Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Snel Micro-iontoforese van glutamaat en GABA: een nuttig instrument om Synaptic Integratie Onderzoek

19.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/50701

⸱

31 juli 2013

 , 
1NRW Research Group 'Dendritic integration in the CNS', Department of Epileptology, University of Bonn, 2Neuronal Networks Group, Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen e.V. (DZNE)

In dit artikel

Samenvatting

In dit artikel zullen we snel micro-iontoforese van neurotransmitters als een techniek om de integratie van postsynaptische signalen met een hoge ruimtelijke en temporele precisie onderzoeken.

Samenvatting

Een fundamenteel belang in neurologie is de integratie van prikkelende en remmende inputs langs het complexe structuur van de dendritische structuur, die uiteindelijk leidt tot neuronale productie van actiepotentialen in de axon begrijpen. De invloed van verschillende ruimtelijke en temporele parameters van specifieke synaptische invoer op neuronale uitgang wordt momenteel onderzocht, bijvoorbeeld de afstand verzwakking van dendritische inputs, de locatie-afhankelijke interactie van ruimtelijk gescheiden ingangen, de invloed van GABAergig remming van prikkelende integratie lineaire en niet-lineaire integratiemodi, en veel meer.

Met snelle micro-iontoforese van glutamaat en GABA is het mogelijk om de ruimtelijke en temporele integratie van glutamaat en GABA-erge remming excitatie nauwkeurig onderzoeken. Kritische technische eisen zijn ofwel een triggered fluorescentielamp, light-emitting diode (LED), of een twee-foton scanning microscoop om dendritische takken visualiseren zonder de invoering van belangrijke foto-beschadiging van het weefsel. Voorts is het zeer belangrijk om een ​​micro-iontoforese versterker die zorgt voor een snelle capaciteit compensatie hoge weerstand pipetten. Een ander belangrijk punt is dat er geen zender onvrijwillig wordt vrijgegeven door de pipet tijdens het experiment.

Eenmaal ingesteld, zal deze techniek betrouwbare en reproduceerbare signalen met een hoge neurotransmitter en locatie specificiteit. Vergeleken met glutamaat en GABA uncaging, snel iontoforese kan met beide zenders tegelijk maar bij zeer lange afstanden zonder beperking van het gezichtsveld. Er zijn ook voordelen tegenover focale elektrische stimulatie van axonen: met micro-iontoforese de plaats van de input site is precies bekend en het is zeker dat alleen de neurotransmitter plaats wordt losgelaten. Nochtans moet dat alleen het micro-iontoforese worden beschouwdpostsynapse wordt geactiveerd en presynaptische aspecten van neurotransmitters zijn niet opgelost. In dit artikel laten we zien hoe het opzetten van micro-iontoforese in de hersenen slice experimenten.

Inleiding

Neuronen in het centrale zenuwstelsel ontvangt verschillende synaptische inputs op hun dunne vertakte dendritische uitlopers 1. Daar de meerderheid van de exciterende dendritische ingangen worden gemedieerd door glutamaat synapsen. Deze synapsen kan worden geactiveerd in een ruimtelijk verdeelde manier, wat resulteert in postsynaptische lineaire integratie van excitatoire postsynaptische potentialen (EPSPS). Als de synapsen gelijktijdig en in ruimtelijke nabijheid op de dendriet zijn geactiveerd, kunnen deze prikkelende input supra-lineair worden geïntegreerd en het genereren van dendritische spikes 2-5.

Bovendien is de integratie van excitatoire ingangen afhankelijk van de locatie van de ingang van de dendritische structuur. Signalen die aankomen op de distale tuft regio zijn veel meer verzwakt dan proximale ingangen vanwege kabel filtering 6. In de hippocampus, zijn verre input voor de apicale dendrieten plukje gegenereerd door een ander hersengebied dan die op proximale dendrites 7. Een interessante vraag is daarom wordt hoe synaptische ingang verwerkt dendritische verschillende compartimenten en als dendritische integratie regelt de invloed van deze gelaagde ingangen neuronale op verschillende manieren.

Niet alleen de functionele eigenschappen, morfologische kenmerken van de dendriet, de plaats en clustering van de ingangen die de dendritische integratie van prikkelende inputs, ook extra remmende inputs van GABAerge terminals cruciaal bepalen de doeltreffendheid van de glutamaat synapsen 8,9. Deze verschillende aspecten van synaptische integratie kan ideaal worden onderzocht met behulp neurotransmitter micro-iontoforese, die ruimtelijk gedefinieerde toepassing van verschillende neurotransmitters kunnen dendritische domeinen. We zien hier hoe de micro-iontoforese van glutamaat en GABA succes vast te signaalintegratie onderzoeken in neuronen.

Voor deze toepassing, fijne punthoge weerstand pipetten gevuld met geconcentreerde neurotransmitter oplossingen worden gebruikt. Deze pipetten dichtbij de buitenste membraan van de cel, waarbij de neurotransmitter receptoren zich bevinden geplaatst. Een goede visualisatie van de dendritische takken vereist. Dit wordt het beste bereikt met fluorescerende kleurstoffen die worden ingevoerd via de patch pipet. Vervolgens een zeer korte (<1 msec) stroompuls (in het bereik van 10-100 nA) wordt gebruikt om de geladen neurotransmittermoleculen werpen. Met deze korte pulsen en de effectieve capaciteit compensatie kunnen postsynaptische potentialen en stromen worden opgewekt met een hoge temporele en ruimtelijke nauwkeurigheid, waardoor de plaats van de exciterende ingang precies bekend. Glutamaat micro-iontoforese kan synapsen activeren in een bepaalde straal, die kleiner is dan 6 micrometer zoals hier getoond (Figuur 1 9), maar het is ook mogelijk om enkele oplossing synaps 10-12 bereiken.

Heine, M., et al. bleek dat de ruimtelijke resolutie van fast micro-iontoforese ook kan worden ingesteld om de grootte onder 0,5 urn, die kleiner is dan spotgroottes regelmatig bereikt met twee-foton uncaging glutamaat 13 zien. Met snelle micro-iontoforese is het eenvoudig mogelijk om twee of meer iontoforetische pipetten gebruiken en plaats ze op verschillende, zelfs verre vlekken op de dendritische structuur. Op deze wijze kan de integratie van prikkelende gebeurtenissen, met inbegrip van verschillende paden worden onderzocht. Het is ook mogelijk om een ​​glutamaat en GABA gevulde pipet iontoforetische tegelijkertijd gebruikt. Op deze manier wordt de werking van GABA-erge remming op verschillende locaties ten opzichte van de prikkelende ingang (on-pad, off-path remming) kan worden onderzocht. Ook het effect van remming door interneuronen richten op specifieke neuronale domeinen, zoals distale dendrieten, axonen soma of 14, te onderzoeken met behulp GABA iontoforese. In gekweekte neuronen, fast micro-iontoforese biedt de mogelijkheid om INVEstigate enkele synaps distributie en de elementaire aspecten van synaptische communicatie in neuronen in veel meer detail 10,11.

In dit artikel laten we zien in detail hoe glutamaat en GABA iontoforese voor het gebruik bij acute hersenen plakjes, die het mogelijk maakt te onderzoeken synaptische integratie van prikkelende en remmende input in afhankelijkheid van invoer plaats, ingang sterke punten, en de timing, alleen of in samenspel vestigen. We zullen wijzen op de voordelen en beperkingen van deze techniek en hoe succesvol oplossen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Systeemvereisten

  1. Microscoopsysteem: Goede visualisatie van de dendriet is cruciaal. Indien beschikbaar, gebruik maken van een twee-foton laser scanning microscoop systeem. In onze experimenten gebruikten we een TRIM Scope II, LaVision Biotec, Bielefeld, Duitsland of een Ultima IV systeem Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin voorzien van een Ti: saffier ultrasnelle gepulste laser (Chameleon Ultra II, Coherent) en hoge NA doelstelling (60X, 0.9 NA, Olympus) naar de dendrieten, die we hadden gevuld met een fluorescerende kleurstof via de patch pipet visualiseren. Hoewel foto-schade wordt beschouwd minder ernstig met 2-foton scannen, verminderen laservermogen (hierna 8 mW op weefsel) en verblijftijden (minder dan 1 usec) of zoveel mogelijk.
  2. Een tweede mogelijkheid is om een ​​wide-field fluorescentie lichtbron (LED of een fluorescentielamp) synchroon triggeren met acquisitie om de blootstelling te verminderen zoveel mogelijk. We hebben gebruik gemaakt van een monochromator met een geïntegreerde lichtbron (TILLPhotonics, Gräfelfing, Duitsland) op een Zeiss Axioskop 2 FS rechtopstaande microscoop, die was uitgerust met Dodt-contrast infrarood verlichting (TILLPhotonics, Gräfelfing, Duitsland). In onze experimenten blootstellingstijden varieerde meestal van 10 msec tot max.. 30 msec.
  3. Gebruik een snelle micro-iontoforese versterker, bijvoorbeeld een twee-kanaals micro-iontoforese systeem MVCs-C-02 (NPI elektronisch, Tamm, Duitsland) met snelle capacitieve compensatie. De fijne punt iontoforese micro-elektroden moeten weerstanden van 25-100 MQ (cruciaal afhankelijk van de punt grootte en de pipet vorm), en de snelle opkomst tijden kan alleen worden bereikt als de capacitieve compensatie van de iontoforese versterker optimaal is afgestemd. Deze snelle compensatie is nodig om de huidige pulsen toe te passen met een korte en snelle aanvang in de sub-milliseconden aan de iontophoretic pipet en aldus de zender met een hoge ruimtelijke resolutie in spotgroottes onder de 1 micrometer 13 uit te werpen. Iontoforese versterkers zijn aldus verkrijgbaar bij diverse andere bedrijven, die wij niet in ons laboratorium hebben getest. Deze apparaten zijn naar ons weten niet met capaciteit compensatieschakelingen.

2. Bereid Solutions

  1. Bereid kunstmatige cerebrospinale vloeistof (ACSF) en interne oplossing is vereist voor proefopzet. De enige toevoeging aan de interne oplossing die nodig is een rode of groene fluorescente kleurstof (bijvoorbeeld 50 tot 200 uM Alexa Fluor 488 of 594 hydrazide, Invitrogen), afhankelijk van de optische uitrusting. Hier een voorbeeld ACSF sucrose die gebruikt kunnen worden voor dissectie, in mM: NaCl 60, ​​100 sucrose, 2,5 KCl, 1,25 NaH 2PO 4, 26 NaHCO3 1 CaCl2, 5 MgCl2, 20 glucose, en normale ACSF oplossing voor patch-clamp experimenten in mM: 125 NaCl, 3 KCl, 1,25 NaH 2PO 4, 26 NaHCO3, 2,6 CaCl2, 1,3 MgCl2, 15 glucose.
  2. Carbogenize (95% O 2, 5% CO 2) alle extracellulaire oplossingen continu.
  3. Bereid interne oplossing, bijvoorbeeld in mM: 140 K-gluconaat, 7 KCl, 5 HEPES-zuur, 0,5 MgCl2, 5 Phosphocreatine, 0,16 EGTA, met 50-200 uM Alexa 488.
  4. Voor glutamaat micro-iontoforese wordt een oplossing met 150 mM glutaminezuur en de pH op 7,0 met NaOH. Voeg 50 -200 uM Alexa Fluor 488 of 594 hydrazide (Invitrogen) voor visualisatie.
  5. Bij iontoforese van GABA bereiden een 1 M oplossing GABA en de pH op 5 met HCl 15. Bij deze pH GABA betaalt alleen dan kan worden aangebracht met iontoforese. Let op: de lage pH in de oplossing uitgeworpen naar de extracellulaire ruimte zou GABA transmissie zelf 16,17 bewerkstelligen.
    Bescherm de GABA-oplossing tegen licht en vaak te bereiden verse GABA voorraad oplossing, aangezien oudere oplossing kan zijn effectiviteit verliezen.
  6. Als het moeilijk is om GABAergic gebeurtenissen, een hi ziegh Cl - drijvende kracht interne oplossing, bijvoorbeeld door het weglaten van KCl, zou kunnen helpen om te visualiseren de GABA-erge gebeurtenissen om te zien of de GABA iontoforese werkt, maar om synaptische integratie onderzoeken een fysiologische drijvende kracht zou kunnen worden aanbevolen. Voor algemene detectie van kleine GABAergic gebeurtenissen, kan een protocol weergegeven in figuur 8C helpen.

3. Trek en Test de Iontoforese pipetten

  1. In het algemeen, het trekken van de juiste pipetten is misschien wel de meest cruciale stap om gecontroleerde neurotransmitter iontoforese bereiken. Bij het ​​gebruik van iontoforese in celkweek, is het mogelijk om zeer fijne elektroden vergelijkbaar met scherpe micro-elektroden 10 trekken. In patch-clamp experimenten acute segmenten zijn deze zeer dunne pipetten buigen op de slice oppervlak wanneer ze worden neergelaten in het weefsel met een hoek, waardoor het onmogelijk dieper dendrieten bereiken.
  2. Daarom trek een pipet met een heel klein puntje, zodat er geen neurotransmitter kan lekken, maar de punt moet toch stijf genoeg te dringen in het weefsel (Figuur 2). Gebruik bijvoorbeeld 150 GB F 8P klasse pipetten (Science Products, Hofheim, Duitsland) en een horizontale trekker (bijvoorbeeld een DMZ-Universal Puller, Zeitz-Instruments GmbH, Martinsried, Duitsland, of een P-97 Puller, Sutter Instrument Company , Novato, CA) met een aantal trekken stappen om een kleine opening, maar ook een korte aantikker bereiken met een steile hoek (figuur 2 en tabel 2).
  3. Het is ook mogelijk om kwartsglas pipetten om iontoforetische pipetten trekken 10. Deze worden verondersteld om betere mechanische eigenschappen hebben en meer betrouwbaar te zijn, maar speciale laser pullers zijn vereist. Maar het is ook mogelijk om goede resultaten bij glazen pipetten, die gewoonlijk worden gebruikt voor het trekken patch pipetten bereiken.
  4. Test de pipet prestaties en weerstand in een kamer zonder weefsel, alvorens ze voor de eerstetijd, aangezien lekkage van glutamaat kunnen schaden het weefsel.
  5. Stel de iontoforese versterker correct. Vul dan de pipet met de neurotransmitter en kleurstof bevattende oplossing en plaats deze in het bad (ACSF).
  6. Compenseer de capaciteit (figuur 3). Meestal zeer scherpe pipetten zal een hogere capaciteit dan de botte degenen.
  7. De weerstand van de pipet: De micro-iontoforese versterker hier gebruikt heeft een ingebouwde functie voor het meten van de pipet weerstand. Het roept korte rechthoekige testpulssignalen, die kunnen worden gecontroleerd met een standaard oscilloscoop of een A / D-board aangesloten op een computer met acquisitie software. Afhankelijk van de vorm en de tip grootte, moet de tip van een weerstand tussen 25 hebben - 90 MQ.
  8. Focus op het puntje met een 60X of 40X water immersie objectief en overschakelen naar fluorescerende beeldvorming en zo mogelijk vergroten Als fluorescerende kleurstof lekt uit de pipet tip, breng een kleine positieve (in het geval van gluTamate) of negatief (bij GABA, figuur 4) behouden stroom (<0,02 uA). Als dat niet helpt om de lekkage te annuleren, veranderen de pipet.
  9. Breng een sterke stap stroom of gebruik de handmatige trekker en bewaken van de tip in de fluorescerende afbeelding om te zien of de oplossing kan worden uitgeworpen uit de pipet. Zoals hierboven vermeld, wordt de polariteit van de stroompuls afhankelijk van de lading van het molecuul dat wordt verondersteld te worden uitgeworpen. Uitwerpen glutamaat is een negatieve stroom en GABA een positieve stroom (figuur 4).
  10. Luchtbellen in de pipet dat blok uitwerpen van kleurstof en zender, kunnen worden gewist door het toepassen van een hoge uitwerpen stroom meerdere keren.
  11. Samen genomen, indien er geen zichtbare lekkage beproevingsgegevens uitwerpen geslaagd, compenseren de capaciteit en start het experiment.
  12. Opgelet: Aangezien capaciteit compensatie wordt bereikt door een terugkoppeling, deze schakeling kan doorschieten of oscilleren als het overcompensated. Voorzichtig Gebruik de instelknop voor capacitieve compensatie.
  13. Afhankelijk van de trekker stabiliteit is het soms noodzakelijk de trekker instellingen van tijd tot tijd aan te passen, aangezien de gloeidraad eigenschappen hebben veranderd. Indien eenmaal een goede pipet is ontworpen, kan worden gebruikt voor meerdere dagen. Daarom, na afloop van de proef slaan de iontoforese pipet in een gesloten container zonder beschadiging van de tip.
  14. Voor het volgende experiment vul de pipet met de neurotransmitter oplossing, gelden een aantal sterke eject pulsen naar de punt te wissen en dan controleren of de eigenschappen (bv. weerstand) veranderen aanzienlijk. Alsdan de capaciteit en weer gebruik maken van de pipet. Gebruik geen enkele pipet met verschillende neurotransmitter oplossingen.

4. Bereid de Brain Slices

  1. Als micro-iontoforese wordt gebruikt voor de eerste keer zeker de schijfjes te bereiden na de oprichting van een betrouwbaar werkende trekker programma.
  2. Perform anesthesie en onthoofding procedures in overeenstemming met het dier richtlijnen verzorging van uw instelling of plaatselijke instantie.
  3. Na het verwijderen van de hersenen, overbrengen naar ijskoude ACSF sucrose (zie Protocol 2.1).
  4. Snijd het interessegebied in plakken van geschikte dikte (bijvoorbeeld 300 um).
  5. Incubeer de segmenten in ACSF saccharose bij 35 ° C gedurende 30 minuten. Vervolgens overbrengen naar een ondergedompelde deelneming kamer die normaal ACSF bij kamertemperatuur.
  6. Gedurende de voorbereiding en experiment carbogenize de ACSF rond de schijfjes met 95% O 2, 5% CO 2.

5. Instelling van een Whole-cell opname

  1. Plaats de iontoforese pipet (s) al in de buurt van de slice oppervlak voordat het patchen van een cel, om langdurige plaatsing te vermijden, na vaststelling van de whole-cell-modus.
  2. Trek een lage weerstand patch pipet (3 - 5 mQ), vul het met de dgij met interne oplossing en toepassing positieve druk op de pipet (30 - 60 mbar).
  3. Voer het bad en de aanpak van de cel onder visuele begeleiding (infrarood Dodt contrast of twee afbeelding foton gradiënt contrast).
  4. Toezicht op de pipet weerstand met een test puls (bijv. -10 mV, 20 msec) in voltage clamp-modus. Bij het aanraken van het weefsel te corrigeren de offset potentieel.
  5. Benader de cel en duw de pipet tip in het tot een 'kuiltje' is duidelijk te zien. De druk van de pipet onmiddellijk vrij toepassen 40-60 mbar onderdruk en schakel de membraanpotentiaal op -65 mV.
  6. Wanneer de holding huidige waarden onder 100 pA bereikt, laat de negatieve druk.
  7. Na invoering van een giga afdichting (weerstand> 1 GQ), breuk van het membraan met een korte, sterke zuigkracht van de pipet of korte overcompensatie van de capacitieve compensatie circuit.
  8. Afhankelijk van de modus (spanning of stroom klem) is vereistvoor de experimentele opzet, compenseren adequaat.
  9. Start om de iontoforese pipet op zijn definitieve plaats te brengen. Als een meer gedetailleerde beschrijving van hoe u succesvol patch clamp opnamen uit te voeren nodig is, zijn er verschillende uitstekende richtlijnen beschikbaar 18,19.

6. Plaats de Iontoforetische pipet en het genereren van een Postsynaptische Iontoforetische Potential

  1. In het algemeen kan iontoforetische gebeurtenissen worden opgeroepen op bepaalde locaties, afhankelijk van de gewenste experiment, bijvoorbeeld bij een stekelige dendriet voor glutamaat micro-iontoforese, op dendritische as, soma of axon eerste segment GABA micro-iontoforese.
  2. Benader de cel tot ongeveer 1 micrometer afstand zonder het aan te raken. Na het bereiken van het punt van belang is het cruciaal dat er geen neurotransmitter lekt en dat de pipet capaciteit wordt correct gecompenseerd.
  3. Als het naderen van de cel met een glutamaat gevulde iontoforetisch pipette veroorzaakt detecteerbare depolarisatie van de membraanpotentiaal, passen de huidige te behouden, indien mogelijk, of verander de pipet.
  4. Solliciteer korte negatieve stroom pulsen, te beginnen vanaf nul en verhoging van het huidige systematisch (bv. 0,1-0,4 msec, 0,01-1 uA pulsen). Dit helpt om uit te vinden in welke range de iontoforese huidige roept de gewenste reacties in de specifieke experimentele set-up.
  5. Als er geen reactie waarneembaar, til de pipet enkele honderden micrometers en breng een sterke eject stroom (> 0,1 uA) aan de punt te reinigen. Pas de capacitieve compensatie, benaderen de cel, en probeer het opnieuw.
  6. Als er nog steeds geen reactie, het verminderen van de huidige te behouden. Wees zeer voorzichtig met de instellingen wijzerplaat omdat deze procedure kan ongecontroleerd neurotransmitters veroorzaken. Daarom voortdurend de opname te onderscheiden veranderingen te detecteren in de membraanpotentiaal.
  7. Als het moeilijk is om GABAergic gebeurtenissen te detecteren, kan het nuttig zijn om een ​​te gebruikenn interne oplossing samenstelling waardoor in een hoge Cl - drijvende kracht. Om dit te bereiken, verkleinen de Cl - concentratie in de pipet oplossing (zie protocol paragraaf 2.6.). Dit resulteert in grotere GABAerge gebeurtenissen in rust membraanpotentiaal door de hogere drijvende kracht.
  8. Als alternatief injecteren lang lopende stappen resulteert in membraanpotentiaal kansen van -100 mV tot -48 mV (Figuur 8C). Met dit protocol de Cl - drijvende kracht is verhoogd bij hyperpolarized potentials waardoor een depolariserende GABA reactie.
  9. Het is ook mogelijk om de stap stroominjectie-protocol om de omkering potentieel van de opgewekte gebeurtenissen, die helpt bij het GABAerge aard van de gebeurtenissen bepalen bepalen. Lekkage van GABA is moeilijker te detecteren dan lekkage van glutamaat. In dit geval kan een constante controle van de ingangsweerstand helpen bij het GABA gevulde pipet wordt benaderd. Als de input weerstand afneemt, het behouden huidige kan be verhoogd of een ander pipet worden gebruikt.
  10. Als controle-experimenten voor glutamaat iontoforese, raden we een Ca 2 + imaging experiment, met behulp van 200 uM OGB-1 en geen EGTA in de pipet oplossing voor lokale calciuminstroom visualiseren die kunnen worden veroorzaakt door lekkende glutamaat.
  11. In het algemeen een stabiele respons is zeer belangrijk om een ​​mechanisch stabiele pipet drift in de tijd te vermijden. Drift kan worden veroorzaakt door veranderingen in temperatuur, dan is het raadzaam om de computer inschakelt tenminste een half uur voor de meting van thermische drift te voorkomen. Zorg ervoor dat u goede cartridge seals gebruiken in de pipet houder en de tip is echt vast. De houder zelf kan bovendien worden vastgezet met teflon tape, bovendien, er zeker van zijn dat er geen spanning op de kabels van de headstage of manipulator, die ook een potentiële bron van drift.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een eenvoudige benadering van de ruimtelijke spreiding van iontoforese te bepalen is om de iontoforese pipet stapsgewijs uit de dendriet trekken, terwijl de uitgeworpen glutamaat constant. We vonden dat de ruimtelijke omvang van een micro-iontoforetische stimulatie had een diameter van ongeveer 12 urn (figuur 1 dat radius). Hoe diep in het weefsel de iontoforese kan worden gebruikt afhankelijk van de stijfheid van de pipet. De iontoforetische pipetten nodig voor experimenten in plakken (figuur 2...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hier leggen we uit hoe u snel micro-iontoforese van neurotransmitters toepassing op synaptische integratie te onderzoeken op de dendrieten. Deze techniek is met succes gebruikt voor Glu en GABA-erge synaptische transmissie onderzocht in verschillende hersengebieden in vitro en in vivo 9,20-22. Micro-iontoforese wordt al meer dan 60 jaar, maar in de vroege jaren werd meestal gebruikt om lokaal neurotransmitters en geneesmiddelen op langzame of tussenproducten tijdschema 23 of micro...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Wij danken Hans Reiner Polder, Martin Fuhrmann en Walker Jackson voor het zorgvuldig lezen van het manuscript. De auteurs ontvingen financiering die werd verstrekt door het ministerie van onderzoek MIWF van de staat Noordrijn-Westfalen (SR), de BMBF-Projekträger DLR US-Duitse samenwerking in computational neuroscience (CRCNS, SR), Centers of Excellence in neurodegeneratieve ziekten (COEN; SR), en de Universiteit van Bonn intramurale programmafinanciering (BONFOR; SR).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
 Materiaal
Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), en Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin)LaVision Biotec, Bielefeld, Duitsland 
Two-photon laser scanning microscope Ultima IVPrairie Technologies, Middleton, Wisconsin, VS 
Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laserChameleon Ultra II, Coherent 
60X Objectief, NA 0.9Olympus 
Zeiss Axioskop 2 FS rechtopstaand microscoopTILLPhotonics, Gräfelfing, Duitsland 
MonochromatorTILLPhotonics, Gräfelfing, Duitsland 
Micro-iontoforese systeem MVCS-02NPI Electronics, Tamm, Duitsland 
Sutter puller P-97Sutter Instrument Company, Novato, CA 
Glasfilamenten (150 GB F 8P)Science Products, Hofheim, Duitsland 
 Reagens
Alexa Fluor 488 hydrazideMolecular Probes life technologiesA-10436 
Alexa Fluor 594Molecular Probes life technologiesA-10438 
NaClSigma AldrichS7653 
KClSigma AldrichP9333 
NaH2PO4Sigma AldrichS8282 
NaHCO3Sigma AldrichS6297 
SucroseSigma AldrichS7903 
CaCl2Sigma AldrichC5080 
MgCl2Sigma AldrichM2670 
GlucoseSigma AldrichG7528 
K-GluconateSigma AldrichG4500 
HEPES-zuurSigma AldrichH4034 
FosfocreatineSigma AldrichP7936 
EGTASigma AldrichE3889 
GlutaminzuurSigma AldrichG8415 
GABASigma AldrichA5835 
NaOHMerck1.09137.1000 
HClMerck1.09108.1000 

Referenties

  1. Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells. Neuroscience. 102, 527-540 (2001).
  2. Gasparini, S., Migliore, M., Magee, J. C. On the initiation and propagation of dendritic spikes in CA1 pyramidal neurons. J. Neurosci. 24, 11046-11056 (2004).
  3. Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50, 291-307 (2006).
  4. Remy, S., Csicsvari, J., Beck, H. Activity-dependent control of neuronal output by local and global dendritic spike attenuation. Neuron. 61, 906-916 (2009).
  5. Stuart, G., Schiller, J., Sakmann, B. Action potential initiation and propagation in rat neocortical pyramidal neurons. J. Physiol. 505 (Pt. 3), 617-632 (1997).
  6. Magee, J. C. Dendritic integration of excitatory synaptic input. Nat. Rev. Neurosci. 1, 181-190 (2000).
  7. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31, 571-591 (1989).
  8. Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16, 815-823 (1996).
  9. Muller, C., Beck, H., Coulter, D., Remy, S. Inhibitory control of linear and supralinear dendritic excitation in CA1 pyramidal neurons. Neuron. 75, 851-864 (2012).
  10. Murnick, J. G., Dube, G., Krupa, B., Liu, G. High-resolution iontophoresis for single-synapse stimulation. J. Neurosci. Methods. 116, 65-75 (2002).
  11. Liu, G., Choi, S., Tsien, R. W. Variability of neurotransmitter concentration and nonsaturation of postsynaptic AMPA receptors at synapses in hippocampal cultures and slices. Neuron. 22, 395-409 (1999).
  12. Renger, J. J., Egles, C., Liu, G. A developmental switch in neurotransmitter flux enhances synaptic efficacy by affecting AMPA receptor activation. Neuron. 29, (2001).
  13. Heine, M., et al. Surface mobility of postsynaptic AMPARs tunes synaptic transmission. Science. 320, 201-205 (2008).
  14. Somogyi, P., Klausberger, T. Defined types of cortical interneurone structure space and spike timing in the hippocampus. J. Physiol. 562, 9-26 (2005).
  15. Pugh, J. R., Jahr, C. E. Axonal GABAA receptors increase cerebellar granule cell excitability and synaptic activity. J. Neurosci. 31, 565-574 (2011).
  16. Mozrzymas, J. W., Zarnowska, E. D., Pytel, M., Mercik, K. Modulation of GABA(A) receptors by hydrogen ions reveals synaptic GABA transient and a crucial role of the desensitization process. J. Neurosci. 23, 7981-7992 (2003).
  17. Pasternack, M., Smirnov, S., Kaila, K. Proton modulation of functionally distinct GABAA receptors in acutely isolated pyramidal neurons of rat hippocampus. Neuropharmacology. 35, 1279-1288 (1996).
  18. Single-Channel Recording. , Springer. (2009).
  19. Davie, J. T., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nat. Protoc. 1, 1235-1247 (2006).
  20. Major, G., Polsky, A., Denk, W., Schiller, J., Tank, D. W. Spatiotemporally graded NMDA spike/plateau potentials in basal dendrites of neocortical pyramidal neurons. J. Neurophysiol. 99, 2584-2601 (2008).
  21. Rose, G. J. Combining pharmacology and whole-cell patch recording from CNS neurons, in vivo. J. Neurosci Methods. , (2012).
  22. Behrends, J. C., Lambert, J. C., Jensen, K. Repetitive activation of postsynaptic GABA(A )receptors by rapid, focal agonist application onto intact rat striatal neurones in vitro. Pflugers Arch. 443, 707-712 (2002).
  23. Hahnel, C. Practical Electrophysiological methods. Kettenmann, H., Grantyn, R. , Wiley-Liss. (1992).
  24. Wetzel, C. H., et al. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. J. Neurosci. 19, 7426-7433 (1999).
  25. Cash, S., Yuste, R. Linear summation of excitatory inputs by CA1 pyramidal neurons. Neuron. 22, 383-394 (1999).
  26. Eccles, J. C., Jaeger, J. C. The relationship between the mode of operation and the dimensions of the junctional regions at synapses and motor end-organs. Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 148, 38-56 (1958).
  27. Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474, 100-104 (2011).
  28. Fino, E., et al. RuBi-Glutamate: Two-Photon and Visible-Light Photoactivation of Neurons and Dendritic spines. Front Neural Circuits. 3, 2(2009).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

GlutamaattoedieningGABA-toedieningdendritische boomwhole-cell configuratiecapaciteitscompensatiepipetweerstandfluorescentie-imaginghersensectie
Snel Micro-iontoforese van glutamaat en GABA: een nuttig instrument om Synaptic Integratie Onderzoek
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.