld van de verandering faagweergegeven proeiwitten, bij het ​​onderzoek van de Arabidopsis thaliana zaad proteoom voor eiwitsubstraten het reparatie-enzym, Eiwit Isoaspartyl Methyl Transferease (PIMT), het virus gebruikt in deze studies hadden "verouderd" geweest voor een week, voorafgaand aan elke affiniteit selectieronde, om invoering te stimuleren van isoaspartate (isoAsp) resten bij gevoelige eiwitten ⁶ die niet mogelijk in organismen die kunnen herkennen en reparatie / metaboliseren dergelijke eigenschappen.

Metabolisch inert

Bovendien, de faag zijn meestal resistent tegen metabolische gif en storende kleine moleculen die zou, op zijn minst, resulteren in pleiotrope effecten op metabolisch actief testorganismen. Na de stringentie wassen, wordt het gif voor een grote hoeveelheid bacteriën worden ingevoerd voor infectie zodat het gif wordt verdund tot een bereik onschadelijk bacteriën of volgende faagreplicatie verwijderd. Tijdens het onderzoek naar eiwit targets van de PIMT reparatieenzym, S-adenosylmethionine (AdoMet) werd gebruikt om de micro-titer plaat putjes geïmmobiliseerd enzym activeren doeleiwit afvangvergunning weliswaar afhankelijk van S-adenosyl Homocysteine ​​(AdoHcy) om het enzym te inactiveren en een nuttig negatieve controle vast te de wetenschap dat het virus niet nadelig worden beïnvloed door een AdoMet of AdoHcy ^6. Bovendien, leden van bepaalde Late embryogenese Overvloedige (LEA) eiwitfamilies, onderzocht bij deze lab, zijn bekend om hun vorm in aanwezigheid van additieven zoals sucrose ^8, waarin de concentraties zo hoog als 200 mM in sojazaden kan opbrengen op het punt wijzigen van fysiologische rijpheid ^9. Het virus wordt niet verwacht te worden beïnvloed door toevoeging van 200 mM sucrose in elke affiniteit selectieronde, dat noodzakelijk bepaalde LEA-client eiwit interacties, wat niet het geval autonoom levensvatbare testorganismen ^10.

Dit lab is gericht op discoverinG eiwit-eiwit interacties in rijpe, gedehydreerd of kiemende zaden die het mechanisme opgeslagen bescherming proteoom tijdens dehydratatie ¹¹ of reparatie van onderdelen van de opgeslagen proteoom die gevoelig isoAsp vorming zijn nadat het zaad ingezogen ⁶ grondslag liggen. Zo is de productie en zuivering van de recombinante eiwitten nodig als aas in een actieve toestand, en ervoor te zorgen dat ze zo blijven, voor en nadat ze zijn geïmmobiliseerd, hoewel vaak moeilijk is, is een hoeksteen voor ons werk. Aangezien elk recombinant eiwitproductie scenario is verschillend, optimaliseren voorwaarden voor recombinante eiwitproductie hier niet worden behandeld. Gebruikers worden aangespoord om te proberen, waar mogelijk, om te bepalen of het geïmmobiliseerde eiwit is nog steeds functioneel (bijvoorbeeld als het gaat om een enzym, doe een enzym assay in de microtiterplaatputjes). Dit zal enige vertrouwen dat het aas is biologisch actief zijn en derhalve, dat elke ontdekte interactieswat vaker biologische relevantie hebben.

Protocol

Een grafische voorstelling van de volgende (Figuur 1) beschreven methode benadrukt de twee primaire componenten voor affiniteitsselectie met een faag-bibliotheek: A) een faag-cDNA-bank waarschijnlijk proteïnen coderen met affiniteit voor het aas en, B) een gezuiverd recombinant aas eiwit. Productie van aas (recombinant eiwit) is uitvoerig onderzocht en literatuur waarin best practices voor het beveiligen van oplosbare, actieve recombinant eiwit uit E. coli ^12-13, eukaryote gist ^14, insect ^{15-16, 17-18} planten, of zoogdiercellen ^19-20 cellen in overvloed.

In het volgende protocol, een hexahistidyl gelabeld recombinant proteïne is gebruikt als aas. Hierdoor kan de verificatie dat het aas eiwitten blijven in de putten na overnacht incubatie en wassen stappen.

1. ELISA voor recombinant eiwit retentie in de microtiterplaatputjes

1. Mark eenmicrotiterplaat met permanente inkt, en aan te wijzen die putten die proteïneconcentraties zal bevatten. Voer deze in 3 herhalingen van putten. Omvatten 3 herhalingen van een negatieve controle concentratie serie (niet-hexahistidyl gelabeld eiwit; BSA werkt goed als deze achtergrond te controleren).
2. Was de plaat grondig met water en verwijder het water door smakken de plaat ondersteboven op 4 lagen keukenpapier tussen de wasbeurten.
3. Immobiliseren in de eerste 3 putjes in 100 pl Tris, pH 7,5, (buffer of naar keuze) de hoogste concentratie van het recombinante eiwit (10 ug / ml). In de volgende drie putjes het recombinante eiwit op (1,0 ug / ml), enz., tot 1,0 ng / ml. Doe hetzelfde met de BSA concentratie serie.
4. Dek gerechten met plasticfolie en laat het een nacht bij 4 ° C.
5. De volgende ochtend, verwijdert eiwit door smakken plaat ondersteboven op 4-5 lagen keukenpapier.
6. Was putjes 5x met 200 ul 1 x TBS telkens die het bufferreservoirin de putjes ~ 1 min elke keer en het verwijderen van de buffer was door smakken de plaat ondersteboven op de papieren handdoeken na elke wasbeurt.
7. Blokkeer de ELISA plaat op een roterende schudder met 200 ul 5% (w / v) BSA en 200 ul 5% (w / v) blokkerende reagens in TBS bij kamertemperatuur gedurende 2 uur (of zitten stationaire overnacht bij 4 ° C als gunstig ) verpakt in plastic folie.
8. Verwijder overtollige blokkeeroplossing door smakken de plaat ondersteboven op het keukenpapier. Was 4x 1 min elke keer met 200 ul van 1x TBS, het verwijderen van de was-oplossing door smakken de plaat ondersteboven.
9. Verdunnen penta-HIS primaire antilichaam 1/2, 000 in het blokkeren van buffer en leveren 100 pi aan elk putje. Incubeer 1-2 uur bij kamertemperatuur met de stationaire plaat.
10. Verwijder het primaire antilichaam door smakken de plaat ondersteboven op het keukenpapier. Was 4x 1 min elke keer met 200 pi 1X TBST. Verwijder elke wasbeurt door smakken de plaat ondersteboven.
11. Verdun de secundaire antilichaam(Geit anti-muis alkalisch fosfatase-conjugaat) in blokkerende buffer en incubeer 100 pl in elk putje gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met de stationaire plaat.
12. Verwijder het secundaire antilichaam door smakken de plaat ondersteboven op het keukenpapier. Was 4x 1 min elke keer met 200 pi 1X TBST. Verwijder elke wasbeurt door smakken de plaat ondersteboven.
13. Breng 200 pi para-nitrofenylfosfaat (pNPP) substraatoplossing in elk putje. Het substraat is een vaste stof bij -20 ° C, zodat porties te maken en op te halen het vereiste aantal monsters nodig zijn voor de detectie uit de vriezer goed van tevoren, zodat het volledig is ontdooid door deze fase.
14. Op 30 min stop de reactie door toevoeging van 50 pl 3 M NaOH aan elk putje.
15. Lees de absorptie bij 405 nm onmiddellijk de ELISA-plaatlezer.

Opmerking: Als het recombinante eiwit van belang zich niet hechten aan de putjes, is het mogelijk om e wijzigene samenstelling / pH van de buffer aanzienlijk (carbonaatbuffer pH 10,0) of chaotrope middelen (ureum) aan proberen eiwit bevestiging aan de microtiterplaat putjes staan. Echter het herstel van het recombinante eiwit: 1) gebonden blijft aan de microtiterplaat putjes onder de voorwaarden voor de affiniteit selectie en, 2) behoudt zijn biologische activiteit na verwijdering van de hoge pH / chaotroop aanbevolen.

2. Groeiende bacteriële gastheer (BLT5403) voor het titreren

1. Autoclaaf (Figuur 2A) tien 250 ml erlenmeyers en 3 cultuur buizen. Maak LB vloeistof en LB-agar voor het gieten van vaste media platen. Koel LB agar tot 50 ° C en voeg ampicilline 100 ug / ml voor aseptisch gieten in petrischalen in een stroming kap (figuur 2B).
2. Ook in een stroming kap (figuur 2B) een reeks LB 100 ug / ml ampicilline (LB ^AMP100) agarplaat tot afzonderlijke kolonies van BLT5403 uit voorraad gehouden 15% (v / v)glycerol bij -80 ° C (figuur 2C). Plaats plaat ondersteboven bij 37 ° C gedurende de nacht in een incubator voor de groei (figuur 2D).
3. In de ochtend, te enten 50 ml LB ^AMP100 in een erlenmeyer van 250 ml met een enkele kolonie van de plaat geplukt. Incubeer bij 37 ° C, 200 rpm in een horizontale shaker (figuren 2E en 2F), en gebruik van een spectrofotometer controleren celdichtheid bij OD ₆₀₀ = 0,5-0,6 (figuur 2H).
4. Giet de cellen in een 50 ml Falcon-buis of dergelijke, en houden bij 4 ° C tot gebruik (figuur 2G). Cellen meestal levensvatbaar blijven ~ 1 week.
5. Maak 500 ml LB, plaats het in een verbijsterd Fernbach kolf en autoclaaf het. Zodra het is steriel, de kolf bij 4 ° C (figuur 2G) of op kamertemperatuur tot de nacht van de "DAG" hieronder.

Opmerking: De gastheer bacteriële cellenBLT5403, een expressie-plasmide gedragen bron van T7 natieve capside-eiwit zonder welke de T7 midden-en lage-kopie vectoren niet goed kan repliceren, zijn zeer gevoelig voor het virus. Het is noodzakelijk om besmetting te voorkomen. Contaminatie zal uiteindelijk plaatsvinden waarna alle oppervlakken in contact met het virus / geïnfecteerde bacteriën moeten worden afgenomen met 70% (v / v) ethanol en gewassen met detergens (fig. 2I). Als dit niet effectief wordt een grondige reiniging van alle oppervlakken die bestand is tegen Envirocide (Figuur 2J) nodig. Start BLT5403 cellen uit diepvries voorraad elke nieuwe ronde van affiniteitsselectie te helpen besmetting van de voorraad te verminderen in 4 ° C, en zorgen voor krachtige cellen worden gebruikt in het protocol. Filter barrière pipet tips zijn essentieel.

3. Affiniteitsselectie

DAG

1. Markeer een microtiterplaat met permanente inkt, en aan te wijzen die putten die prot zal bevatteneins / wijzigingen. (Als gevolg van vervuiling problemen, platen worden nooit hergebruikt). Voer deze in 3 herhalingen van putten voor elk eiwit en behandeling.
2. Was de plaat grondig met water en verwijder het water door smakken de plaat ondersteboven op 4 lagen keukenpapier tussen de wasbeurten. Immobiliseren, in 100 pl Tris, pH 7,5, (buffer of naar keuze) het recombinante eiwit (10 ug / ml) in zes putjes, of BSA (10 ug / ml) in drie putjes, voor een totaal van 9 putjes eerst ronde van affiniteitsselectie. Sluit de schaal af met plasticfolie en laat het een nacht bij 4 ° C (figuur 2G).
3. Zorg ervoor dat er 9 x 250 ml erlenmeyers (zie 2.1) gereinigd, geautoclaveerd, en gemerkte (coderen met gekleurde tape werkt goed, figuur 2F).
4. Bereken de hoeveelheid faag lysaat gebruikt voor elke wel op basis van de titer van de bibliotheek wordt gebruikt en het aantal fagen te screenen.
5. Erop toe dat vers BLT5403 cellen zijn klaar voor gebruikvoor titering deze affiniteit selectieronde morgen (figuur 3A).
6. Voor voldoende 1x TBS (150 mM NaCl, 50 mM Tris Base, pH 7,6) en 1x TTBS (1x TBS + 0,05% (v / v) Tween 20) zijn 10 x 200 pl wasbeurten uit te voeren voor het aantal putten worden gebruikt . Bovendien preincubate de TTBS bij affiniteitsselectie temperatuur. Zorg ervoor dat een back-up, gesloten, 50 ml Falcon buis 1x TTBS bestaat op de affiniteit selectie temperatuur met voldoende 1x TTBS.
7. Bereid 3 behandelingen x 3 herhalingen x 3 drie exemplaren van 1,5 ml Eppendorf buizen (27 in totaal) met 990 pi van LB ^{100 AMP} elk en label op de juiste wijze (bijv. 10 ^-2). Deze zijn voor de geïnfecteerde bacteriën opgehaald uit de microtiterplaatputjes morgen. Markeer de verdunning aan een kant van de buis (10 ^-2) en een oplopende nummer op de andere zijde ("1"). Voor elke Eppendorf buis, ook label een borosilicaat buis en een LB ^{100 AMP} plaat. In deze way, de platen en borosilicaat reageerbuizen zijn genummerd 1, 2, 3, 4, 5, enz.. om titering sneller gaan. Daarna de eenvoudige nummer kan worden aangepast aan de verdunning en de behandeling op de Eppendorf buis (bijv. # 12 buis was de derde drievoud van de eerste replicatie van het BSA controle voor verdunning 10 ^-5). WINKEL Eppendorf buizen en ¹⁰⁰ LB ^AMP platen overnacht bij 4 ° C (Figuren 2G en 3B).

Bijvoorbeeld: labelen 1,5 ml Eppendorf buisjes drie 10 ^-2 verdunningen van faag uit de BSA replicatie ene met 1, 2, en 3 (drie drievoud metingen van faag titer voor een replicatie), en markeer borosilicaat reageerbuizen 1, 2 en 3, waarbij de geïnfecteerde bacteriën worden gemengd met ongeïnfecteerde bacteriën en top agarose voor het storten op LB ^{AMP 100} agarplaten (figuur 3C).

8. Voor de seriële dilutions, label Eppendorf buizen, elk, voeg 900 pl LB ^{AMP 100.} Zodra de eerste verdunningen (10 ^-2) van geïnfecteerde bacteriën Bij elk eiwit / behandeling replicatie, of drie, morgen zullen zij goed gemengd en 100 ui ontnomen en in de desbetreffende Eppendorf buis met 900 pi LB ^{100 AMP} voor 10 ^-3 verdunning (buizen 4, 5 en 6 voor replicatie een BSA controle). Deze zullen goed gemengd op hun beurt en 10 ^-3 verdunningen worden gebruikt om de 10 ^-4 verdunningen (7, 8, 9). Gebruik de 10 ^-4 verdunningen voor 10 ^-5 verdunningen (10, 11, 12), enzovoort. de titer van de eerste van de drie BSA replicaties (putjes) krijgen.
9. Hetzelfde zal gebeuren voor BSA replicatie twee (ook 2), BSA replicatie drie (nou ja 3), de drie herhalingen van de vergiftigde aas, en ten slotte de drie herhalingen van het aas putten. Aan het einde moet er buizen gelabeld f zijnrom 1-135 (135 is de laatste drievoud van de laatste replicatie van het aas in de hoogste verdunning van 10 ^-6). Bewaar de Eppendorf buisjes overnacht bij 4 ° C (Figuur 3C toont de Eppendorf en borosilicaat buizen voor alle verdunningen van het drievoud van de drie herhalingen (drie putjes) BSA.
10. Start 2 of 3 kweekbuizen van BLT5403 cellen (geplukt van enkele kolonies van een vers weggeschoten overnachting LB ^AMP100 plaat; uit stap 2.2) groeit in het incubatie shaker (figuren 2E en 2F) als een overnachting cultuur. Om de 500 ml LB (punt 2.5 hierboven), voeg ampicilline tot 100 ug / ml en plaats de Fernbach kolf in de klem in de schudincubator dus het zal bij 37 ° C en belucht de volgende ochtend (figuur 2F).

Opmerking: Ronde drie en vier kunnen benadering verdunningen van wel 10 ^-10 hoeveelheid p vereisenhage volume aan te LB ^AMP100.

DAG TWEE

11. De volgende morgen, plaatst de geautoclaveerd, lege 9 x 250 ml Erlenmeyer kolven (een voor elke microtiterplaat putje) in de klemmen van de incubatie shaker. Inoculeren de 500 ml LB ^{100 AMP} met 500 ul van een van de 's nachts culturen van BLT5403 cellen begon afgelopen nacht (zie stap 3.8 hierboven), sluit en start het groeiende (37 ° C, 220 rpm). Zet de spectrofotometer (Figuur 2H) en zet deze op absorptie lezen bij 600 nm.
12. Verwijder de microtiterplaat van 4 ° C, verwijder de plastic folie en verwijder eventueel ongebonden eiwit uit de plaat door het wassen van 10x met 200 pl elk moment van 1x TBS pH 7,5 en smakkend de plaat ondersteboven op de papieren handdoek tussen de wasbeurten. Blokkeer met 200 ul 5% (w / v) BSA en 200 ul 5% (w / v) blokkerende reagens in TBS gedurende 1 uur (of overnacht indien handig) met de plaat verpakt in plastic folie.
13. Afwassen de blokkering solution 10x met 200 pl elk moment van 1x TBST, smakkend de plaat ondersteboven op 4 lagen papier handdoek tussen de wasbeurten. Het is mogelijk om de putjes met 200 pl water vullen in dit stadium, bedek ze met plastic en zet ze bij 4 ° C op te slaan voor maximaal 1 week.

Opmerking: Start de cultuur snel genoeg dat tegen de tijd dat de faag-geïnfecteerde BLT5403 de voltooiing van de affiniteitsselectie klaar om in de cellen in 500 ml tussen 0,6 en 1,0 OD _600. Als ze groeien veel verder dan 1.0, kan lysis niet optreden als gevolg van beperkingen van de middelen als cellen benaderen stationaire fase. Als de cellen een OD ₆₀₀ van 0,6 niet uiterlijk vóór de invoering van faag niet bereiken, kan de multipliciteit van infectie te hoog zijn, snel doden van de cellen, die de weergave van het lysaat kan beïnvloeden. Als de cellen nog niet nadert een OD ₆₀₀ van 0,6 door de voltooiing van de affiniteitsselectie, InocUlate de kolf met meer BLT5403 van de tweede (of zelfs beide tweede en derde) reageerbuizen schudden bij 37 ° C (Figuur 2F). Als een OD ₆₀₀ van 1,0 te snel nadert, schakelt de kachel en de shaker en open het deksel om de cultuur te koelen en verhongeren de bacteriën voor zuurstof. Herbeginnen verwarming / schudden zodra de faag zijn toegevoegd.

Vanaf hier gebruiken filter barrière tips om faag kruisbesmetting te vermijden.

14. Zodra de kolf geënt, zet de faagbibliotheek (100 pi) met de eiwitten, sluit de plaat met plasticfolie en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
15. Op 55 min, registreren de OD ₆₀₀ van de cellen. De verdubbeling is ongeveer elke 20 minuten. Wet dienovereenkomstig (zie "Let op" hierboven).
16. Aan het einde van een uur verwijdert de plastic verpakking van de plaat en onmiddellijk door het schudden van de faag in de getransformeerde afval en vervolgens snel het toevoegen van 200 ul 1x TBST. (Gebruik een multipipettor met een 1 = 100 ul hoofd en de op pipet 2 [ie levert 200 pl / plunjer depressie] voor dit en het snel gaat). Stel een timer voor 1 min. Na 1 min, schud buffer in getransformeerd afval, smack bord ondersteboven op keukenpapier en leg terug op de bank (25 ° C plaat). Herhaal het wassen stappen 10x.
17. Na de ^10e wassen, neem 200 ul BLT5403 cellen uit de 50 ml Falcon buis bij 4 ° C en ze op de bodem van de put waarvan de laatste spoeling van TTBS is verwijderd. Wikkel de platen in plastic folie en zet bij 37 ° C gedurende 20 minuten aan een faag nog steeds vast aan het aas aan de bacteriën infecteren te krijgen (zie opmerking in discussie over aanhoudend opgehaald faag en / of hoge achtergrond van lukraak bindend faag).
18. Aan het einde van de 20 min, uitpakken van de borden en neem 10 pi bacteriën uit de BSA bij 25 ° C replicatie een goed en zet het in de 990 pi van LB ^{100 AMP} gemarkeerd"1". Herhaal dit twee keer voor die goed (buizen 2 en 3) resulterend in 3 drievoud van 1/100 verdunningen van de faag uit die goed. Dit BSA replicatie een steekproef driemaal. Deze verdunningen worden gebruikt om de gemiddelde titer ± SEM voor die replicatie van BSA.
19. Doe hetzelfde voor replicatie 2 en 3 van BSA (drie drievoudige monsters van 10 pi elk), de drie gerepliceerde putjes van de vergiftigd lokaas eiwitten en de aas eiwit. Stel deze 27 Eppendorf buizen opzij en krijgen de resterende 170 ul van de geïnfecteerde bacteriën in de putten groeien in de richting van lysis.
20. Indien de bacteriën in de kolf is bij OD ₆₀₀ = 0,6-1,0, decanteren 50 ml cellen van de Fernbach kolf in elk van de negen 250 ml Erlenmeyer kolven. Neem de resterende 170 ul van faag-geïnfecteerde BLT5403 bacteriën in de BSA replicatie 1 goed en voeg deze toe aan de 50 ml cellen gemarkeerd "BSA Rep 1" (gele band). Doe dit voor alle negen putten en zet ze schudden in de incubator ( Figuur 2F).
21. Bewaken van de cellen in het 37 ° C incuberen schudder van tijd tot tijd voor lysis (ongeveer 3 uur vanaf het moment van inoculatie). Maak de verdunningen van de 27 oorspronkelijke verdunningen (10 ^-2) in de geschikte, gelabelde Eppendorf buisjes gedurende deze tijd.
22. Om deze verdunningen uit te voeren vanaf de eerste 27 verdunningen van 3.12 hierboven, neem 100 ul van de LB met bacteriën uit Eppendorf buis 1 (BSA replicatie, eerst van de drievoudige monsters van deze 1/100 verdunning van dit goed) en voeg deze toe aan de 900 pi LB in Eppendorf buis 4 (1 x 10 ^-4 verdunning van BSA replicatie, eerst van de drievoudige monsters uit deze bron).
23. Gooi de filter barrière tip voor een nieuwe voordat krijgen 100 pl LB met bacteriën van Eppendorf buis 4 te voegen aan de 900 ui LB in Eppendorf buis 7 (1 x 10 ^-5 verdunning van BSA replicatie, eerst van het drievoud monsters uit deze bron). Ga door met de verdunningen (deigen tot 1 x 10 ^-6) voor alle drievoud alle replicaties van alle eiwitten en behandelingen (135 buizen in totaal).
24. Nadat de cellen zijn gelyseerd, brengen de kweek tot 0,5 M NaCl door toevoeging van 5 ml van een 5 M NaCl voorraad en overbrengen in een gelabelde centrifugefles.
25. Centrifugeer bij 8000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Giet supernatant (virus) in een schone, steriele 50 ml Falcon buis.
26. Voeg een paar druppels chloroform tot het supernatant gedecanteerd in de Falcon buis.
27. Bewaar bij 4 ° C voor de volgende ronde van affiniteitsselectie.

4. Dag Drie

1. Autoclaaf of bleken alle laboratorium die is gebruikt bij het genereren van deze affiniteit selectieronde voor te bereiden op de volgende ronde.

5. Titering

1. Nummer zoveel vaste LB ^{100 AMP} platen als er verdunningen in oplopende volgorde (er moet nu 1 plaat voor elke borosilicaat buis en Eppendorf buis, elk met hetzelfde nummer). Put de platen in de 37 ° C incubator (Figuur 3D).
2. Smelt topagarose (1,0 g Bacto Trypton, 0,5 g gistextract, 0,5 g NaCl, 0,6 g agarose, vul aan tot 100 ml, autoclaaf) door het losdraaien van de topagarose dop van de fles en afwisselend microwaving de fles en wervelende het te mengen tot de top agarose volledig gesmolten. Plaats de fles in het waterbad afkoelen tot 50 ° C (Figuur 3E).
3. Neem een ​​borosilicaat 10 ml pipet met een pipet pomp bevestigd. Licht een bunsenbrander. Zet een piepschuim Falcon buis houder of koeler deksel ondersteboven op de bank en zet de LB100 AMP platen 1 tot en met 6 (vers uit de 37 ° C incubator) op, Plaat 1 bovenste (Figuur 4A). De piepschuim houdt de platen warm.
4. Zet 250 ul BLT5403 cellen van 4 ° C in elk van de genummerde borosilicaat reageerbuizen voorbereid op dag een hierboven (punt 3.7 en de figuren 4B en 4C). Arvariëren de genummerde borosilicaat buizen in dezelfde oplopende serie als de verdunningen bij de 1,5 ml Eppendorf buizen (Figuur 4A).
5. Zet 100 ui van de verdunning in Eppendorf buis 1 in 250 gl cellen in borosilicaat reageerbuis 1 (fig. 4D en 4E). Verhit de eerste 5 in de pipet boven de vlam een beetje (niet te veel! ~ 3 jat, Figuur 4F) en duik in het gesmolten topagarose. Trek 3 ml en leveren snel in de reageerbuis op de top van de cellen / faag (figuur 4G).
6. Meng door te vegen met een vinger terwijl u de buis met de andere hand (figuur 4H) en giet de inhoud op de plaat (Figuur 4I). Kantel het bord en gebruik de reageerbuis te jagen bellen en droge plekken totdat de hele plaat onder de top agarose. Leg het opzij, rechtop op de bank om af te koelen.
7. Gooi de borosilicaat buis, verwijder de filter barrière tip, krijgen eenvers een en doorgaan totdat alle verdunningen zijn bedekt. Ophalen LB ^{100 AMP} platen uit de incubator deze leeg zijn, maar niet meer dan 6 tegelijk of ze afkoelen en de top agarose stolt te snel.
8. Zodra de top agarose is solide, draai de platen ondersteboven (HET IS BELANGRIJK OM DIT TE DOEN). Anders, de agar / agar "huilt", condenseert op het deksel, zakt naar beneden op de top agarose en loopt over het, het nemen van de faag met het waardoor het onmogelijk is om titer nauwkeurig) en ofwel: 1) zet de platen in de 37 ° C incubator [be back 4 uur later aan de titer tellen als T7 is agressief] OF: 2) Laat ze ondersteboven op de bank en ze zijn klaar de volgende ochtend om titer tellen.
9. Het nemen van alle noodzakelijke voorzorgsmaatregelen om te beschermen tegen het glas verbrijzelen, of letsel indien dat zo is, zet de topagarose dop weer op los en magnetron de topagarose tot het kookt. Doe dit twee keer. Laat het afkoelen, draai dedop en zet het weg. Draai het waterbad tot zijn gebruikelijke temperatuur of het uitgeschakeld. Zet de verdunningen in de 4 ° C koelkast. Ze zijn nodig om de titers te interpreteren en / of opnieuw enkele titreren.

6. Het bepalen en berekenen titer

1. Onderzoek de plaque gevormd op de platen en lever dit met confluerende lysis (figuur 5A bijv. 10 ^-2 verdunning). Bepaal welke van de resterende seriële verdunningen voldoende aantal plaque geproduceerd zijn om een nauwkeurige telling mogelijk (Figuren 5A een Nd 5B). Noteer het aantal plaque van deze platen (Tabel 1, Figuur 5B).
2. Vermenigvuldig het aantal plaque door de verdunning en vermenigvuldigt dit aantal 100 het aantal plaque-vormende eenheden per ml geïnfecteerde bacteriën uit de putjes (krijgen dus alleen 10 gl geïnfecteerde bacteriën werden voor elke triplo en so dit moet vermenigvuldigd worden met 100 tot tellingen per ml) te krijgen. Gemiddeld is het aantal plaque-vormende eenheden (PFU) per milliliter (PFU / ml onverdunde geïnfecteerde bacteriën genomen uit de microtiterplaat goed), in de drie drievoud uit deze put.
3. Vorm een Grand Beoordeling van de overeenkomt voor de drie herhalingsputjes en bereken de standaardafwijking van dit gemiddelde (tabel 1). Dit is wat wordt in de figuur van de toename van faag titer per affiniteit selectieronde en behandeling (figuur 5C) opgenomen.

7. Plaque Isolatie, PCR, en Sequencing

1. Aan het einde van affiniteitsselectie ronde 4, selecteert 18 individuele, goed gedefinieerde, plaque koloniën en, met behulp van een steriele Pasteur pipet, tandenstoker, geel pipet tip of een vergelijkbaar apparaat, de kern van deze plaque van de titering platen. Bij gebruik van buizen of tips, eerst nat binnen de Tris-HCl, pH 8,5 in de Eppendorf buis (figuur 5D).
2. Bij gebruik van buizen, zorg ervoor dat de borosilicaat buis houdt geen overtollige druppels Tris, druk de lamp en daarmee nog steeds gecomprimeerd, duw de borosilicaat pipet tip via een goed geïsoleerd plaquette recht om de plastic petrischaal hieronder (Figuur 5E). Laat de lamp met de pipet tip nog steeds in de agar / topagarose en zuigen de kern (Figuur 5F, zie pijl).
3. Verdrijf de kern in 100 ul Tris-HCl, pH 8,5 in de betreffende buis (figuur 5G) en vortex kort.
4. Verwarm 20 pl van dit volume bij 65 ° C gedurende 10 minuten.
5. Centrifugeer het verhitte volume bij 13.000 x g in een benchtop centrifuge bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Neem 3 ui van het supernatant van deze hoeveelheid wordt gebruikt in PCR reacties met T7-UP en DOWN T7-primers.
6. Voor elk van de 18 geïsoleerde plaque, verwarmde oplossingen, maken 50 ul PCR reactie met een annealing temperatuur van 58 ° C en 35 cycli.
7. Run 20 ul van each reactie op een 1% (w / v) agarosegel bevattende 0,015% (v / v) ethidiumbromide. Visualiseer met een transilluminator met behulp van geschikte oogbescherming en nitril handschoenen lab. (LET OP: ethidiumbromide is een krachtig mutageen.) Fotografeer de gel en afvoeren van verontreinigde materialen goed (figuren 6A en 6B).
8. Als de amplicons afzonderlijke producten en niet van lege vector (product loopt bijna 100 bp op een 1% (w / v) TAE agarosegel, Figuren 6A en 6B pijlen) Reinig de resterende 30 pl voor gebruik als een sjabloon sequencing. Indien geen enkel product op de gel (figuur 6B, plaque 15), knip de meest prominente band (s) uit de gel en extraheer het DNA uit de gel met een kit.
9. Sequence de amplicons die niet leeg zijn vectoren met behulp van de T7-UP primer.
10. Onderzoek elke sequentie de linker arm en van deze informatie bepaalt waar het begin van het inzetstuk zich bevindt. Gebruik de Basic Local Alignment Search Tool (BLAST, National Library of Medicine) om de identiteit van de gecodeerde cDNA te bepalen, of de insert is in frame en, zo ja, is welk deel van het eiwit coderende sequentie (CDS) is weergegeven en gevangen genomen door de aas.

Results

In staat om de capaciteit van het aas te interageren met faagweergegeven eiwitten (metabolisch vergiftigd lokaas) afbreuk biedt een krachtige negatieve controle voor deze techniek. Het is ook wenselijk om te bepalen of het aas, indien gebonden aan de microtiterplaat en behoudt zijn functie. Beide controles zullen het vertrouwen dat interactie, faagweergegeven eiwitten teruggevorderd door de nonpoisoned aas legitiem verhogen.

Bemonstering drie drievoud uit elk putje draagt ​​aanzienlijk de ti...

Discussion

Door het uitvoeren van het experiment drie gerepliceerde wells, onafhankelijk verkregen faag van hetzelfde eiwit binding aan het aas te onderscheiden, zelfs als ze dezelfde kloon (dus geen verschil in de nucleotidesequentie van de CDS gebied dat is verworven en deze zijn opgehaald uit onafhankelijke bronnen). Anders is de enige manier om onderscheid te maken tussen faag codeert voor hetzelfde eiwit binding aan het aas is als ze onafhankelijk reverse getranscribeerde gebieden die verschillen in een deel van de n...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	Becton Dickinson Co.	211705
Yeast Extract	Becton Dickinson	212750
Agar	Becton Dickinson	214010
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Agarose	Research Products International	A20090
Blocking Reagent	EMD Chemicals Inc.	69064
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-212
Sodium Dodecyl Sulfate	Fisher Scientific	BP166-500
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Escherichia coli BLT5403	EMD Chemicals Inc.	BLT5403	Genotype: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicillin, Sodium Salt	Research Products International	A40040
Ethidium bromide	Fisher Scientific	BP102-1
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich Corp.	A-9647
Penta-HIS primary antibody	Qiagen Inc.	34660
Goat anti-mouse alkaline phosphatise conjugate	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153
para-Nitrophenylphosphate	Sigma-Aldrich Corp.	N-7653
T7-UP primer	EMD Chemicals Inc.		5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'
T7-DOWN primer	EMD Chemicals Inc.		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'
Qiaquick PCR Purification kit	Qiagen Inc.	28104
Qiaquick Gel Extraction kit	Qiagen Inc.	28706
Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	Invitrogen Life Technologies	4336917
Heating Block	Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)	18780
96-well Cell Culture Plates	Corning	Costar 3590
Isotemp Incubator Oven	Fisher Scientific	516D
Pasteur Pipettes, 5 ¾ in	Fisher Scientific	13-678-20A
ChromaView Transilluminator	UVP Inc.	TS-15
UV Shield	Oberon	071AF
Gloves, Nitrile	Fisher Scientific	19-170-010C
Sterile 1.5 ml tubes	USA Scientific Inc	1615-5500
10 ml Borosilicate Pipettes	Fisher Scientific	13-678-25E
Borosilicate culture tubes	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I, ELISA plate reader	Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland	Type 362