A Guided Materialen Screening aanpak voor de ontwikkeling van kwantitatieve Sol-gel Afgeleid Eiwit Microarrays

Summary

Een begeleide materiaal screening benadering van sol-gel afkomstig eiwit gedoteerde microarrays met behulp van een opkomende methode pin-drukken van fabricage ontwikkeling wordt beschreven. Deze methode wordt aangetoond door de ontwikkeling van acetylcholinesterase en multikinaseremmer microarrays, die voor rendabele kleine moleculen screening.

Abstract

Microarrays zijn gebruik in de ontwikkeling van high-throughput assays voor nieuwe materialen en werden kleine-molecule drug leads. Hierin beschrijven we een geleide materiaal screening aanpak sol-gel gebaseerde materialen die geschikt zijn voor het produceren driedimensionale eiwit microarrays te identificeren. De eerste benadering identificeert materialen die kunnen worden afgedrukt microarrays, versmalt het aantal materialen die momenten die compatibel zijn met een bepaald enzym assay en vervolgens slijpstenen in op optimale materialen gebaseerd op behoud van maximale enzymactiviteit. Deze benadering wordt toegepast op microarrays voor twee verschillende enzymanalyses, een met acetylcholinesterase en de andere met behulp van een set van vier kinasen betrokken bij kanker. In ieder geval was het mogelijk om microarrays die kunnen worden gebruikt voor de kwantitatieve kleine-molecule screening assays en productie van dosis-afhankelijke remmer responscurves produceren. Belangrijk is de mogelijkheid om veel mate screenenrials geproduceerde informatie over de soorten materialen die het meest geschikt zowel microarray productie en retentie van enzymactiviteit. De materialen gegevens geven inzicht in basismateriaal eisen die nodig zijn voor het op maat optimaal, high-density sol-gel afgeleid microarrays.

Introduction

Microarrays zijn populariteit binnen de wetenschappelijke gemeenschap verworven als een methode voor het verhogen van test throughput. Sinds de ontwikkeling van microarray technologie om genexpressie ¹ beoordelen in het midden van de jaren 1990, hebben microarrays gebruikt in de ontwikkeling van high-throughput assays om eiwit-eiwit en eiwit-klein molecuul interacties te identificeren en om nieuwe materialen te vinden met unieke eigenschappen. ^2-5 Recenter microarrays zijn ontwikkeld waarbij specifieke materialen worden gebruikt om functionele eiwitten te immobiliseren, waardoor een driedimensionale microarray element waarin eiwitten worden ingesloten, waardoor gemakkelijke meting van enzymatische activiteit en remming van de microarray zelf met een geschikt fluorescentie test die is gekoppeld substraat omzet. ^5-10 Belangrijk is dat dergelijke microarrays zijn ontworpen om alle noodzakelijke componenten voor het screenen monsters en controles samen omvatten in een zeer parallel mode. ^5,8

Vroege voorbeelden van eiwit microarrays werden meestal bereid met behulp van standaard methoden voor eiwitimmobilisatie op vaste dragers, zoals covalente binding, ¹¹ affiniteit vastleggen ³ en fysische adsorptie. ¹² Hoewel deze methoden van bio-immobilisatie zorgen voor verhoogde monsterconcentratie en versnelde reactiekinetiek nodig voor assay miniaturisatie, zij elk lijden nadelen. Meer algemeen houdt verlagen het natieve biomolecuul functionaliteit wegens chemische modificatie van het oppervlak, gehinderde toegang tot actieve plaatsen of onjuiste oriëntatie door niet-specifieke immobilisatie. Derhalve zijn alle werkwijzen resulteren in lagere testgevoeligheid ondanks een toename biomolecuul depositie, een reactie die waarschijnlijk ontstaat door de noodzaak om kunstmatig biomoleculen binden aan een oppervlak.

Een nieuwe benadering voor de productie van functionele biomolecule microarrays is via pin-drukken van eiwit-gedoteerdesilica sols op vaste dragers, die typisch ofwel gefunctionaliseerde glasplaatjes of individuele putjes van platen met microputjes. De sol-gel-werkwijze zelf gebeurt in een waterige omgeving bij kamertemperatuur, en het is de vloeibare precursor die wordt afgedrukt en gels te vangen biomoleculen in de 3D-matrix, waardoor eiwitrijke laden ¹³ en insluiten van meerdere componenten binnen dezelfde microarray element. ^13,14 Afstemming van de sol-gel afgeleide materiaal kan door zorgvuldige selectie van verschillende silica precursoren, en door het veranderen van de waterige component door het gebruik van verschillende buffers (pH, ionsterkte) en opname van verschillende toevoegsels (polymeren, kleine moleculen) een optimale materiaal bereiken, de specifieke aard afhangt van de biologische molecule die wordt ingesloten. ¹⁰

Een mogelijke beperking in verband met de ontwikkeling van sol-gel afkomstig eiwit microarrays via pin-afdrukken isde noodzaak om sol-gel composietmaterialen kunnen worden afgedrukt zonder gelering in de pen of met ongewenste eigenschappen (reproduceerbaar spotgroottes, barsten, slechte hechting, onverenigbaarheid met testcomponenten, slechte eiwitactiviteit) eenmaal afgedrukt op een oppervlak bepalen. ⁵ Gelijktijdige optimalisering van al deze parameters sluit aanpak waarbij materialen worden ontworpen novo of langzaam op seriële wijze onderzocht. Anderzijds, steekproeven van vele duizenden of tienduizenden materialen noch tijd niet kosteneffectief.

In dit artikel beschrijven we een gerichte screening aanpak die snelle identificatie van geschikte materialen kunnen voor de productie van eiwit-microarrays zonder willekeurig screenen van grote aantallen materialen. Met een geleide benadering worden die geschikt zijn voor microarray druk eerst geïdentificeerd, gevolgd door een reeks van kleine schermen identificeren optimale sol-gel afgeleide materialenal combinaties die kunnen reproduceerbaar worden afgedrukt, zonder barsten en verenigbaar zijn met een gegeven test. Tenslotte worden optimale materiaal geïdentificeerd op basis van retentie van enzymactiviteit en prestaties in een laatste kleine-molecule screeningstest. Op deze wijze kan een optimale materialen worden geïdentificeerd uit vele duizenden kandidaten met slechts enkele honderden assaystappen. We demonstreren deze benadering voor de productie van zowel high-density acetylcholinesterase en multikinaseremmer microarrays en het gebruik van dergelijke microarrays voor kleine molecule screening.

Protocol

1. Bereiding van additiefoplossingen

1. Bereid 25 en 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethaan (Tris base, _Mr 121,14 g / mol) en HEPES _(Mr 238.3 g / mol) bij pH 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0 en 8.2 in 50 ml centrifuge tubes. Stel de pH met 1 N HCl en NaOH respectievelijk. Bewaar bij kamertemperatuur en te vervangen na 3 maanden.
2. Bereid 24% (w / v) poly (vinylalcohol) (PVA): gewicht 2,4 g PVA _(Mw 9.000 - 10.000, 80% gehydrolyseerd) en voeg 10 ml gedeïoniseerd gedestilleerd water (DDH ₂ O) los het polymeer pellets door vortexen. Met de 24% (w / v) oplossing van gelijke volumes van 16% (w / v), 12% (w / v) en 8% (w / v) PVA oplossing te brengen. Degas oplossingen door sonicatie vóór gebruik. Bewaar bij 4 ° C gedurende 1 maand.
3. Bereid 24% (w / v) polyethyleenimine (PEI): voeg 4,8 ml van PEI _(Mw 1300, 50% (w / w) in _H2O) tot 5,2 ml van DDH ₂ O. Met de 24% (w / v) oplossing van gelijke volumes bereiden16% (w / v), 12% (w / v) en 8% (w / v) PEI oplossingen. Degas oplossingen door sonicatie vóór gebruik. Bewaar bij 4 ° C gedurende 1 maand.
4. Bereid 60% (w / v) polyethyleenglycol (PEG): weeg 6 g PEG _(Mw 600) en voeg 10 ml van DDH ₂ O, los de polymeerpellets door vortexen. Gebruik seriële verdunning tot een gelijk volume van 30% (w / v) PEG te bereiden. Degas oplossingen door sonicatie vóór gebruik. Bewaar bij 4 ° C gedurende 1 maand.
5. Bereid 24% (v / v) N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide (GLS): voeg 480 pl GLS (50% in ethanol - voorraad GLS kan het gebruik van een waterbad voor verwarmen oplossing en los kristallijn indien nodig) om 520 pl 95% (v / v) ethanol en meng gedurende 20 minuten door sonicatie. Met de 24% (v / v) oplossing met een gelijk volume van 16% (v / v) GLS oplossing. Maak nieuwe oplossingen voor gebruik per dag.
6. Bereid 24% (v / v) methyltrimethoxysilaan (MTMS): voeg 240 ul van MTMS tot 760 gl bestaande aangezuurd DDH ₂ O (pH 2,0, HC1) en meng gedurende 20 minuten met sonificatie. Met de 24% (v / v) oplossing met een gelijk volume van 16% (v / v) MTMS oplossing. Maak nieuwe oplossingen voor gebruik per dag.
7. Bereid 24% (v / v) bis [(3-methyldimethoxylsilyl) propyl] polypropyleen oxide (MDSPPO): voeg 240 pl MDSPPO tot 760 gl bestaande aangezuurd DDH ₂ O (pH 2,0, 1 N HCl) en meng gedurende 20 minuten door sonificatie. Met de 24% (v / v) oplossing met een gelijk volume van 16% (v / v) MDSPPO oplossing. Maak nieuwe oplossingen voor gebruik per dag.
8. Bereid 24% (v / v) 3 - (aminopropyl)-triethoxysilaan (APTES): voeg 240 pl APTES tot 760 gl bestaande aangezuurd DDH ₂ O (pH 2,0, 1 N HCl) en meng gedurende 20 minuten met sonificatie. Met de 24% (v / v) oplossing met een gelijk volume van 16% te maken (v / v) oplossing APTES. Maak nieuwe oplossingen voor gebruik per dag.
9. Bereid 24% (v / v) bis (triethoxysily) ethaan (bis-TEOS): voeg 240 ul van bis-TEOS 760 gl bestaande aangezuurde DDH ₂ O (pH 2,0, 1 N HCl) En meng gedurende 20 min door sonificatie. Met de 24% (v / v) oplossing met een gelijk volume van 16% (v / v) bis TEOS-oplossing. Maak nieuwe oplossingen voor gebruik per dag.
10. Bereid 24% (v / v) carboxyethylsilanetriol (Si-COOH): voeg 960 ul van Si-COOH (25% in DDH ₂ O) tot 40 gl bestaande aangezuurd DDH ₂ O (pH 2,0, 1 N HCl) en meng 20 min met de sonificatie. Met de 24% (v / v) oplossing met een gelijk volume van 16% (v / v) Si-COOH oplossing. Maak nieuwe oplossingen voor gebruik per dag.
11. Afzonderlijk bereid 3 mM N _ε - acetyl-L-lysine, D-sorbitol, α-α-trehalose _(Mr 188,22 g / mol, 182,17 g / mol, en 378,33 g / mol, respectievelijk) en 1,5 mM Triton X-100 (gemiddeld _Mw 625 g / mol) in DDH ₂ O. Volumes kunnen variëren, afhankelijk van hoeveel nodig is; maken nieuwe oplossingen voor gebruik per dag.
12. Bereid 60% (w / w) glycerol: voeg 2,4 g watervrij glycerol 1,6 g DDH ₂ O, mengen door vortex. Degas oplossingdoor sonicatie vóór gebruik. Bewaar bij 4 ° C gedurende 1 maand.
13. Bereid 30% (w / w) glycerol: voeg 1,6 g watervrij glycerol 2,4 g DDH ₂ O, mengen door vortex. Ontgas oplossing door sonicatie vóór gebruik. Bewaar bij 4 ° C gedurende 1 maand.

2. Bereiding van Silica Sols

Volgens de onderstaande procedures, de respectieve sols, wanneer op ijs gehouden, kan worden gebruikt tot 1 uur na toevoeging van water. Sols gebruikt na 1 uur resulteren in een verminderde / inconsistent materiaal geleringstijden.

1. Voorbereiding van een natrium-silicaat (SS) gebaseerde sol
   1. Weeg 120 g van de ionenwisselaar in een 500 ml plastic beker.
   2. Voeg 150 ml van 0,1 N HCl en roer gedurende 1 uur met een 2-inch magnetische roerstaaf.
   3. Filter de oplossing om met een Büchner trechter verbonden met vacuüm.
   4. Voeg langzaam DDH ₂ O tot de gefilterde hars wassen totdat het resulterende filtraat is duidelijk. Dit duurt ongeveer 100ml DDH ₂ O.
   5. Verzamelen en opslaan van de bereide hars in een plastic container bij kamertemperatuur gedurende 1 maand.
   6. Weeg 2,59 g natriumsilicaat (SS, 27% ​​(w / w) _SiO2, 10% (w / w) NaOH) in een 50 ml plastic beker.
   7. Voeg 10 ml van DDH ₂ O aan de SS. Roer voorzichtig met de hand om de oplossing te mengen.
   8. Weeg 5,60 g van de voorbereide hars in een aparte 50 ml plastic beker. In de natriumsilicaatoplossing toevoegen en gedurende 2 minuten met een magnetische roerstaaf inch.
   9. Filtreer het mengsel oplossing met een Büchner trechter verbonden met een aspirator aan een waterkraan.
   10. Gebruik een 10 ml plastic spuit uitgerust met een 0,2 um membraan filter om de soloplossing filteren. Dit levert een sol met 5,6% (w / w) silica als SS verdere tekst wordt verwezen. Houd de sol op ijs wanneer niet in gebruik.
   11. ½ SS: 1 ml van de bereide SS sol aan 1 ml DDH ₂ O, meng door vortex. Houd de sol op ijs wanneer deze niet ingebruiken.
2. Voorbereiding van een diglycerylsilane (DGS) gebaseerde sol
   1. Synthetiseren DGS zoals elders beschreven. ^15,16 Winkel kristallijn DGS in een exsiccator bij kamertemperatuur gedurende maximaal 6 maanden.
   2. Weeg ongeveer 1 g van kristallijn DGS.
   3. Gebruik een vijzel en stamper om de DGS vermalen tot een fijn poeder. Voer deze stap zo snel mogelijk vochtabsorptie te voorkomen uit de lucht.
   4. Overdracht van de fijngemalen DGS zorgvuldig naar een lege 20-ml scintillatiefles, noteer de massa (op een duizendste van een gram).
   5. Voeg DDH ₂ O tot een 0,5 g / ml DGS opleveren.
   6. Ultrasone trillingen het gehydrolyseerde DGS op ijs gedurende 20 minuten, meng door vortex gedurende 5 seconden om de 5 minuten. Tijdens vochtige dagen, kan volledige ontbinding van DGS vereisen toevoeging van 10 ul van 1 N HCl. Dit moet worden toegevoegd aan de oplossing vóór sonicatie.
   7. Gebruik een 3-ml plastic spuit uitgerust met een 0,2-um membraan filter om de soloplossing filteren, verwijderen van fijne deeltjes. Dit levert een sol met 5,0% (w / w) silica genoemd DGS in verdere teksten. Houd de sol op ijs wanneer niet in gebruik.
   8. ½ DGS: voeg 1 ml bereide DGS sol aan 1 ml DDH ₂ O, meng door vortex. Houd de sol op ijs wanneer niet in gebruik.

3. Pre-screening om Printable Materialen identificeren

Een algemeen schema dat de verschillende stadia van de geleide factoranalyse gebruikt bedrukbare materialen te identificeren wordt getoond in figuur 1. Een minimale totale materiaal volume van 100 ul wordt aanbevolen. Het gebruik van kleinere volumes maakt visualiseren materiaal gelering moeilijk.

1. Fase 1: buffer en silaan
   1. Voeg 50 ul van buffer (25 mM Tris en 50 of HEPES bij pH 7.0, 7.2, 7.4, 7.6, 7.8, 8.0, 8.2) een 2 ml glazen scintillatievat.
   2. Voeg 50 ul van de geschikte sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) en vortex mengsel in een on-and-off mode voor 10 sec doorhet verplaatsen van de flacon op en naast de vortex mixer.
   3. Stel materialen rusten bij kamertemperatuur, monitoring van de tijd materiaal gelering. De geleringstijd wordt gedefinieerd als het punt waarbij het materiaal niet meer vrij stromen op de injectieflacon te draaien een hoek van 45 °.
   4. Exclusief materiaalcombinaties met geleringstijden minder dan 2,5 uur van latere wezenlijke screening fasen.
2. Fase 2: buffer, silaan en polymeer
   1. In een 2 ml glazen scintillatievat, voeg 3,13 gl hetzij 16% (w / v) of 8% (w / v) PVA / PEI-oplossing of 6,3 ui 30% (w / v) of 60% (w / v) PEG oplossing.
   2. Voeg 50 mM HEPES (pH 8,0) om de totale omvang brengen 50 pl, meng de oplossing vortex.
   3. Voeg 50 ul van de geschikte sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS), meng er de in stap 3.1.2 beschreven manier.
   4. Exclusief materiaalcombinaties met geleringstijden (zoals gedefinieerd in stap 3.1.3) minder dan 2,5 uur van latere wezenlijke screening fasen.
3. Fase 3: buffer, silaan, polymeer en organosilaan
   1. In een 2 ml glazen scintillatievat, voeg 3,13 gl hetzij 16% (w / v) of 8% (w / v) PVA oplossing of 6,3 ui 30% (w / v) of 60% (w / v) PEG oplossing.
   2. Voeg 3,13 ui 16% (w / v) organosilaan (GLS, MTMS, MDSPPO, bis-TEOS, Si-COOH of APTES).
   3. Voeg 50 mM HEPES (pH 8,0) om de totale omvang brengen 50 pl, meng de oplossing vortex.
   4. Voeg 50 ul van de geschikte sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) en meng in de in stap 3.1.2 beschreven manier. Exclusief materiaalcombinaties met geleringstijden (zoals gedefinieerd in stap 3.1.3) minder dan 2,5 uur van latere wezenlijke screening fasen.
4. Fase 4: buffer, silaan, polymeer, organosilan en kleine moleculen additief
   1. In een 2 ml glazen scintillatievat, voeg 2,08 gl hetzij 24% (gew / vol) of 12% (w / v) PVA oplossing of 6,3 ui 30% (w / v) of 60% (w / v) PEG oplossing.
   2. Toevoegen2,08 ui 24% (w / v) organosilaan (GLS, Si-COOH).
   3. Voeg 2,08 ul van de 3 mM kleine moleculen oplossing (N _ε - acetyl-L-lysine, D-sorbitol, α-α-trehalose) of 1,5 mM (Triton X-100).
   4. Voeg 50 mM HEPES (pH 8,0) om de totale omvang brengen 50 pl, meng de oplossing vortex.
   5. Voeg 50 ul van de geschikte sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) en meng in de in stap 3.1.2 beschreven manier.
   6. Exclusief materiaalcombinaties met geleringstijden (zoals gedefinieerd in stap 3.1.3) minder dan 2,5 uur van latere wezenlijke afdrukken fasen.

4. Voorbereiding van Printable Eiwit-gedoteerde materialen

De materialen die aan het einde van stap 3.4.6 worden overgedragen in bedrukbaarheid studies, met het geschikte enzym sinds kort onder de sol. In alle gevallen hieronder beschreven, waterige oplossing die alle bestanddelen behalve het silaanbereid in een microtiterplaat, gevolgd door de toevoeging van de sol vlak voor afdrukken. Om het gebruik van een 384-microtiterplaat is er een een totaaloplossing volume van 50 ul in plaats van 100 pi.

1. Acetylcholinesterase (AChE) microarray
   1. Bereid een 2 kU / ml oplossing van AChE in 50 mM HEPES (pH 8,0) na partijspecifieke enzymactiviteit (eenheden van activiteit per mg) door de fabrikant gegevens.
   2. Aliquot 2 kU / ml enzym voorraad oplossing in 5 pi fracties met behulp van 500-ul microcentrifugebuizen en bewaar bij -20 ° C. 2 kU / ml AChE voorraadoplossingen stabiel tot 4 maanden indien bewaard bij -20 ° C.
   3. Bereid basismaterialen door het combineren van de helft van de volumes van de overeenkomstige polymeren, organosilanen en kleine moleculen additieven geïdentificeerd door middel van stap 3.4.6 in een 384-wells microtiterplaat.
   4. Voeg 5 ul van 2 kU / ml AChE in 50 mM HEPES (pH 8,0).
   5. Gebruik 50 mM HEPES (pH 8,0), brengen de gecombineerdegoed volume tot 25 pi meng door pipetteren de oplossing op en neer meerdere malen.
2. Multikinaseremmer microarray
   1. Bereid 100 ng / ul kinase-oplossingen (p38a, MAPK2, EGFR, GSK-3β) in DDH ₂ O na de activiteit (U / ml of U / mg) en de hoeveelheid informatie die door de fabrikant. WINKEL kinase oplossingen in aliquots van 2 pl bij -80 ° C.
   2. Bereid kinasesubstraten (MBP, p (E ₄ Y), GSM) en 5 mg / ml, 50 mg / ml of 300 uM in DDH ₂ O, volgens de hoeveelheid informatie van de fabrikant. WINKEL substraten in aliquots van 2,5 ul bij -80 ° C.
   3. Bereid basismaterialen door het combineren van de helft van de volumes van de overeenkomstige polymeren, organosilanen en kleine moleculen additieven geïdentificeerd door middel van stap 3.4.6 in een 384-wells microtiterplaat.
   4. Aan elk putje met de basismaterialen, voeg 2,5 pl kinase en 2 ui van zijn respectieve substraat (p38a en MBP en MBP MAPK2, EGFR en p (E ₄ Y), GSK-3β en GSM), zoals bereid in de stappen 4.2.1 en 4.2.2 respectievelijk.
   5. Gebruik 50 mM HEPES (pH 7,4), breng de gecombineerde goed volume 25 pi. Meng door pipetteren.

5. Microarray Formation

In dit gedeelte wordt de gedetailleerde procedure voor het afdrukken van materialen op een enkele dia oppervlak. Dat het op meerdere gemodificeerde glijvlakken (amine, epoxy, aldehyde en PMMA), wordt deze procedure 4 maal herhaald.

1. Vormen microarrays met behulp van een contact pin-printing robot uitgerust met een XYZ podium. Gebruik sleuven mantel kunnen van 100 uM diameter aan het eiwit-gedoteerde sols storten.
2. Stel luchtvochtigheid binnen de grafische kamer naar 80-90%. Vochtigheid <80% kan tot monster verdamping en inconsistenties in druk, vanwege de kleine hoeveelheden afzetting.
3. Ultrasone trillingen kunnen in DDH ₂ O gedurende 15 min vóór het afdrukken en drogen onder een stikstofstroom. Gebruik een pijp cleaner om restvocht vanuit de penhouder te verwijderen en zorgvuldig plaats de pin in de printkop. Falen om resterende vocht te verwijderen kan de pin verhinderen vrijelijk bewegen met de houder, waardoor gemiste plekken.
4. Controle-array patronen via de Chip Writer Pro (CWP) programma. Voor elk monster ruim binnen de 384-put bron plaat, zijn 200 plekken (maximaal aantal plekken per opname met behulp van de SMP3 schede pin) gedrukt op een oppervlak-gemodificeerd glasplaatje.
5. Aanvang met het drukproces via de software. Stel reizen in het XY-richting tot 10 mm / s en sample naderingssnelheid (Z-richting) tot 2 mm / s met een 2,5 sec sample laadtijd.
6. Pauzeert de run door CWP. Laat de pin in het monster en voeg 25 ul van de respectievelijke sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) aan de put met een pipet. Meng de oplossing om met een up-en-neer te pipetteren motion herhaald 50x. Bij het mengen door pipetteren, het minimaliseren van de hoeveelheid lucht verwerkt in de oplossing. Luchtbellen preventiet voltooien laden van het monster binnen de pin.
7. Aanvang met het drukproces door CWP, en op een dia oppervlak af te drukken het monster. Pauzeert het drukproces voordat monster uit de daaropvolgende bron plaat ook.
8. Verwijder de afdrukken pin met behulp van een magneet en plaats een pijpenrager in de printkop om vocht ophoping in de printkop te voorkomen.
9. Spoel de drukkerij pin met DDH ₂ O, en ultrasone trillingen in schone DDH ₂ O voor 30 sec.
10. Laat het bedrukte pen onder een stroom van stikstof en verwijder de pijp schoner, het plaatsen van de pen terug in de printkop.
11. Beginnen afdrukken door de stappen 5,6-5,10, voor alle monsters steeds binnen de bron plaat. Tot 12,000 spots van 100 urn diameter worden afgezet op een dia.
12. Deze werkwijze kan ook worden toegepast om het afdrukken materialen op de bodem van putjes in een 96-well microplaat. Na de CWP kalibratiebestand, opnieuw kalibreren de drukkerij pin om ervoor te zorgen de distance reisde tussen spot depositie is boven de hoogte van de microwell plaat. Hierdoor kan de pen om consequent uit tot goed daarna lineair af zonder de pen.
13. Leeftijd van de matrix ten minste 30 min en tot 24 uur in de drukkerij kamer bij 80-90% luchtvochtigheid na voltooiing van het gehele experiment drukken.

6. Acetylcholinesterase Activity Assay

1. Voorbereiding positieve controle (PC) monsters
   1. Bereid 1 mM acetylthiocholine jodide (ATCH: _Mr 289,18 g / mol) in 4% glycerol, 25 mM Tris (pH 7,0) in een 1,5 ml microcentrifugebuis. Atch moet vers worden bereid voor elk gebruik en de toepassing van een buffer bij pH 7,0 als hogere pH buffers veroorzaken snelle autohydrolysis, het produceren van valse positieven. Het uiteindelijke volume kan worden gevarieerd afhankelijk van het aantal monsters (25 ul per monster).
   2. Voeg 0,14 ul van 5 mM BODIPY-Fl-L-cystine 25 ui 1 mM ATCH in het putje van een microtiter-384 plate.
   3. Voeg 24.86 ui 4% glycerol, 25 mM Tris (pH 7,0); meng door voorzichtig pipetteren tot belvorming in de oplossing te voorkomen. Potentiële remmers kan in de PC-oplossing alvorens een volume van 50 ul met buffer worden opgenomen.
2. Voorbereiden van negatieve controle (NC) monsters
   1. Voeg 0,14 ul van 5 mM BODIPY-Fl-L-cystine 49,86 pi 4% glycerol, 25 mM Tris (pH 6,5) in het putje van een microtiterplaat met 384. Meng door pipetteren.
3. Overdrukken PC en NC-oplossingen
   1. Overdrukken de leeftijd microarrays volgende stappen 5,1-5,10 (het negeren van stap 5.6) van het protocol. Gebruik sleuven schede pinnen van 235 uM diameter naar de PC en NC overdrukken oplossingen deponeren. Dit garandeert de oplossing omvat de eerder gedeponeerde plek geheel.
   2. Leeftijd arrays op 80-90% vochtigheid gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Vanwege de autohydrolysis van atch, kan langere incubatietijd tijden resulteren in valse positieven of verhoogd enzyme activiteit.

7. Kinase activiteit Assay

1. Bereid 500 uM adenosine 5'-trifosfaat (ATP) stock oplossing met ATP (100 mM) opgeslagen bij -20 ° C. Maak verse oplossing voor elk experiment en het volume aan experimentele behoefte aan te passen: elke printoplossing vergt 5 pl.
2. Bereid een 100 mM magnesiumchloride _(MgCl2: M _r 95.21 g / mol) stockoplossing in DDH ₂ O.
3. Positieve controle (PC)
   1. Voeg 2,5 ul van 100 mM _MgCl2 en 5 pl 500 uM ATP het putje van een microtiterplaat met 384.
   2. Breng het totale volume en 50 pi met 50 mM HEPES (pH 7,4), meng door pipetteren. Potentiële remmers kan in de PC-oplossing alvorens een volume van 50 ul met buffer worden opgenomen.
4. Negatieve controle (NC)
   1. Voeg 2,5 ul van 100 mM _MgCl2 en 5 pl DDH ₂ O het putje van een 384-microtiter plaat.
   2. Breng het totale volume en 50 pi met 50 mM HEPES (pH 7,4) en meng door pipetteren.
5. Overdrukken PC en NC assay cofactoren
   1. Volg stap 6.3.1 van het protocol.
   2. Leeftijd arrays op 80-90% vochtigheid gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
6. Slide kleuring
   1. Plaats gedrukt microarray dia's afzonderlijk in een petrischaal met voldoende kleurstof (uit kit) om de volledige dia te dekken. Schud matig (~ 200 rpm) gedurende 45 minuten met behulp van een bord shaker.
   2. Verwijder de dia met behulp van pincet en plaats in een schone petrischaal met wasbuffer (uit kit). Schud matig (~ 200 rpm) gedurende 45 minuten met behulp van een bord shaker.
   3. Verwijder de dia met behulp van een tang en draai droog met een conventionele desktop microarray microcentrifuge uitgerust met een houder.

8. Microarray beeldvorming en-analyse

1. Imaging

   Merk op dat de weergavemethode zal sijzondere aan het type array reader beschikbaar. Voor deze studies, een Alpha Innotech NovaRay imager met een witte lichtbron en CCD-detectiesysteem voorzien van een 478 ± 17 nm excitatie en 538 ± 21 nm emissie filter voor de AChE microarrays, en 530 ± 40 nm excitatie en 614 ± 62 nm emissie filteren kinase microarrays gebruikt. Confocale laser scanning systemen kunnen ook gebruikt worden voor de arrays, hoewel de specifieke instellingen van het instrument is.

   1. Plaats dia in de diahouder met de vlekken naar boven.
   2. Stel het aantal voorvertoning secties (minimaal 2 wordt aanbevolen, een aan elk uiteinde van de microscoop glijbaan), resolutie (minimaal 4 micrometer wordt aanbevolen) en belichting (auto wordt aanbevolen) binnen de imaging software.
   3. Afbeelding dia verwerven en opslaan als een "tiff." Bestand.
2. Analyse
   1. Open afbeelding verworven dia in ImageJ64.
   2. Klik op het ovaal selectie gereedschap en meet designaal intensiteit van elke spot met de optie maatregel onder het tabblad analyseren. Bij het selecteren van het gebied te meten, selecteert een gebied iets groter dan de waargenomen vlek en consistente omvang tussen spots ImageJ om subjectiviteit te beperken.
   3. Gemiddelde intensiteit van 25 vergelijkbare PC spots, gedeeld door de gemiddelde intensiteit van 25 soortgelijke NC spots aan PC / NC's voor de individuele materiële samenstellingen te verkrijgen.

Results

Door het uitvoeren van een geleide factoranalyse van het materiaal scherm, waren we in staat om het aantal geteste materialen van ~ 20.000 tot enkele honderden die geleringstijden voor beschrijfbaarheid minimaliseren. Door het toepassen van een strikte leidraad waarbij materiaal geleringstijd van 2,5 uur of meer, materialen die waarschijnlijk de drukkerij pinnen verstoppen of produceren reproduceerbare arrays werden nooit gedrukt. De bedrukbare materialen geïdentificeerd om voldoende (> 2,5 uur) geleringstijden hebben gedrukt werden op 4 verschillende gefunctionaliseerde glasplaatje oppervlakken. Om te worden beschouwd als "printen", het maximum aantal vlekken per opname volume van de pen moesten worden afgedrukt (SMP3 = 200). Spots werden ook beoordeeld voor spot morfologie zodat er geen scheuren of ongewenste fasescheiding had plaatsgevonden met behulp van eenvoudige helderveld microscopie zoals getoond in figuur 2.

Vanaf deze fase van geïdentificeerde bedrukbare materialen, werden microarrays geproduceerd met AChE enkinases opgenomen in de gebufferde waterige component. Materialen die compatibel zijn met de testprocedure (inclusief mogelijke overdrukken en wassen of vlekken stappen) waren werden geïdentificeerd door het observeren van het behoud van microarray plekken (geen kraken, verlies van plekken of ongewone fluorescentie patronen) en een positieve controle (PC) om negatieve controle (NC ) ratio groter dan 1, zoals waargenomen door afbeelding. Aangezien dit ongeveer 50% van het materiaal een grotere PC / NC verhouding van 3 werd gebruikt om optimale materialen definiëren met behoud van eiwit activiteit. Via deze methode 26 sol-gel afgeleide materialen die AChE en 2 materialen die kinases tevredenheid van> 3 PC / NC criteria. Figuur 3 en figuur 4 tonen een grafische analyse van de 5 geleide materiaal scherm stappen voor de identificatie van optimale AChE en kinase microarrays, respectievelijk.

De assays kunnen ook worden bevestigd door het genereren van een Z-score ^17. Dit werd gedaan met behulp van het materiaal dat de hoogste PC / NC verhouding geproduceerd. Figuur 5 toont de Z "plot verkregen door het signaal gegenereerd uit spots 200, 100 en PC 100 NC na overdrukken indicatorkleurstof en substraat de AChE matrix vergelijken. De AChE en kinase arrays resulteerde in de respectieve Z-scores van 0,60 en 0,67, een aanwijzing voor een uitstekende assay. Er moet worden opgemerkt dat voor assay validatie had on-matrix enzym, kleurstof, substraat en co-factor concentratie worden geoptimaliseerd door het overdrukken van een reeks concentraties van elke component en de concentratie die het sterkste signaal kiezen geproduceerd, zoals in detail elders . ⁵

Om de testen te valideren, werden kwantitatieve remming verkregen met bekende en onbekende AChE remmers, met resultaten in duplo uitgevoerd en gebruikt om dubbele plots (Figuur 6A) en inhibitie curven (figuren 6B en 6C) te produceren. Spots werden eerst overdrukt met mengsels van bekende biologisch actieve kleine-molecule inhibitoren dan met kleurstof en substraat, en controle mengsels die hetzij bekend remmers of geen remmer werden opgenomen. Duplicate plots werden gegenereerd enzymactiviteit beoordelen en allerlei mengsels die resulteerden in minder dan 25% enzymactiviteit werd als positief voor remming. Afzonderlijke verbindingen uit dergelijke mengsels werden vervolgens getest in tweevoud aan de specifieke kleine molecule (s) die verantwoordelijk is voor de remming te identificeren. Eenmaal geïdentificeerd, deze kleine moleculen is de kwantitatieve remmingskrommen genereren _IC50 waarden remmingconstanten bepalen.

Vergelijkbare kwalitatieve resultaten werden verkregen met behulp van de multikinaseremmer array met een gemeenschappelijke kinase remmer, staurosporine. Figuur 7A en 7B tonen imago van de microarray en geven aan dat het signaal intensiteiten na overdrukken en kleuren van de multikinaseremmerarray zoals verwacht voor een negatieve controle (- ATP), positieve controle (+ ATP) en bekende remmer (+ ATP + inw). De mogelijkheid om kwantitatieve gegevens te verkrijgen remming van de microarrays tonen, werd een concentratie-afhankelijke inhibitie assay uitgevoerd voor een enkele kinase. Zoals getoond in figuren 8A en 8B, signaalintensiteit afneemt als inhibitor concentratie toeneemt, en de reactie volgt de verwachte concentratie afhankelijke remming curve van de p38α/MBP kinase / substraatsysteem.

Figuur 1. Algemeen schema voor de begeleide materialen screening aanpak. Elk blok staat voor een stap van het scherm in de juiste volgorde. Getallen aan de linkerkant is het totaal aantal materialen voor analyse bereid. Met een geleertijd van meer dan 2,5 uur (materialen geleringstijden minder dan 2,5 uur are aangegeven door de drie slag), wordt het aantal materialen dat elke fase voorbij en tijdens de materiële scherm overgedragen aangegeven door het aantal aan de rechterkant. * Geeft materialen met minder dan optimale fasescheiding.

Figuur 2. Optische beelden tonen verschillende faalwijzen van materialen op de bedrukbaarheid stap van het scherm. Een beeld van een "goede" materiaal (tweede rij, derde kolom) wordt ook getoond ter vergelijking. Overgenomen met toestemming van ^{referentie-8,} copyright 2013 American Chemical Society.

Figuur 3. Een gerichte materiaal screening aanpak voor de identificatie van optimale materialen voor het vervaardigen van sol-gel-afgeleide AChE microarrays. Overgenomen met permissie uit referentie ^5, copyright 2013 American Chemical Society.

Figuur 4. Een gerichte materialen screening aanpak voor de identificatie van optimale materialen voor het vervaardigen van sol-gel-afgeleide kinase microarrays. Overgenomen met toestemming van ^{referentie-8,} copyright 2013 American Chemical Society.

Figuur 5. (A) Een deel van AChE microarray tonen HC (helder groen) en LC (lichtgroen) vlekken (een zwart-groen palet werd toegepast als pseudocolor voor de duidelijkheid van de presentatie), (B) een vergrote weergave van de boxed gebied om plek te markeren morfologie en uitlijning;. en (C) een Z 'plot Solid lijnen geven het gemiddelde van de repliceert, terwijl stippellijnen corresponderen met 3SD. Overgenomen met toestemming van referentie ^5, copyright 2013 American Chemical Society.

Figuur 6. (A) Dubbele plot voor on-matrix screening van synthetische analogen van alkaloïden Amaryllidaceae, (B) ₅₀ IC percelen vastgestelde potentiële inhibitoren aangeduid als respectievelijk verbindingen 1 en (C) verbinding 2, met foutbalken vertegenwoordigen een standaarddeviatie van het gemiddelde van 25 repliceert. Representatieve plaatsen blijken te verschillen in signaal evenredig met remmerconcentraties illustreren. Overgenomen met toestemming van referentie ^5, copyright 2013 American Chemical Society. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

nt "fo: keep-together.within-page =" altijd ">
Figuur 7. On-reeks testen van vier kinasen gebruik 1.4SS/1.0PVA voor invangen wordt en op een amine-gederivatiseerde slide. (A) Een beeld van een deel van microarray waarbij vlekken met kinasen samen ingesloten hun respectieve substraten werden overdrukt met buffer (NC, bovenste rij), of oplossingen die ATP (PC, middelste rij) of ATP + staurosporine (onderste rij). (B) Staafdiagram signaalintensiteiten vergelijking tussen geremd en ongeremd reacties, na aftrek van de achtergrond signalen en de foutbalken vertegenwoordigen een standaarddeviatie van het gemiddelde van 25 duplo's. Overgenomen met toestemming van ^{referentie-8,} copyright 2013 American Chemical Society.

Figuur 8. Inhibiti. on test op een p38a/MBP microarray (A) Secties van microarrays tonen representatieve plekken overspotted met verschillende concentraties van staurosporine, zoals aangegeven (de beelden werden verkregen door een enkele scan van dezelfde dia; samengestelde afbeelding wordt getoond voor de duidelijkheid). (B) IC ₅₀ curve gegenereerd op basis van de geanalyseerde matrix afbeeldingen. De intensiteit verkregen op 100 mM werd afgetrokken van alle beelden, alle andere intensiteiten werden genormaliseerd door de intensiteit verkregen op 10 nM tot een waarde van 100% activiteit. Overgenomen met toestemming van ^{referentie-8,} copyright 2013 American Chemical Society.

Figuur 9. Afbeeldingen van microscopische stealth pen gebruikt voor contact pin-afdrukken met verschillende imperfecties: (A) verstopt, (B) verbogen.

Discussion

De hier beschreven methode werd gekozen als het meest geschikt voor het identificeren printable sol-gel afgeleide materialen met een contact printer, waardoor een tijd-en kosten-effectieve procedure voor het snel identificeren van optimale materialen zonder grote hoeveelheden materialen te screenen. Uit een totaal van ~ 20.000 mogelijke materialen, het mogelijk was ~ 200 materialen die geschikt zijn voor afdrukken op basis van geleringstijd alleen waren identificeren. Dit het aantal materialen moeten worden voorbereid vervolgens printen proeven aanzienlijk verminderd. Deze bedrukbare materialen werden vervolgens op 4 dia oppervlakken voor een totaal van 768 materiaal-slide combinaties afgedrukt. Gemiddeld kan 50 vlekken / replica van een materiaal worden gedrukt in ca. 3 min., inclusief sample laden, spot depositie en pin reiniging. Van deze 155 materiaal, ongeveer 20%, toegestaan ​​voor het drukken het maximum aantal vlekken per opname oplossing en geproduceerd reproduceerbaar vlekgroottes. Opgemerkt wordt dat de 4 slide oppervlakken getest, materialen beter afgedrukt in de volgorde: amine> epoxy> aldehyde> PMMA; PMMA dia's leverden geen bruikbare arrays voor alle materialen. Dit is waarschijnlijk toe te schrijven aan de polariteit van de oppervlaktelaag. Vergelijking van de bovengenoemde glijvlakken zijn de meer polaire amine en epoxy beter geschikt voor de sols in vergelijking met de PMMA dia. Verder van de geteste oppervlakken de amine gecoate glaasjes een potentieel positief geladen oppervlak voor het ingebrachte anionische sol te binden. We vermoeden, het silicium nanodeeltjes op het raakvlak tussen de glijbaan en de sol interactie langs het oppervlak. Zowel de epoxy en de aldehyde glijvlakken missen dezelfde initiële kosten gebaseerde interactie. Om een ​​optimale plek depositie verzekeren is het sterk aanbevolen om pre-gecoate glaasjes gebruiken van een leverancier, zoals Arrayit. In-house coating produceert inconsistent oppervlakken die leiden tot slechte reproduceerbaarheid spot ¹³ ​​en, in sommige gevallen, kan leiden tot problemen kwantificeringblemen. ¹⁸ Van even groot belang, temperatuur en vochtigheid van invloed op de "bedrukbaarheid" van de materialen. Hoewel er geen gedetailleerde studies over de effecten die verband houden met temperatuur werden uitgevoerd, werd afdrukken altijd uitgevoerd bij kamertemperatuur (23 ± 3 ° C). Vochtigheid (meer dan 80%) werd gecontroleerd binnen de afdruk kamer om onregelmatige vorm depositie door de kleine hoeveelheden afzetting (0,7-2,3 nl) en verdamping te voorkomen.

Terwijl het materiaal scherm werd geleid naar het identificeren optimale sol-gel afgeleide materialen speciaal voor het afdrukken van AChE en kinasen, een klein aantal materialen geïdentificeerd die werkte voor beide eiwitten. Inderdaad, zowel van de materialen die werden geïdentificeerd kinase microarray fabricage waren gebaseerd op PVA SS + + glycerol en beide materialen werden geïdentificeerd in de 26 materialen geselecteerd AChE microarrays. Deze "optimale" materialen kan een generieke uitgangspunt bieden voor de verdere ontwikkeling van protein gedoteerde sol-gel gebaseerde microarrays en kleine schermen rond deze samenstellingen kunnen identificeren nog betere materialen voor microarray fabricage. Een tweede punt om op te merken is het belang van het gebruikte enzym. Bij AChE (nogal robuust enzym), 26 (of ongeveer 40%) van de oorspronkelijke 66 materialen geïdentificeerd als assay-compatibele behield de activiteit van AChE ingesloten. Voor de meer delicate kinasen, slechts 2 van de 69 assay-compatibele samenstellingen, of ruwweg 3% van het materiaal, konden de activiteit van kinasen behouden. Terwijl voldoende aantallen van verschillende enzymen zijn niet onderzocht om definitieve uitspraken te doen, lijkt het erop dat het optimaliseren scala van constructies met relatief onstabiel enzymen kan leiden tot de identificatie van materialen die een breed scala aan eiwitten te mutliplexed microarray fabricage mogelijk kunnen vangen.

Ongeacht de gekozen eiwit, grote cut-off factor voor het identificeren bedrukbare materiaal was behoefte aan een langemateriaal geleringstijden (> 2,5 uur). Bij het ontwikkelen SS based sol-gel materiaal, is het zeer belangrijk dat, na ionenuitwisseling en filtratie werd het sol is bij ongeveer pH 4. Sols met een lagere initiële pH kan resulteren in materialen met een lager dan neutrale pH hebben een negatieve invloed enzymactiviteit. ¹⁹ Afstellen hoeveelheid Dowex (ionenwisselaar) SS kan de uiteindelijke pH van de sol te wijzigen. Wanneer een nieuwe partij van de hars is bereid de verhouding van hars tot SS dient te worden aangepast aan sols produceren bij een pH van ongeveer 4 volgens de procedure van punt 2 van het protocol.

Ook de bereiding van kristallijn DGS is vaak een bron van fouten in verband met materiaal falen bij gebruik van DGS sols voor het biomolecuul beknelling. Hoewel hier niet in detail gerapporteerd, moet grote zorg tijdens de synthese van kristallijne DGS, met name de noodzaak de aanwezigheid van water tijdens de synthese voorkomen dat polyglycerated silica produceren wordentes eerder dan monomere DGS. Ook, vanwege de hygroscopische aard van DGS het kristallijne monster moet bewaard worden gedroogd en binnen 6 maanden na synthese. Kristallijne DGS ouder dan 6 maanden mogen niet volledig oplossen (als gevolg van gedeeltelijk gecondenseerde polyglyceryl silicaat), zelfs met sonicatie in een zure omgeving. Onvolledige DGS ontbinding produceert solen met onbekende en oncontroleerbare silica inhoud en dus, minder robuuste materialen.

Een belangrijk punt om op te merken met de contactpersoon afdrukken is de kwaliteit van de pennen. Beschadigde of onjuiste behandeling kunnen (figuur 9) zal nooit tot reproduceerbare arrays onafhankelijk van het materiaal dat wordt afgedrukt. Het wordt aanbevolen om pin kwaliteit te controleren met behulp van een dissectie microscoop om ervoor te zorgen kapot of verstopt pinnen worden niet gebruikt. Zorgvuldige behandeling verzekert een lange levensduur voor het pinnen. Vrij verkeer van de pen is ook belangrijk. Wanneer vocht wordt opgesloten in de printkop tussen de kop en de pen, de penzal niet stoel correct en zal dus goed contact maken met het oppervlak, wat resulteert in een onvoldoende afzetting van materiaal.

Tot slot hebben we een gedetailleerd uit meerdere screening aanpak voor het ontwikkelen van high-density eiwit gedoteerde pin-gedrukte microarrays. De screening vereist optimalisering van materiaaleigenschappen (geleertijd en bedrukbaarheid) om afdrukken van materialen, gevolgd door meer gerichte screening materialen die compatibel zijn met een gegeven test en kunnen enzymactiviteit behouden te identificeren. Deze geleide materiaal screening aanpak kan worden toegepast om extra microarray formaten om tijd en kosten van een productie efficiënte high-density microarrays verminderen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
Poly(vinyl alcohol) (PVA)	Sigma-Alderich	360627	80% hydrolozyed, Mw 600
Polyethylene glycol 600 (PEG)	Sigma-Alderich	87333
Polyethylenimine (PEI)	Sigma-Alderich	482595	50 wt% solution in water
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH)	Gelest, Inc.	SIC2263.0	25% in water
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS)	Gelest, Inc.	SIT8189.0	50% in ethanol
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO)	Gelest, Inc.	SIB1660.0
Methyltrimethoxysilane (MTMS)	Gelest, Inc.	SIM6560.1
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS)	Gelest, Inc.	SIB1817.0
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)	Gelest, Inc.	SIA0610.0
Glycerol	Sigma-Alderich	49767
D-Sorbitol	Sigma-Alderich	240850
D-(+)-Trehalose dihydrate	Sigma-Alderich	T9531
Triton X-100	Sigma-Alderich	X-100
Nε-Acetyl-L-lysine	Sigma-Alderich	A4021
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Alderich	154563
HEPES	Sigma-Alderich	H3375
Sodium hydroxide, 1.0 N	LabChem Inc.	LC24350-2
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N	LabChem Inc.	LC15300-2/LC152220-2
Magnesium chloride	Sigma-Alderich	M8266
Diglycerolsilane (DGS)			Prepared in laboratory
Sodium silicate solution	Fisher Scientific	SS338-1
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin	Sigma-Alderich	217492
Acetylthiocholine iodide	Sigma-Alderich	1480
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel)	Sigma-Alderich	C2888
BODIPY FL L-Cystine	Invitrogen	B-20340
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit	Invitrogen	P33706
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution	Sigma-Alderich	A6559
MAP Kinase 2 (MAPK2)	EMD Millipore	454850
p38α/SAPK2a (T106M), active	EMD Millipore	14-687M
Epidermal growth factor (EGFR)	EMD Millipore		Donated by Millipore
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β)	EMD Millipore	14-306
Myelin basic protein (MBP)	EMD Millipore		Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore
GSM	EMD Millipore	12-533	Substrate for GSK-3β
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y)	EMD Millipore	12-440	Substrate for EGFR
Stealth pin	ArrayIt	SMP3
Stealth pin	ArrayIt	SMP7
Amine coated slides	ArrayIt	SMM2
Aldehyde coated slides	ArrayIt	SMA2
Exposy coated slides	ArrayIt	SME2
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides	Exakt Technologies Inc.	41500
0.2-μm syringe filter	PALL Life Sciences	4612
			Equipment
Virtek Contact Printer	BioRad
Novaray Fluorescence Slide Imager	Alpha Innotech Corporation
Desktop microarray centrifuge	ArrayIt	MHC110V
MilliQ Synthesis A10	Millipore		Used to filter all water required for experiments