Een protocol voor faag display en Affiniteit selectie met recombinant eiwit Baits

Summary

Faagdisplay is een krachtige techniek om eiwitten of eiwitcomponenten die interageren met een geïmmobiliseerd molecuul van belang vangen. Zodra een beslissing van de aard van de faag cDNA bibliotheek creëren en het scherm is gemaakt, de hier beschreven protocol maakt efficiënte affiniteit selectie leidt tot de identificatie van interactoren.

Abstract

Met recombinante faag als een scaffold verschillende eiwitgedeelten gecodeerd door een directioneel gekloneerd cDNA bibliotheek geïmmobiliseerde aas moleculen presenteren een efficiënte manier om interacties te ontdekken. De techniek is grotendeels gebruikt voor eiwit-eiwit interacties ontdekken, maar het aas molecuul uitgedaagd hoeft niet beperkt tot eiwitten. Is geoptimaliseerd De gepresenteerde protocol om een ​​bescheiden aantal aas worden gescreend in duplo op de identificatie van onafhankelijke klonen met hetzelfde eiwit maximaliseren. Dit maakt een grotere vertrouwen dat interacterende eiwitten geïdentificeerd zijn legitiem interactoren van het aas molecuul. Monitoring van de faag titer na elke affiniteit selectieronde geeft informatie over hoe de affiniteit selectie evenals vordert over de werkzaamheid van negatieve controles. Een middel titering de faag, en hoe en wat te bereiden op voorhand, zodat dit proces zo efficiënt vooruitgangmogelijk wordt gepresenteerd. Attributen van amplicons teruggevonden na isolatie van onafhankelijke plaque worden benadrukt dat kan worden nagegaan hoe goed de affiniteitsselectie is gevorderd. Trouble shooting technieken om valse positieven te minimaliseren of te omzeilen voortdurend hersteld fagen worden toegelicht. Middel om virale besmetting oplaaien worden besproken.

Introduction

Waarom gebruik maken van faag display en affiniteit selectie plaats van de talloze andere technieken beschikbaar voor het ontdekken en onderzoeken van eiwit interacties met andere moleculen? Faag display conclusie aantal unieke voordelen boven andere werkwijzen voor het detecteren van eiwit-ligand interacties ^1-3 zoals:

Zeer breed repertoire van aas moleculen

De belangrijkste reden is de verscheidenheid van moleculen die als aas affiniteitsselectie ^4. Faagdisplay is een zeer krachtig middel isoleren eiwitfragmenten die interageren met andere eiwitten, nucleotiden, koolhydraten, enz.....

Protocol

Een grafische voorstelling van de volgende (Figuur 1) beschreven methode benadrukt de twee primaire componenten voor affiniteitsselectie met een faag-bibliotheek: A) een faag-cDNA-bank waarschijnlijk proteïnen coderen met affiniteit voor het aas en, B) een gezuiverd recombinant aas eiwit. Productie van aas (recombinant eiwit) is uitvoerig onderzocht en literatuur waarin best practices voor het beveiligen van oplosbare, actieve recombinant eiwit uit E. coli ^12-13, eukaryote gist ^14, insect ^{15-16, 17-18} planten, of zoogdiercellen ^19-20 cellen in overvloed.

In het volgende....

Results

In staat om de capaciteit van het aas te interageren met faagweergegeven eiwitten (metabolisch vergiftigd lokaas) afbreuk biedt een krachtige negatieve controle voor deze techniek. Het is ook wenselijk om te bepalen of het aas, indien gebonden aan de microtiterplaat en behoudt zijn functie. Beide controles zullen het vertrouwen dat interactie, faagweergegeven eiwitten teruggevorderd door de nonpoisoned aas legitiem verhogen.

Bemonstering drie drievoud uit elk putje draagt ​​aanzienlijk de ti.......

Discussion

Door het uitvoeren van het experiment drie gerepliceerde wells, onafhankelijk verkregen faag van hetzelfde eiwit binding aan het aas te onderscheiden, zelfs als ze dezelfde kloon (dus geen verschil in de nucleotidesequentie van de CDS gebied dat is verworven en deze zijn opgehaald uit onafhankelijke bronnen). Anders is de enige manier om onderscheid te maken tussen faag codeert voor hetzelfde eiwit binding aan het aas is als ze onafhankelijk reverse getranscribeerde gebieden die verschillen in een deel van de n.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tryptone	Becton Dickinson Co.	211705
Yeast Extract	Becton Dickinson	212750
Agar	Becton Dickinson	214010
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Agarose	Research Products International	A20090
Blocking Reagent	EMD Chemicals Inc.	69064
Tween 20	Fisher Scientific	BP337-100
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	BP359-212
Sodium Dodecyl Sulfate	Fisher Scientific	BP166-500
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-5
Chloroform	Fisher Scientific	BP1145-1
Escherichia coli BLT5403	EMD Chemicals Inc.	BLT5403	Genotype: F- ompT hsdSB (rB - mB -) gal dcm pAR5403 (AmpR)
Ampicillin, Sodium Salt	Research Products International	A40040
Ethidium bromide	Fisher Scientific	BP102-1
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich Corp.	A-9647
Penta-HIS primary antibody	Qiagen Inc.	34660
Goat anti-mouse alkaline phosphatise conjugate	Sigma-Aldrich Corp.	A-5153
para-Nitrophenylphosphate	Sigma-Aldrich Corp.	N-7653
T7-UP primer	EMD Chemicals Inc.		5'-GGAGCTGTCGTATTCCAGTC-3'
T7-DOWN primer	EMD Chemicals Inc.		5'-AACCCCTCAAGACCCGTTTA-3'
Qiaquick PCR Purification kit	Qiagen Inc.	28104
Qiaquick Gel Extraction kit	Qiagen Inc.	28706
Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit	Invitrogen Life Technologies	4336917
Heating Block	Pierce Chemical Co. (Thermo Fisher Scientific Co.)	18780
96-well Cell Culture Plates	Corning	Costar 3590
Isotemp Incubator Oven	Fisher Scientific	516D
Pasteur Pipettes, 5 ¾ in	Fisher Scientific	13-678-20A
ChromaView Transilluminator	UVP Inc.	TS-15
UV Shield	Oberon	071AF
Gloves, Nitrile	Fisher Scientific	19-170-010C
Sterile 1.5 ml tubes	USA Scientific Inc	1615-5500
10 ml Borosilicate Pipettes	Fisher Scientific	13-678-25E
Borosilicate culture tubes	Fisher Scientific	14-961-27
Uniskan I, ELISA plate reader	Labsystem and Flow Laboratories, Helsinki, Finland	Type 362